Abstract
Determinar el modo de acción de los productos químicos bioactivos es de interés para una amplia gama de académico, farmacéutico, y los científicos industriales. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura en ciernes, es un modelo eucariota para la que una colección completa de ~ 6000 mutantes de deleción de gen y gen esencial hypomorphic mutantes están disponibles comercialmente. Estas colecciones de mutantes se pueden utilizar para detectar sistemáticamente la interacción química de genes, es decir, genes necesarios para tolerar una sustancia química. Esta información, a su vez, informa sobre el modo probable de acción del compuesto. Aquí se describe un protocolo para la identificación rápida de las interacciones químicas genética de la levadura en ciernes. Demostramos el método que utiliza el agente quimioterapéutico 5-fluorouracilo (5-FU), que tiene un mecanismo bien definido de acción. Nuestros resultados muestran que la TRAMP nuclear RNA se necesitan enzimas de exosoma y de reparación del ADN para la proliferación en presencia de 5-FU, que es coherente con m anterioricroarray enfoques basados de códigos de barras químicos genéticos y de los conocimientos que el 5-FU afecta negativamente tanto el metabolismo de ARN y ADN. También se describen los protocolos de validación solicitada de estas pantallas de alto rendimiento.
Introduction
Las herramientas genéticas y los recursos disponibles en el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae han permitido a gran escala estudios de genómica funcional que proporcionan colectivamente una nueva visión de cómo los genes funcionan como redes para cumplir con los requisitos de los sistemas biológicos. La piedra angular de estas herramientas fue la creación en colaboración de un conjunto completo de no esenciales supresiones de genes de todos los marcos de lectura abierta en la levadura 1,2. Una observación sorprendente fue que sólo ~ 20% de los genes de levadura se requiere para la viabilidad cuando se cultiva como haploides en condiciones estándar de laboratorio. Esto pone de relieve la capacidad de una célula para amortiguar contra perturbaciones genómico a través de la utilización de las vías biológicas alternativas. Mutantes genéticos que sean viables individualmente, pero letal en combinación, señalan caminos biológicos paralelos conectados o convergentes y forman redes de interacción genéticos que describen la función biológica. Con el desarrollo de te condicionalalelos mperatura sensibles y hypomorphic de genes esenciales de la tecnología no se ha limitado al estudio de los genes no esenciales 3,4. Este concepto ha sido aplicado en una escala genómica producir un imparcial mapa interacción genética que ilustra cómo los genes implicados en los procesos celulares similares se agrupan 5.
Perturbaciones químicas de redes genéticas imitan supresiones de genes (Figura 1) 6. Consulta de compuestos inhibidores del crecimiento contra un array de alta densidad de cepas de deleción para la hipersensibilidad identifica un perfil de interacción química y genética, es decir, una lista de genes que se requiere para tolerar el estrés químico. Al igual que las interacciones genéticas, pantallas de gran escala de las bibliotecas químicas han demostrado que los compuestos con un modo similar de racimo acción juntos 7. Por lo tanto, mediante el establecimiento del perfil de interacción química y genética de un compuesto el modo de acción se puede deducir mediante la comparación con LARinteracción genética genética y química sintética ge-escala datasets 8,9.
Pantallas de química y genética a gran escala, donde son interrogados decenas de compuestos, se han realizado ensayos de competición por código de barras. En este enfoque, la colección agrupada de las cepas de deleción se cultiva en masa durante varias generaciones en un pequeño volumen de medio que contiene una sustancia química. Dado que cada mutante de deleción alberga un código de barras genético único, la viabilidad / crecimiento de mutantes individuales dentro de la piscina de supresión cepas se realiza un seguimiento de microarrays o de alto rendimiento de secuenciación 10.
Inferir la aptitud mediante el control de tamaño de las colonias de mutantes físicamente dispuestos cultivadas en agar sólido que contiene un compuesto bioactivo es también un método eficaz para identificar las interacciones química y genética 11,12. Este enfoque proporciona una alternativa rentable a la selección basada en la competencia y es muy adecuado para el ensayo de las pequeñas bibliotecas de productos químicos.Esbozado aquí es una metodología sencilla para producir una lista de interacciones químicas genética en S. cerevisiae que no se basa en la manipulación molecular o la infraestructura de biología. Se requiere sólo una colección deleción de levadura, un aparato de colocación de clavos robótico o manual, y el software de análisis de imagen disponible libremente.
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Protocol
NOTA: El flujo de trabajo general de este procedimiento se describe en la Figura 2.
1. Determinación de la dosis inhibidora del crecimiento
- Preparación de la levadura cultivo durante la noche
NOTA: Los medios de crecimiento de la levadura-extracto-peptona-dextrosa (YEPD) utilizado en este protocolo es una receta estándar 13.- Streak a las células en una placa de agar YEPD BY4741 (Mata his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) y se incuba durante 48 horas a 30 ° C o hasta que se formen colonias visibles.
- Preparar cultivos de una noche mediante la inoculación de 5 ml de medio líquido YEPD en un recipiente de cultivo estéril con una sola colonia. Incubar durante la noche a 30 ° C con rotación continua o agitación. La cultura se suele llegar a la saturación por la mañana (~ 2 × 10 8 células / ml).
- Preparación de medios de agar sólido que contiene dosis químicas diferentes
- Prepare varias poblaciones deel producto químico a ensayar en 100x concentración final deseada en un disolvente apropiado.
NOTA: Las concentraciones eficaces dependerán de la química, y deben ser determinado empíricamente. Por tanto, es aconsejable probar inicialmente un amplio rango de concentración final; es decir, de baja M a alta mM. - Para cada concentración de producto químico a ensayar, alícuota de 3 ml de agar YEPD fundida a un tubo de cultivo estéril varios. Lugar en el 55 ° C baño de agua para mantener la solidificación.
- Para cada concentración de producto químico a ensayar añadir 30 l de compuesto 100x a los medios fundidos, vórtice 2-3 segundos para mezclar, y pipeta de 1 ml en cada par de pocillos duplicados en una placa de 12 pocillos. Asegúrese de incluir un vehículo único control. Permitir a las placas reposar durante la noche a temperatura ambiente. Deseche cualquier medio extra.
- Prepare varias poblaciones deel producto químico a ensayar en 100x concentración final deseada en un disolvente apropiado.
- Células Spread chapado
- Inocular 10 ml de medio líquido YEPD con 2 l de un cultivo de levadura saturado, cultivadas durante la noche como en el paso 1.1.2.
- Placa de 25 l de cultivo de levadura diluida por pocillo, distribuidos uniformemente usando perlas de vidrio estériles o varilla, y permiten que la placa se seque bajo una llama. Incubar la placa a 30 ° C durante 48 horas.
- Evaluar el crecimiento de la levadura (tanto en número total y el tamaño de las colonias) en las placas. Seleccione una concentración subletal de compuesto que no inhibe el crecimiento en más de un 10% -15% para realizar la pantalla.
2. Sistemática Pantalla Química Genética
- Mantenimiento de eliminación-mutante-array (DMA) y Preparación de Fuente Plate
- Para una descripción detallada de la construcción de matrices de mutantes de deleción de las existencias de glicerol consulte Baryshnikova et al. 14. Una vez mutantes de deleción han sido dispuestos a una densidad de 384 colonias por placa, la DMA se puede almacenar durante varios meses a 4 ° C. Replicar en agar YEPD que contiene 200 mg / ml de G418 si es necesario para prevenir el crecimiento de colonias en cadaotra.
NOTA: Varias réplicas de serie se deben evitar para prevenir la pérdida de estirpes de crecimiento lento y minimizar la aparición de mutantes supresores. Esto es particularmente relevante si el mantenimiento de las colecciones como haploides. - Realice todos los pasos réplica de galvanoplastia utilizando un microbiana arraying sistema robótico. Alternativamente, manipular colonias utilizando herramientas manuales de colocación de clavos dispuestos.
NOTA: La colección de deleción de levadura está disponible como haploides y diploides a partir de varias fuentes comerciales y se envía típicamente como stocks de glicerol en placas de 96 pocillos.
- Para una descripción detallada de la construcción de matrices de mutantes de deleción de las existencias de glicerol consulte Baryshnikova et al. 14. Una vez mutantes de deleción han sido dispuestos a una densidad de 384 colonias por placa, la DMA se puede almacenar durante varios meses a 4 ° C. Replicar en agar YEPD que contiene 200 mg / ml de G418 si es necesario para prevenir el crecimiento de colonias en cadaotra.
- Condensar el array mutante de deleción
- Preparar 250 ml de medio YEPD agar que contiene 200 mg / ml de G418. La concentración efectiva de G418 puede variar y cada lote debe ser probado empíricamente.
- Preparar cinco placas de agar YEPD vertiendo 50 ml de agar YEPD que contiene 200 mg / ml de G418 por placa. Haga esto un día antes de condensar la matriz y permita que las placas se enfríen a temperatura ambientebibliografía durante la noche en una superficie plana.
NOTA: Se requieren cuatro placas de la colección en la densidad de 1536-deformación, la quinta placa se vierte como extra. - Retire las 16 placas de Petri que contienen la colección mutante de deleción a una densidad de 384 colonias por placa y se deja llegar a temperatura ambiente (~ 1 h).
- Limpiar cualquier condensación que se ha formado en la tapa de cada placa utilizando una tarea delicada toallita. El no hacerlo puede resultar en las gotas de agua que se deposita en la matriz y la contaminación cruzada de los mutantes dispuestos.
- El uso de una matriz fijando robot microbiana, condensar el DMA de una densidad de 384 colonias por placa (16 platos de Petri) para 1536 colonias por placa (4 platos de Petri). Realice este modo que el 1 de colonia de la placa 1 pines a la fila 1 columna 1 de la matriz condensada, el 1 de colonia de la placa 2 a la fila 1 columna 2, el 1 de colonia de la placa 3 de fila 2 y la columna 1, y la colonia 1 de placa de 4 a la fila 2columna 2.
- Incubar la matriz consolidada a 30 ° C durante la noche.
- Examine la matriz para asegurar la transferencia uniforme de colonias de las placas de origen. Habrá varias posiciones en blanco, a propósito incorporados en la matriz, que sirven como una guía para asegurar la DMA se ha condensado correctamente (Figura 4A).
NOTA: Estos serán los platos de origen de réplica en placa en medios que contienen el compuesto de ensayo. Una placa de una sola fuente puede ser utilizado para múltiples apuntalamientos. También muchos robots tendrán una función de compensación, lo que garantizará un número similar de levadura se están transfiriendo cada vez.
- Replica placa matriz mutante de deleción
- Preparar 700 ml de control (vehículo solo) y 700 ml de medio experimental (que contienen productos químicos). Esto es suficiente para realizar el ensayo por triplicado (12 placas por condición, además de dos extras).
- Verter 50 ml de agar YEPD contengan la sustancia problema o control por placa. Permitir los platos to enfriar a temperatura ambiente durante la noche en una superficie plana.
- Utilizando el robot para réplica de la placa, inocular el DMA en tres conjuntos de placas que contienen los productos químicos en la concentración determinado experimentalmente, así como tres conjuntos de placas que contienen el control del vehículo. Incubar las placas a temperatura ambiente durante 24-48 horas.
3. Las placas de imagen y análisis de datos
- Retire las placas de la incubadora y permitir que alcancen la temperatura ambiente (~ 1 hora) antes de la imagen. Esto evitará que se forme condensación mientras que las imágenes de las placas.
- Las placas radiográficas a las 24 y 48 horas por retirar la tapa y colocar boca abajo en un escáner de cama plana. Captura imágenes a una resolución de al menos 300 dpi. También puede utilizar una cámara digital para capturar imágenes. Si al hacerlo, placas lugar boca arriba sobre un fondo oscuro y quitar las tapas de imagen.
NOTA: El formato de archivo y la colocación de placas dependerán del programa de cuantificación utilizado. Realizar la cuantificación y la comparación de tamaños de colonia de matriz utilizando uno de varios programas de código abierto, incluyendo Balony 15, SGAtools 16 y ScreenMill 17.
4. Validación de Pantalla
NOTA: En esta etapa varias supresiones levaduras mutantes puntuarán como hipersensibilidad a la sustancia química de interés. Estas interacciones químicas genética próximo deben ser validados en dos maneras. En primer lugar la identidad de las cepas sensibles debe ser confirmada por PCR. En segundo lugar, la sensibilidad química debe ser puntuado de forma independiente. A continuación ofrecemos una breve protocolo para la realización de ensayos de manchado para validar hipersensibilidad cepa, una técnica común en la biología de la levadura.
- Streak cabo deseada (hipersensible) mutantes de la colección de levadura supresión en agar YEPD que contiene 200 mg / ml de G418. Se incuba a 30 ° C hasta que se formen colonias. Verificar el genotipo de la cepa por PCR con cebadores de diagnóstico segúnel protocolo del fabricante.
- Inocular 5 ml del líquido YEPD para cada cepa e incubar durante la noche a 30 ° C con rotación o agitación.
- Mide 600 OD y diluir cada cepa a OD 600 = 1 en DH estéril 2 O. Estos son ahora los cultivos de levaduras normalizados.
- Prescindir de 100 l de normalizado levadura de tipo salvaje (BY4741) cultura para así A1 de una placa de 96 pocillos. Prescindir de 100 l de hasta siete cepas adicionales de pozos B1-H1.
- Utilice una pipeta multicanal para dispensar 90 l de dH 2 O estéril para pozos A2-H2 a través A6-H6. Finalmente, preparar una serie de diluciones 1:10 de cultivos de levadura normalizados. Iniciar pipeteando en serie 10 l de la columna 1 a la columna 2 con una pipeta multicanal, y continuar a través de la placa de 96 pocillos hasta que se hagan seis diluciones (es decir, 10 0 a 10 -5).
- Transferencia de 2-5 l de cultivos de levadura diluidas en una cuadrícula utilizando un multicanalpipeta sobre YEPD medios sólidos que contienen sustancias químicas y el control del vehículo. Incubar las placas a la temperatura adecuada durante 24-48 h.
- Inspeccionar placas y comparar la sensibilidad de seleccionar mutantes para química (en relación con BY4741 control). Las placas radiográficas a las 24 y 48 horas como en el paso 3.2.
NOTA: Si bien la identificación de varias cepas hipersensibles con ontologías de genes relacionados o funciones presta confianza para la validez de la pantalla, se requiere la transformación de una cepa de deleción hipersensibles con un plásmido que contiene una copia de tipo salvaje del gen para establecer formalmente que un gen eliminación de interés (y las mutaciones no ocultos segundo sitio) provoca sensibilidad a los fármacos.
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Representative Results
Como una validación de este enfoque se realizó una pantalla genética química representante interacción del agente quimioterapéutico 5-fluorouracilo (5-FU) siguiendo el protocolo descrito anteriormente. 5-FU es conocido para interrumpir la timidilato sintasa, así como ADN y ARN metabolismo 18. Las interacciones genéticas químicas de 5-FU son bien estudiado y se han investigado mediante técnicas de microarrays de código de barras de la levadura utilizando ambas colecciones supresión heterocigotos y homocigotos 8,19. Aquí mostramos que resultados similares se pueden obtener mediante la cuantificación comparativa de tamaño de la colonia mutante.
Cabe señalar que la pantalla realizada utiliza la colección deleción del gen haploide no esencial. Este tipo de pantalla también se puede realizar utilizando cepas diploides, mutantes sensibles a la temperatura, y alelos hypomorphic, lo que permite la inclusión de mutantes de genes esenciales. Una ventaja de la utilización de la colección deleción haploides se incrementa sensitiv drogasdad de las vías objetivo, dada la ausencia total del producto génico. Sin embargo, dos importantes desventajas son que la hipersensibilidad gen esencial no se puede consultar, y la colección haploides es propenso a las mutaciones supresoras espontáneas que se seleccionan por sobre múltiples propagaciones. Esto puede conducir a un deterioro de la colección. Por lo tanto, hay una compensación entre el comercio inherente la integridad y la amplitud de la matriz y la sensibilidad al efecto del fármaco. Esto debe ser tomado en consideración y la colección mutante más apropiado seleccionado basa en la aplicación deseada.
En primer lugar, la concentración subletal apropiada de 5-FU que se utilizará en la pantalla se determinó que era 10 mM por la creciente BY4741 (MATa his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) las células en el aumento de concentración de 5-FU y evaluar visualmente el crecimiento de colonias de levadura ( Figura 3A). Alternativamente, los resultados similares se pueden obtener por la creciente yeast en placas de microtitulación en cultivo líquido y la monitorización frecuente de los cultivos de densidad óptica utilizando un lector de microplacas (Figura 3B), como se indica por los grupos anteriores 10,20.
Uso de la cantante ROTOR, el DMA de levadura se repitió en 1536 colonias por placa de densidad en medios que contienen 10 mM 5-FU o un control de sulfóxido de dimetilo (DMSO) (Figura 4A). Estas placas se incubaron durante 24 horas a temperatura ambiente y la imagen en un escáner de cama plana. Medición del tamaño de la colonia para cada mutante de ambas placas experimentales y de control se realizó utilizando el motor de análisis de imágenes Balony 15. El software Balony calcula la relación de tamaño de las colonias en la matriz experimental en relación al control. El usuario es capaz de establecer un umbral de relación y si la pantalla se lleva a cabo al menos por triplicado un valor de p se asigna para cada mutante. En nuestros mutantes de pantalla representativas que mostraron una relación de ≤0.8 se considereed a ser imparables. Los resultados de la cuantificación de colonias pueden ser presentados gráficamente representando gráficamente la relación de tamaño para cada colonia en el eje Y y la deleción del gen ordenado por posición de matriz (Figura 4B) o la relación (Figura 4C) en el eje x.
Enfermo Sintético / mutantes letales identificados en la pantalla se puede agrupar en base a descripciones funcionales mediante la realización de ontología de genes (GO) el análisis. Hay varias herramientas disponibles públicamente para GO análisis de las listas de S. genes cerevisiae; incluyendo FunSpec 21, DAVID Bioinformática Database 22,23, y la base de datos del genoma Saccharomyces (USD) Buscador de Go Plazo 24. Supresiones de genes que tenían una relación de menos de o igual a 0,8 en la pantalla de 5-FU se utilizaron como una lista de entrada para FunSpec. FunSpec acepta una lista de nombres de genes de levadura sistemática o común y da salida a los resúmenes de las ontologías génicas, clasificaciones funcionales, localización, complejos de proteínas, así como otsus clasificaciones útiles que se enriquecen en esa lista. La pantalla representativo realizado mostró un enriquecimiento de ontologías para el metabolismo del RNA, incluyendo tRNA se tambalea, modificación uridina y maquinaria de vigilancia de ARN, y la respuesta al daño del ADN (Tabla 1). Estos resultados coinciden con estudios previos que han demostrado 5-FU tratamiento resulta en la acumulación de los ARN no codificantes poliadenilados, que se procesan por el TRF / Rrp6 / Aire / Mtr4 Polyadenylation (TRAMP) exosome nuclear 25. Así, estos resultados están de acuerdo con las pantallas de genética químicas anteriores y el conocido mecanismo de 5-FU bioactividad 8,19.
Como con todos los enfoques genómicos funcionales de alto rendimiento es necesario para validar los resultados. Para validar las interacciones genéticas químicos mutantes de levadura deben primero ser PCR validados con cebadores que hibridan en el promotor del gen diana y módulo de fragmentación kanMX. La selección de cepas para la válidaación es, mutantes algo arbitrarios sin embargo priorizando que muestran un fuerte fenotipo y el grupo proporciona funcionalmente un buen punto de partida. A continuación, la hipersensibilidad a una sustancia química se confirmó mediante ensayos manchas, un enfoque común para medir la aptitud de los mutantes de levadura. Para este fin, diluciones en serie de cepas de levadura se han manchado en una cuadrícula en medios que contienen la dosis química apropiada, así como un control. A modo de ejemplo, confirmamos la interacción genética química de 5-FU con Aire1 y TRF5 mutantes del complejo VAGABUNDO (Figura 5). Estos genes codifican componentes del exosome nuclear VAGABUNDO. Tomamos nota de que la cepa rrp6, que carecen de la base 3'-5 'exonucleasa de vagabundo, se perdió en la colección DMA de alta densidad de nuestro laboratorio. En la obtención de un mutante rrp6 fresco confirmamos que rrp6 y 5-FU también mostramos una interacción genética química, es necesario establecer que la actividad VAGABUNDO tolerar 5-FU. Esto ilustraque la integridad de grandes colecciones de deleción puede llegar a ser comprometida con el tiempo, haciendo que el mantenimiento adecuado DMA y validación deformación crítica.
Nuestra pantalla también identificó mutantes en varias enzimas de reparación del ADN (incluyendo rad50, rad52 y Mre11) como 5-FU sensible. La puntuación de tamaño de las colonias indica la aptitud relativa de estos mutantes en 10 mM de 5-FU como 0,7, 0,65, y 0,42 en comparación con el tipo salvaje. En base a los ensayos de formación de manchas de confirmación (Figura 5), estos valores son una probable subestimación debido a la gama dinámica limitada de la medición de la aptitud de puntuación por tamaño de la colonia. Esto pone de manifiesto una segunda razón para confirmar de manera independiente las interacciones de manchas de serie: la magnitud de algunas interacciones genéticas químicos puede ser subestimada en el análisis de datos primarios. Nuestros resultados ponen de manifiesto que una pantalla genética química basada en el crecimiento realizado con ~ 4800-cepa de colección supresión haploides, por triplicado, ofrece resol adecuada ution aislar confianza interacciones genéticas químicos específicos.
Figura 1: Representación esquemática de. Químicas interacciones genéticas supresiones de genes que dan lugar a hipersensibilidad a la perturbación química permiten la identificación de los procesos biológicos dirigidos por un químico. Vías (A) convergentes pueden ser interrumpidos por cualquiera de supresión de genes (Genea) o química (geneB). Individualmente, estos insultos celulares pueden ser tolerados debido a la redundancia inherente en las vías biológicas. Sin embargo, en la viabilidad celular se ve comprometida combinación resulta en un fenotipo ya sea sintéticamente enfermo o letal. (B) La supresión de genes (geneC) críticos para mitigar el estrés inducido químicamente también causar hipersensibilidad e indicar las vías biológicas alteradas por tratamiento químico. jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Flujo de trabajo para la química de la pantalla genética (A) Determinación de la dosis sub-inhibitoria:. Cepas de levadura parentales se cultivan hasta la fase estacionaria, se diluyó 1: 5000, y la propagación en placas sobre medios YEPD sólidos que contienen dosis química en aumento. La concentración más alta que no tiene la inhibición del crecimiento mayor que el 10-15% se selecciona para el cribado en contra de la DMA. (B) Sistemática Química Selección Genética: El uso de una matriz de alto rendimiento fijando robot del S. cerevisiae DMA es réplica chapada en medios que contienen la concentración adecuada de la sustancia de ensayo. Las placas se incuban a temperatura ambiente durante 24-48 horas, la imagen formada, y tamaño de la colonia relativa determinada.ref = objetivo "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig2highres.jpg" = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 :. Determinación de la Concentración Inhibitoria-Sub. (A) Crecimiento de BY4741 células en medios sólidos que contienen 5-fluoracilo. Cultura saturada BY4741 diluyó 1: 5000 y se sembró en concentraciones crecientes de 5-fluorouracilo. Curva (B) Crecimiento de BY4741 células en medios líquidos que contienen 5-fluorouracilo. ~ 4 × 10 4 células fueron depositados por triplicado en concentraciones crecientes de 5-FU y ODS se midieron cada 10 min durante 22 h.
Figura 4: Selección Genética Química de 5-Fluorouracilo. (A) S. cerevisiae variedad mutante de deleción replicado en agar YEPD conteniendo 10 mM de 5-FU (derecha) y el control de DMSO (izquierda). (B) Los resultados de Química Selección Genética: el crecimiento relativo de los mutantes en 10 mM de 5-FU en comparación con el control de DMSO ordenado por posición de matriz. (C) el crecimiento relativo de los mutantes en 10 mM de 5-FU en comparación con el control de DMSO ordenado por la relación de tamaño de las colonias. Un umbral de relación de ≤0.8 se indica en ambos gráficos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Validación de Químicas interacciones genéticas. Diluciones en serie de varias cepas mutantes aisladas cultivadas en control de DMSO (A), 10 mM (5-FU
| GO Categoría | P-valor | Genes identificados (hits) | # éxitos | # Total de genes en GO Categoría |
| ARNt bamboleo modificación uridina [GO: 0002098] | 2,24 × 10 -6 | SIT4 NCS6 URM1 KTI12 IKI3 Tum1 ELP3 | 7 | 24 |
| transcripción, dependiente de ADN [GO: 0006351] | 1,69 × 10 -5 | PDR3 LDB7 HIR1 Hap3 ROX3 SPT7 SNF5 RPA14 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 en espera SDS3 MET18 CTK2 RPB4 SWI3 RPA12 KTI12 ASH1 Swi6 IKI3 GCR2 POP2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 | 32 | 540 |
| traducción [GO: 0006412] | 4,28 × 10 -5 | RPL19B RPS11B FES1 RPS9B RPL31A RPL24A RPL7A RPS25A RPL26B RPL11B RPL27A RPL34B RPL14A TEF4 RPS29A RPL6A AEP1 RPS16A MRP7 RPS19B RPS19A RPS7A | 22 | 318 |
| tRNA wobble posición uridina tiolación [GO: 0002143] | 1,88 × 10 -4 | NCS6 URM1 Tum1 | 3 | 5 |
| regulación de la transcripción, dependiente de ADN [GO: 0006355] | 4,98 × 10 -4 | PDR3 LDB7 HIR1 Hap3 ROX3 SPT7 SNF5 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 en espera SDS3 SWI3 KTI12 ASH1 Swi6 IKI3 GCR2 POP2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 | 27 | 507 |
| urmylation proteína [GO: 0032447] | 6,33 × 10 -4 | NCS6 URM1 URE2 | 3 | 7 |
| mRNA de exportación desde el núcleo en respuesta al estrés al calor [GO: 0031990] | 2,04 × 10 -3 | RPB4 NUP120 NUP133 | 3 | 10 |
| poliadenilación dependiente nuclear proceso catabólico CUT [GO: 0071039] | 2,04 × 10 -3 | AIR1 TRF5 MPP6 | 3 | 10 |
| proceso metabólico triptófano [GO: 0006568] | 2,15 × 10 -3 | TRP5 TRP3 | 2 | 3 |
| endosoma temprano al transporte de Golgi [GO: 0034498] | 2,75 × 10 -3 | ENT5 TCA17 RCY1 | 3 | 11 |
| pequeña ribosomal biogénesis subunidad [GO: 0042274] | 3,63 × 10 -3 | SAC3 LTV1 RPS19B RPS19A | 4 | 24 |
| modificación de la cromatina [GO: 0016568] | 3,64 × 10 -3 | LDB7 HIR1 SPT7 NGG1 SPT3 SDS3 ASH1 SGF11ELP3 | 9 | 114 |
| Proceso metabólico ATP [GO: 0046034] | 4,23 × 10 -3 | VMA2 VMA1 | 2 | 4 |
| vacuolar protones transporte de tipo V ATPasa complejo montaje [GO: 0070072] | 4,23 × 10 -3 | VMA21 VPH2 | 2 | 4 |
| localización cromosómica [GO: 0050000] | 4,23 × 10 -3 | NUP120 NUP133 | 2 | 4 |
| el transporte del ARNm [GO: 0051028] | 4,59 × 10 -3 | DHH1 SAC3 LOC1 KAP114 NUP120 NUP133 | 6 | 58 |
| acidificación vacuolar [GO: 0007035] | 4,89 × 10 -3 | VMA2 VMA1 VMA5 VPH2 | 4 | 26 |
| rRNA exportación de núcleo [GO: 0006407] | 5.63 × 10 <sup> -3 | NUP120 NUP133 RPS19B RPS19A | 4 | 27 |
| endocitosis [GO: 0006897] | 6,57 × 10 -3 | SLA1 EDE1 CDC50 ART5 RCY1 VPS1 END3 | 7 | 82 |
| vigilancia nuclear mRNA de procesamiento del mRNA extremo 3 '[GO: 0071031] | 6,92 × 10 -3 | AIR1 MPP6 | 2 | 5 |
| ncRNA poliadenilación [GO: 0043629] | 6,92 × 10 -3 | AIR1 TRF5 | 2 | 5 |
| poliadenilación dependiente nuclear proceso catabólico snoRNA [GO: 0071036] | 6,92 × 10 -3 | AIR1 TRF5 | 2 | 5 |
| poliadenilación dependiente nuclear proceso catabólico snRNA [GO: 0071037] | 6,92 × 10 -3 | AIR1 TRF5 | 2 | 5 |
| proceso de biosíntesis de triptófano [GO: 0000162] | 6,92 × 10 -3 | TRP5 TRP3 | 2 | 5 |
| inserción de proteínas en la membrana ER [GO: 0045048] | 6,92 × 10 -3 | Get1 GET4 | 2 | 5 |
| estabilización de ARNm [GO: 0048255] | 6,92 × 10 -3 | ATP25 IGO1 | 2 | 5 |
| respuesta al estímulo daño en el ADN [GO: 0006974] | 7,05 × 10 -3 | MUS81 RAD2 MET18 CTK2 RPB4 GRR1 DEF1 MMS22 RAD52 MRE11 RAD50 RMI1 | 12 | 197 |
| GO Categoría | P-valor | Genes identificados (hits) | en "> # éxitos# Total de genes en GO Categoría | |
| poliadenilación dependiente nuclear proceso catabólico rRNA [GO: 0071035] | 8,46 × 10 -3 | AIR1 TRF5 MPP6 | 3 | 16 |
Tabla 1: Ontología de Genes (GO) Caracterización de 5-fluorouracilo mutantes sensibles.
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Discussion
Esbozado aquí es un enfoque para la generación de perfiles de interacción química y genética. El método es simple: mediante la comparación de tamaños de colonia de cada cepa en colecciones integrales de supresión de genes en presencia y ausencia de un producto químico, todos los genes necesarios para tolerar un insulto química se identifican. Análisis de enriquecimiento de anotación de la lista resultante de cepas sensibles a continuación, se puede utilizar para proporcionar información sobre un modo de productos químicos de acción. Mientras que este protocolo se ha optimizado para la levadura en ciernes, también puede ser adaptado para su uso con otras colecciones de deleción microbianas dispuestos, como la E. colección coli Keio, que ha sido utilizado con éxito para investigar cientos de perturbaciones celular 26,27.
Perfiles de química y genética en levaduras y otros organismos está bien establecida. La mayoría de estos estudios se han basado en ensayos de competición que cuantifican agruparon supresión mutantes a través del análisis de microarrays o secuenciadores de alto rendimientoferencias de códigos de barras genéticos únicos. Este enfoque ha tenido éxito en la producción de perfiles químicos genética robustas de grandes bibliotecas químicas. La metodología descrita aquí proporciona una alternativa útil para el análisis de química y genética de los números más pequeños de compuestos de ensayo. El ensayo proporciona una lectura simple que es menor costo prohibitivo de secuenciación de alto rendimiento o el análisis de microarrays y no sufre de sesgo de secuencia. Aunque el protocolo como se describe requiere un instrumento robótico para la manipulación colonia, estos sistemas son cada vez más asequibles y, alternativamente, el protocolo se podría ajustar para el uso con herramientas de colocación de clavos manuales, ejemplos de los cuales han sido incluidos en la lista de materiales.
Es importante ser consciente de las limitaciones de este enfoque y los perfiles genéticos química en general. En primer lugar, el compuesto debe tener un efecto sobre la viabilidad en la levadura en ciernes, o el organismo específico que se utilice. Mientras que muchos procesos biológicos fundamentalesy funciones están bien conservadas entre los eucariotas, las interacciones genéticas químicas específicas organismo puede variar ampliamente, al igual que la absorción de los productos químicos en las células. También debe tenerse en cuenta que varias cepas de deleción se han encontrado para ser sensible a múltiples tratamientos farmacológicos 8. Estos incluyen genes implicados en el eflujo de fármaco, la función vacuolar, y la integridad de la membrana. Es importante tener en cuenta la resistencia a múltiples fármacos al hacer conclusiones con respecto a dirigir y modos indirectos de acción.
La pantalla que se describe aquí se ha realizado mediante la recopilación supresión haploides, un enfoque común para el análisis de química y genética en levaduras. En la actualidad hay varias colecciones de mutantes de levadura disponibles para una nueva ayuda en la determinación del modo de un compuesto químico de acción. Esto incluye no sólo los homocigotos completa y colecciones de deleción diploides heterocigóticos, sino también esenciales mutantes de genes sensibles a la temperatura condicionales, el DecreASED Abundancia por mRNA de Perturbación (húmedo) de levadura biblioteca de mutantes, y una histona H3 y H4 colección sintética mutante, que podría ser utilizado para investigar epigenéticos terapias moleculares basados 3,4,28, dada la increíble profundidad de las herramientas disponibles, la facilidad de la metodología, y la limitada infraestructura necesaria, este enfoque proporciona un formato accesible para acceder a información funcional rico con respecto al mecanismo de un compuesto químico.
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Acknowledgments
La investigación en el laboratorio de CJN con el apoyo de subvenciones de funcionamiento de NSERC, el Instituto Canadiense del Cáncer Research Society (CCSRI) y la Canadian Breast Cancer Foundation (BC-Yukon Branch).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v) |
| Tyrptone Powder | BD Biosciences | 211820 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| Dextrose | Anachemia | 31096-380 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) — do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving. |
| Agar A | Bio Basic | FB0010 | For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| G418 | A.G. Scientific Inc. | G-1033 | Prepare 1,000x stock at 200 mg/ml in dH2O and filter sterilize. |
| 12-well plate | Greiner Bio One | 655180 | |
| 5 ml culture tubes | Evergreen Scientific | 222-2376-080 | |
| 10 cm Petri Dish | VWR | 25384-302 | |
| ROTOR HDA | Singer Instruments | ROT-001 | high-throughput microbial array pinning robot |
| PLUSPLATE© Petri Dish | Singer Instruments | PLU-001 | Box of 200 dishes |
| 384 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-384 | Box of 1,000 pads |
| 1536 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-1536 | Box of 1,000 pads |
| Alternative Pinning Tools: | |||
| Fully Automated Robtic Systems | S&P robotics | http://www.sprobotics.com | Several automated colony handling robitic and imagining systems available. |
| Manual Pinning Tools | V&P Scientific | http://www.vp-scientific.com | Handheld replication tools and accessories. |
References
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