Abstract
تحديد طريقة عمل المواد الكيميائية الحيوية النشطة هي التي تهم مجموعة واسعة من الأكاديمية، والمستحضرات الدوائية، والعلماء الصناعي. خميرة الخباز، أو في مهدها الخميرة، هو حقيقي النواة نموذج الذي مجموعة كاملة من ~ 6،000 المسوخ حذف الجينات وhypomorphic الجين ضروري تتوفر تجاريا المسوخ. هذه المجموعات من المسوخ يمكن استخدامها للكشف عن منهجية التفاعلات الكيميائية الجينات، أي الجينات اللازمة لتحمل مادة كيميائية. هذه المعلومات، بدوره، تقارير عن الوضع المحتمل لعمل المجمع. نحن هنا وصف بروتوكول لتحديد سرعة التفاعلات الكيميائية الوراثية في مهدها الخميرة. ونحن لشرح طريقة استخدام وكيل العلاج الكيميائي 5-فلورويوراسيل (5-FU)، والتي لديها آلية واضحة المعالم للعمل. نتائجنا تظهر أن TRAMP النووي RNA وهناك حاجة exosome وإصلاح الحمض النووي الانزيمات لانتشار في وجود 5-FU، وهو ما يتسق مع م السابقicroarray النهج الترميز شريط الكيميائية الوراثية على أساس ومعرفة أن 5-FU يؤثر سلبا على كل من RNA والحمض النووي الأيض. كما وصف بروتوكولات المصادقة المطلوب من هذه الشاشات عالية الإنتاجية.
Introduction
وقد مكنت الأدوات والموارد المتاحة في الكائن الحي نموذج خميرة الخباز الوراثية واسعة النطاق علم الجينوم وظيفية الدراسات التي توفر مجتمعة نظرة جديدة في كيفية عمل الجينات كشبكات للوفاء بمتطلبات النظم البيولوجية. وكان حجر الزاوية في هذه الأدوات إنشاء تعاونية من مجموعة كاملة من الجينات الحذف غير الضرورية من جميع الأطر القراءة المفتوحة في الخميرة 1،2. ومن الملاحظات اللافتة التي فقط ~ 20٪ من جينات الخميرة ويلزم للبقاء عندما نمت كما haploids تحت ظروف المختبر القياسية. هذا يسلط الضوء على قدرة خلية لالعازلة ضد الاضطرابات الجينومية من خلال الاستفادة من المسارات البيولوجية البديلة. المسوخ الوراثية التي هي قابلة للتطبيق بشكل فردي، ولكن قاتلة في الجمع، وإشارة مسارات بيولوجية موازية متصلة أو متقاربة وتشكيل شبكات التفاعل الجينية التي تصف الوظيفة البيولوجية. مع تطور الشركة المصرية للاتصالات الشرطيةالأليلات mperature الحساسة وhypomorphic من الجينات الأساسية التكنولوجيا لم تقتصر على دراسة الجينات غير الضرورية 3،4. وقد تم تطبيق هذا المفهوم على نطاق الجينوم انتاج منحازة خريطة التفاعل الجيني توضح كيف تتجمع الجينات المسؤولة عن العمليات الخلوية المتشابهة معا 5.
الاضطرابات الكيميائية للشبكات الوراثية الجينات الحذف تقليد (الشكل 1) 6. الاستعلام عن المركبات النمو المثبطة ضد مجموعة عالية الكثافة من سلالات الحذف لفرط الحساسية يحدد لمحة التفاعل الكيميائي الوراثية، أي قائمة من الجينات المطلوبة لتحمل الإجهاد الكيميائية. مثل التفاعلات الوراثية، وقد أظهرت شاشات واسعة النطاق من المكتبات الكيميائية التي المركبات مع وضع مماثل من كتلة العمل معا 7. ولذلك، من خلال إنشاء الملف الشخصى التفاعل الكيميائي الوراثية من مركب يمكن الاستدلال على طريقة عمل عن طريق مقارنتها مع لارجنرال الكتريك نطاق التفاعل الجيني الوراثي والكيميائي الاصطناعية مجموعات البيانات 8،9.
وقد أجريت شاشات الكيميائية الوراثية على نطاق واسع، حيث يتم استجواب العشرات من المركبات، من خلال فحوصات المنافسة الباركود. في هذا النهج، ويزرع جمع المجمعة من سلالات الحذف بشكل جماعي لعدة أجيال في حجم صغير وسائل الإعلام التي تحتوي على مادة كيميائية. لأن كل متحولة الحذف المرافئ الباركود وراثية فريدة من نوعها، يتم تعقب الجدوى / نمو المسوخ الفردية داخل بركة من سلالات الحذف من قبل ميكروأري أو عالية الإنتاجية تسلسل 10.
استنتاج اللياقة البدنية من خلال رصد حجم مستعمرة من المسوخ العريض جسديا نمت على أجار الصلبة التي تحتوي على مركب النشطة بيولوجيا هو أيضا وسيلة فعالة لتحديد التفاعلات الكيميائية الوراثية 11،12. ويوفر هذا النهج بديلا فعالا من حيث التكلفة لفحص القائم على المنافسة ومناسب تماما لمعايرة مكتبات صغيرة من المواد الكيميائية.المبين هنا هو منهجية بسيطة لإنتاج قائمة من التفاعلات الكيميائية الوراثية في S. الخباز أن لا تعتمد على التلاعب الجزيئية علم الأحياء أو البنية التحتية. ويتطلب سوى جمع الخميرة الحذف، جهاز التدبيس الروبوتية أو اليدوي، ومتاحة بحرية برنامج تحليل الصور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ويرد سير العمل العام لهذا الإجراء في الشكل 2: ملاحظة.
1. تحديد الجرعة النمو المثبطة
- إعداد الخميرة الثقافة بين عشية وضحاها
ملاحظة: وسائل الإعلام نمو الخميرة استخراج-ببتون-الدكستروز (YEPD) المستخدمة في هذا البروتوكول هو وصفة معيارية 13.- خط خارج BY4741 (ماتا HIS3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) الخلايا على لوحة أجار YEPD واحتضان لمدة 48 ساعة على 30 درجة مئوية أو حتى شكل مستعمرات مرئية.
- إعداد الثقافات بين عشية وضحاها، فحقن 5 مل من YEPD وسائل الإعلام السائلة في وعاء الثقافة العقيمة مع مستعمرة واحدة. احتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع دوران مستمر أو اهتزاز. سوف ثقافة تصل عادة تشبع من صباح اليوم (~ 2 × 10 8 خلية / مل).
- إعداد وسائل الاعلام أجار الصلبة التي تحتوي على جرعات متفاوتة الكيميائية
- إعداد عدة أسهمهذه المادة الكيميائية لفحصها في 100X المطلوب التركيز النهائي في مذيب مناسب.
ملاحظة: سوف تركيزات فعالة تعتمد على المواد الكيميائية، ويجب أن تحدد تجريبيا. ولذلك فمن المستحسن لاختبار في البداية مجموعة التركيز النهائي واسع، أي من ميكرومتر منخفض لملم عالية. - لكل تركيز المواد الكيميائية لفحصها، قسامة 3 مل من المنصهر YEPD أجار إلى عدة العقيمة أنبوب الثقافة. مكان في 55 ° C حمام الماء للحفاظ على من ترسيخ.
- لكل تركيز المواد الكيميائية لفحصها إضافة 30 ميكرولتر من مجمع 100X إلى وسائل الإعلام المنصهرة، دوامة 2-3 ثانية لخلط، وماصة 1 مل في كل زوج من الآبار مكررة في لوحة 12-جيدا. تأكد من تضمين سيارة تحكم فقط. السماح لوحات لضبط بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. تجاهل أي وسيلة إعلامية إضافية.
- إعداد عدة أسهمهذه المادة الكيميائية لفحصها في 100X المطلوب التركيز النهائي في مذيب مناسب.
- خلايا انتشار تصفيح
- تطعيم 10 مل من YEPD وسائل الإعلام السائلة مع 2 ميكرولتر من ثقافة الخميرة المشبعة، ونمت بين عشية وضحاها كما في الخطوة 1.1.2.
- لوحة 25 ميكرولتر من ثقافة الخميرة المخفف لكل بئر، موزعة بالتساوي باستخدام الخرز الزجاجي معقمة أو قضيب، والسماح لوحة لتجف تحت لهب. احتضان لوحة عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
- تقييم نمو الخميرة (سواء عدد وحجم المستعمرات) على لوحات. تحديد تركيز شبه قاتلة من المركب الذي لا تمنع النمو من خلال أكثر من 10٪ -15٪ لأداء الشاشة.
2. المنهجية شاشة الوراثية الكيميائية
- صيانة الحذف-متحولة صفيف (DMA) وإعداد لوحة المصدر
- للحصول على وصف مفصل عن بناء المصفوفات متحولة الحذف من المخزونات الجلسرين يرجى الرجوع إلى Baryshnikova وآخرون. 14. مرة واحدة وقد تم المحتشدة المسوخ الحذف في مناطق ذات كثافة من 384 المستعمرات في لوحة، وDMA يمكن تخزينها لعدة أشهر في 4 درجات مئوية. تكرار على YEPD أجار تحتوي على 200 ميكروغرام / مل من G418 ضروريا لمنع المستعمرات من النمو في كلالبعض.
وينبغي تجنب متعددة مكررات التسلسلية لمنع فقدان بطيئة سلالات النمو وتقليل ظهور طفرات القامع: ملاحظة. وهذا هو ذات الصلة ولا سيما إذا الحفاظ على مجموعات كما haploids. - تنفيذ جميع الخطوات طبق الاصل الطلاء باستخدام الميكروبية arraying النظام الآلي. بدلا من ذلك، والتعامل معها المستعمرات باستخدام أدوات التدبيس اليدوية المحتشدة.
ملاحظة: جمع الخميرة الحذف هو متاح في haploids وdiploids من عدة مصادر تجارية وشحن وعادة ما أسهم الجلسرين في لوحات 96-جيدا.
- للحصول على وصف مفصل عن بناء المصفوفات متحولة الحذف من المخزونات الجلسرين يرجى الرجوع إلى Baryshnikova وآخرون. 14. مرة واحدة وقد تم المحتشدة المسوخ الحذف في مناطق ذات كثافة من 384 المستعمرات في لوحة، وDMA يمكن تخزينها لعدة أشهر في 4 درجات مئوية. تكرار على YEPD أجار تحتوي على 200 ميكروغرام / مل من G418 ضروريا لمنع المستعمرات من النمو في كلالبعض.
- التكثيف مجموعة الحذف متحولة
- إعداد 250 مل من YEPD وسائل الإعلام أجار تحتوي على 200 ميكروغرام / مل من G418. تركيز الفعال لG418 قد تختلف ولكل الكثير وينبغي اختبار تجريبيا.
- إعداد خمس لوحات YEPD أجار عن طريق سكب 50 مل من YEPD أجار تحتوي على 200 ميكروغرام / مل من G418 لكل لوحة. القيام بذلك قبل يوم واحد التكثيف مجموعة والسماح لوحات لتبرد في درجة حرارة الغرفةerature بين عشية وضحاها حتى على سطح مستو.
ملاحظة: سوف تكون هناك حاجة أربعة لوحات لجمع في كثافة 1،536 سلالة، يسكب لوحة الخامسة كما اضافية. - إزالة 16 أطباق بتري تحتوي على مجموعة الحذف متحولة في مناطق ذات كثافة من 384 المستعمرات في لوحة والسماح للقدوم إلى درجة حرارة الغرفة (~ 1 ساعة).
- مسح أي التكثيف التي شكلت على غطاء كل لوحة باستخدام مهمة حساسة مسح. عدم القيام بذلك قد يؤدي إلى قطرات الماء التي تترسب على مجموعة والتلوث عبر المسوخ المحتشدة.
- باستخدام الميكروبات مجموعة تعلق الروبوت، تكثيف DMA من كثافة 384 المستعمرات في لوحة (16 أطباق بتري) إلى 1،536 المستعمرات في لوحة (4 أطباق بتري). تنفيذ هذا حتى يتسنى لل1 شارع مستعمرة من لوحة 1 دبابيس إلى الصف 1 العمود 1 للمجموعة الموجزة، 1 شارع مستعمرة من لوحة 2 إلى الصف 1 العمود 2، 1 شارع مستعمرة من لوحة 3 إلى الصف 2 والعمود 1، و مستعمرة 1 شارع لوحة 4 إلى الصف 2العمود 2.
- احتضان مجموعة الموحدة في 30 درجة مئوية خلال الليل.
- دراسة مجموعة لضمان نقل موحد للمستعمرات من لوحات المصدر. سيكون هناك العديد من المناصب فارغة، أدرجت عمدا في مجموعة، والتي تكون بمثابة الدليل لضمان تم مكثف للDMA بشكل صحيح (الشكل 4A).
ملاحظة: ستكون هذه لوحات مصدر للتصفيح نسخة على وسائط تحتوي على مركب الاختبار. صفيحة مصدر واحد يمكن أن تستخدم لpinnings متعددة. أيضا العديد من الروبوتات سيكون لها ميزة تعويضية، والتي سوف تضمن أعداد مماثلة من الخميرة ونقله في كل مرة.
- لوحة طبق الاصل حذف متحولة مجموعة
- إعداد 700 مل من التحكم (السيارة فقط) و 700 مل من وسائل الاعلام التجريبية (التي تحتوي على مادة كيميائية). وهذا يكفي لأداء الفحص في ثلاث نسخ (12 لوحات في حالة، بالإضافة إلى اثنين اشياء).
- صب 50 مل من YEPD أجار التي تحتوي على اختبار كيميائي أو السيطرة لكل لوحة. السماح لوحات رس يبرد في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها حتى على سطح مستو.
- باستخدام الروبوت لوحة طبق الاصل، وتحصين DMA على ثلاث مجموعات من اللوحات التي تحتوي على المواد الكيميائية على تركيز العزم تجريبيا، فضلا عن ثلاث مجموعات من اللوحات التي تحتوي على السيطرة على السيارة. احتضان لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 24-48 ساعة.
3. لوحات التصوير وتحليل البيانات
- إزالة لوحات من الحاضنة والسماح لهم للقدوم إلى درجة حرارة الغرفة (~ 1 ساعة) قبل التصوير. وهذا يمنع من تشكيل التكثيف في حين التصوير لوحات.
- لوحات صورة في 24 و 48 ساعة عن طريق إزالة الغطاء ووضع وجهه لأسفل على الماسح الضوئي سرير مسطح. التقاط الصور بدرجة وضوح لا يقل عن 300 نقطة في البوصة. بدلا من ذلك، استخدم كاميرا رقمية لالتقاط الصور. إذا كان ذلك، تواجه لوحات مكان حتى على خلفية داكنة وإزالة الأغطية إلى الصورة.
ملاحظة: سوف تنسيق الملف وتحديد المواقع لوحات تعتمد على برنامج الكمي المستخدمة. أداء الكمي ومقارنة أحجام مستعمرة مجموعة باستخدام واحدة من العديد من البرامج مفتوحة المصدر، بما في ذلك Balony 15، SGAtools 16، وScreenMill 17.
4. التحقق من الشاشة
ملاحظة: في هذه المرحلة عدة الحذف الخميرة المسوخ سوف يسجل الحساسية لهذه المادة الكيميائية المثيرة للاهتمام. يجب المقبل يمكن التحقق من صحة هذه التفاعلات الكيميائية الوراثية بطريقتين. أولا هوية سلالات حساسة ينبغي تأكيد من قبل PCR. ثانيا، يجب سجل مستقل الحساسية الكيميائية. المبينة أدناه هو بروتوكول موجز لأداء فحوصات للتحقق من صحة اكتشاف سلالة فرط الحساسية، وهي تقنية شائعة في الخميرة علم الأحياء.
- خط من المطلوب (الحساسية) المسوخ من مجموعة حذف الخميرة على YEPD أجار تحتوي على 200 ميكروغرام / مل من G418. احتضان عند 30 درجة مئوية حتى شكل مستعمرات. التحقق من النمط الجيني لسلالة من التشخيص PCR مع الاشعال وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- تطعيم 5 مل من السائل YEPD لكل سلالة واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع دوران أو اهتزاز.
- قياس OD 600 وتمييع كل سلالة إلى OD 600 = 1 في DH معقم 2 O. هذه هي الآن الثقافات خميرة طبيعية.
- الاستغناء 100 ميكرولتر من تطبيع البرية من نوع الخميرة (BY4741) الثقافة إلى ما A1 من لوحة 96-جيدا. الاستغناء 100 ميكرولتر من ما يصل الى سبعة سلالات إضافية لآبار B1-H1.
- استخدام pipettor الأقنية للاستغناء 90 ميكرولتر من درهم العقيمة 2 O إلى الآبار A2-H2 من خلال A6-H6. وأخيرا، وإعداد سلسلة من التخفيفات 1:10 من الثقافات الخميرة تطبيع. بدء بواسطة pipetting متسلسل 10 ميكرولتر من العمود 1 إلى العمود 2 مع pipettor الأقنية، والاستمرار عبر لوحة 96-جيدا حتى تتم ست التخفيفات (أي 10 0-10 -5).
- نقل 2-5 ميكرولتر من الثقافات الخميرة المخفف في شبكة باستخدام الأقنيةpipettor على YEPD وسائل الاعلام الصلبة التي تحتوي على المكافحة الكيميائية والمركبات. احتضان لوحات في درجة حرارة مناسبة لمدة 24-48 ساعة.
- تفقد لوحات ومقارنة حساسية مختارة المسوخ لالكيميائية (نسبة إلى BY4741 السيطرة). لوحات صورة في 24 و 48 ساعة كما في الخطوة 3.2.
ملاحظة: على الرغم من تحديد عدة سلالات شديدة الحساسية مع أنطولوجيات الجينات ذات الصلة أو وظائف يضفي الثقة للصحة الشاشة، مطلوب التحول من سلالة الحذف الحساسية مع البلازميد يحتوي على نسخة من النوع البري من الجين لإنشاء رسميا أن الجين حذف الفائدة (وليس مخفي الطفرات الموقع الثانية) يسبب حساسية المخدرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كما التحقق من صحة هذا النهج أجرينا شاشة التفاعل تمثيلية الكيميائية الوراثية من وكيل العلاج الكيميائي 5-فلورويوراسيل (5-FU) بعد بروتوكول المبينة أعلاه. ومن المعروف 5-FU لتعطيل ثيميديلات سينسيز وكذلك DNA و RNA الأيض 18. التفاعلات الكيميائية الوراثية من 5-FU هي مدروسة وتم التحقيق فيها من خلال تقنيات ميكروأري الخميرة الباركود باستخدام كل متخالف ومتماثل مجموعات الحذف 8،19. نحن هنا تبين أن نتائج مماثلة يمكن الحصول على الكميات النسبية للمتحولة حجم مستعمرة.
وتجدر الإشارة إلى أن الشاشة يؤديها تستخدم لجمع فرداني حذف الجينات غير الضرورية. ويمكن أيضا أن هذا النوع من الشاشة يتم تنفيذها باستخدام سلالات مضاعفا، المسوخ حساسة للحرارة، والأليلات hypomorphic، والسماح للإدراج المسوخ الجينات الأساسية. ميزة واحدة إلى الاستفادة من جمع الحذف فرداني يتم زيادة sensitiv المخدراتإيتي من الممرات المستهدفة، ونظرا لغياب كامل للمنتج الجين. ومع ذلك، اثنين من عيوب كبيرة هي أن فرط الحساسية الجين ضروري لا يمكن الاستعلام، وجمع فرداني هو عرضة للطفرات القامع عفوية التي تم تحديدها لأكثر من التوليدات متعددة. هذا يمكن أن يؤدي إلى تدهور التحصيل. وبالتالي، ليس هناك أية إمكانية للمفاضلة بين النزاهة واتساع نطاق مجموعة والحساسية لتأثير المخدرات. يجب أن يؤخذ هذا في الاعتبار، وجمع متحولة أنسب اختيار على أساس التطبيق المطلوب.
أولا، تركيز شبه قاتلة المناسب لل5-FU لاستخدامها في شاشة تقرر أن يكون 10 ميكرومتر من خلال زراعة BY4741 (ماتا HIS3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) الخلايا على زيادة تركيز 5-FU وتقييم بصريا نمو الخميرة مستعمرة ( الشكل 3A). بدلا من ذلك، يمكن الحصول على نتائج مماثلة التي كتبها ye متزايدAST في لوحات عيار مكروي في الثقافة السائلة والرصد المتكرر للثقافات الكثافة البصرية باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية (الشكل 3B)، على النحو المبين من قبل الجماعات السابقة 10،20.
باستخدام المغني الدوار، تم نسخ DMA الخميرة في 1،536 المستعمرات في الكثافة لوحة على وسائط تحتوي على 10 ميكرومتر 5-FU أو ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) التحكم (الشكل 4A). وحضنت هذه اللوحات لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة والتقط على ماسح ضوئي سرير مسطح. تم إجراء مستعمرة قياس حجم كل متحولة على حد سواء لوحات التجريبية والضابطة باستخدام Balony صورة تحليل محرك 15. البرنامج Balony بحساب نسبة حجم المستعمرات على مجموعة التجريبية مقارنة السيطرة عليها. يكون المستخدم قادرا على تحديد عتبة نسبة وإذا تم تنفيذ الشاشة في ما لا يقل عن ثلاث نسخ سيتم تعيين القيمة ص لكل متحولة. لدينا في المسوخ شاشة التمثيلية التي أظهرت نسبة ≤0.8 تم النظرإد أن تكون الزيارات. ويمكن عرض نتائج القياس الكمي مستعمرة بيانيا عن طريق التآمر نسبة لحجم كل مستعمرة على المحور الصادي وحذف الجينات التي أمر بها موقف مجموعة (الشكل 4B) أو نسبة (الشكل 4C) على محور س.
المرضى الاصطناعية / المسوخ المميتة التي تم تحديدها في الشاشة يمكن تصنيفها استنادا إلى توصيفات وظيفية عن طريق أداء الأنطولوجيا الجينات (GO) التحليل. هناك العديد من الأدوات المتاحة علنا لتحليل GO قوائم S. الجينات الخباز. بما في ذلك Funspec 21، قاعدة بيانات DAVID المعلوماتية الحيوية 22،23، وقاعدة بيانات الجينوم الخباز (SGD) العودة الأجل الباحث 24. واستخدمت الحذف الجينات التي لديها نسبة أقل من أو يساوي 0.8 في شاشة 5-FU بوصفها قائمة المدخلات لFunspec. يقبل Funspec قائمة بأسماء الجينات الخميرة منهجية أو المشتركة والنواتج ملخصات أنطولوجيات الجينات، والتصنيفات الوظيفية، التعريب، مجمعات البروتين وكذلك بعد التمديدلها التصنيفات المفيدة التي يتم إثراء في تلك القائمة. وأظهرت الشاشة تمثيلية بإجراء إثراء أنطولوجيات لعملية التمثيل الغذائي RNA، بما في ذلك الحمض الريبي النووي النقال التذبذب، وتعديل يوريدين والآلات المراقبة RNA، واستجابة لأضرار الحمض النووي (الجدول 1). هذه النتائج تتفق مع الدراسات السابقة التي أظهرت 5-FU النتائج العلاج في تراكم مذيل بعديد الأدينيلات الرنا غير المكودة، والتي يتم تجهيزها من قبل النووية TRF / Rrp6 / الهواء / Mtr4 تذييل بعديد الأدينيلات (TRAMP) exosome 25. وبالتالي هذه النتائج متفقة مع شاشات السابقة الوراثية الكيميائية وآلية معروفة من 5 FU النشاط الحيوي 8،19.
كما هو الحال مع جميع الإنتاجية العالية النهج الجينومية الوظيفية فمن الضروري للتحقق من صحة النتائج. للتحقق من صحة التفاعلات الوراثية المسوخ الخميرة الكيميائية ينبغي أولا التحقق من صحة PCR مع الاشعال أن يصلب في مروج الجين الهدف وKANMX تعطل الكاسيت. اختيار سلالات لصالحةأوجه هو إجراء تعسفي إلى حد ما، ولكن إعطاء الأولوية المسوخ التي تظهر النمط الظاهري قوي ومجموعة يوفر ظيفيا نقطة انطلاق جيدة. وبعد ذلك، يتم تأكيد فرط الحساسية لمادة كيميائية تستخدم اكتشاف المقايسات، نهج مشترك لقياس اللياقة البدنية من المسوخ الخميرة. تحقيقا لهذه الغاية، ورصدت التخفيفات المسلسل من سلالات الخميرة في شبكة على وسائل الإعلام التي تحتوي على جرعة الكيميائية المناسبة فضلا عن السيطرة. وكمثال على ذلك، نؤكد على التفاعل الوراثي الكيميائي لل5-FU مع air1 وtrf5 المسوخ من مجمع TRAMP (الشكل 5). هذه الجينات ترميز مكونات exosome النووية TRAMP. ونلاحظ أن سلالة rrp6، تفتقر إلى جوهر 3'-5 'النشاط نوكلياز خارجية من TRAMP، فقد في كثافة عالية لجمع DMA مختبر لدينا. على الحصول على متحولة rrp6 الطازجة نؤكد أن rrp6 و5-FU أيضا عرض التفاعل الوراثي الكيميائي، وإنشاء مطلوب أن النشاط TRAMP على تحمل 5-FU. وهذا يوضحأن سلامة مجموعات الحذف كبيرة قد تصبح عرضة للخطر مع مرور الوقت، مما يجعل صيانة DMA المناسبة والتحقق من صحة سلالة حرجة.
حدد الشاشة لدينا أيضا طفرات في عدة إنزيمات إصلاح الحمض النووي (بما في ذلك rad50، rad52 وmre11) كما 5-FU الحساس. التهديف من حجم مستعمرة أشار اللياقة البدنية النسبية لهذه المسوخ على 10 ميكرومتر 5-FU 0.7، 0.65، و 0.42 مقارنة نوع البرية. استنادا لدينا فحوصات اكتشاف التأكيدي (الشكل 5)، وهذه القيم هي أقل من الواقع الأرجح بسبب النطاق الديناميكي محدود من قياس اللياقة البدنية عن طريق حجم مستعمرة التهديف. هذا يسلط الضوء على السبب الثاني لتأكيد التفاعلات التي كتبها اكتشاف التسلسلي بشكل مستقل: حجم بعض التفاعلات الكيميائية الوراثية يمكن الاستهانة بها في تحليل البيانات الأولية. وتوضح نتائجنا أن شاشة الوراثية الكيميائية القائم على النمو يؤديها مع ~ 4،800 سلالة جمع الحذف فرداني، في ثلاث نسخ، وتقدم RESOL كافية ution لعزل بثقة تفاعلات محددة الوراثية الكيميائية.
الشكل 1: تمثيل تخطيطي من التفاعلات الكيميائية الحذف الوراثية الجينات التي تؤدي إلى فرط الحساسية للاضطراب كيميائي تسمح لتحديد العمليات البيولوجية التي يستهدفها مادة كيميائية. مسارات (A) متقاربة يمكن أن تتعطل إما عن طريق حذف الجينات (geneA) أو كيميائيا (geneB). فردي، هذه الإهانات الخلوية يمكن السكوت بسبب التكرار الكامنة في المسارات البيولوجية. ومع ذلك، في تركيبة بقاء الخلية للخطر الناتج إما في النمط الظاهري المرضى صناعيا أو قاتلة. (ب) حذف الجينات (geneC) حاسمة لتخفيف الاجهاد الناجم كيميائيا أيضا أن يسبب فرط الحساسية وتشير مسارات بيولوجية تعطلت بسبب المعالجة الكيميائية. jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: سير العمل للشاشة الوراثية الكيميائية (A) تحديد جرعة الفرعية المثبطة: تزرع سلالات الخميرة الأبوية إلى مرحلة ثابتة، المخفف 1: 5،000، وانتشار مطلي على وسائل الإعلام YEPD الصلبة التي تحتوي على زيادة جرعة كيميائية. يتم تحديد أعلى تركيز عدم وجود تثبيط نمو أكبر من 10-15٪ لفحص ضد DMA. (B) منهجية شاشة الوراثية الكيميائية: استخدام مجموعة والإنتاجية العالية تعلق الروبوت وS. الخباز DMA هو نسخة مطلي على وسائل الإعلام التي تحتوي على تركيز مناسب من اختبار كيميائي. يتم تحضين لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 24-48 ساعة، تصوير، والنسبي حجم مستعمرة تحديدها.المرجع = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig2highres.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3) :. تحديد تركيز الفرعي التثبيطي. (A) نمو BY4741 الخلايا على وسائل الاعلام الصلبة تحتوي على 5-fluouracil. الثقافة المشبعة BY4741 المخفف 1: 5،000 ومطلي على زيادة تركيزات 5-فلورويوراسيل. منحنى (B) نمو BY4741 الخلايا في وسائل الإعلام السائلة تحتوي على 5-flurouracil. ~ ترسبت 4 × 10 4 خلايا في ثلاث نسخ في زيادة تركيزات 5-FU والمواد المستنفدة للأوزون تم قياس كل 10 دقيقة لمدة 22 ساعة.
الشكل 4: شاشة الوراثية الكيميائية لل5-فلورويوراسيل. (A) S. الخباز حذف متحولة مجموعة تكرارها على YEPD أجار تحتوي على 10 ميكرومتر 5-FU (يمين) والسيطرة DMSO (يسار). (ب) نتائج شاشة الوراثية الكيميائية: النمو النسبي للطفرات في 10 ميكرومتر 5-FU مقارنة السيطرة DMSO التي أمر بها موقف مجموعة. (C) النمو النسبي للطفرات في 10 ميكرومتر 5-FU مقارنة السيطرة DMSO التي أمر بها نسبة حجم مستعمرة. وأشار عتبة نسبة ≤0.8 على كل من الرسوم البيانية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التحقق من التفاعلات الكيميائية الوراثية. التخفيفات المسلسل من عدة سلالات متحولة معزولة نمت بشأن مكافحة DMSO (A)، و 10 ميكرومتر 5-FU (
| GO الفئة | P ذات القيمة | الجينات التي تم تحديدها (زيارة) | # الزيارات | إجمالي # من الجينات في GO الفئة |
| الحمض الريبي النووي النقال تعديل يوريدين تمايل [GO: 0002098] | 2.24 × 10 -6 | SIT4 NCS6 URM1 KTI12 IKI3 TUM1 ELP3 | 7 | 24 |
| النسخ، والتي تعتمد على الحمض النووي [GO: 0006351] | 1.69 × 10 -5 | PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 RPA14 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDS3 MET18 CTK2 RPB4 SWI3 RPA12 KTI12 ASH1 SWI6 IKI3 GCR2 POP2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 | 32 | 540 |
| الترجمة [GO: 0006412] | 4.28 × 10 -5 | RPL19B RPS11B FES1 RPS9B RPL31A RPL24A RPL7A RPS25A RPL26B RPL11B RPL27A RPL34B RPL14A TEF4 RPS29A RPL6A AEP1 RPS16A MRP7 RPS19B RPS19A RPS7A | 22 | 318 |
| الحمض الريبي النووي النقال موقف تمايل يوريدين thiolation [GO: 0002143] | 1.88 × 10 -4 | NCS6 URM1 TUM1 | 3 | 5 |
| تنظيم النسخ، والتي تعتمد على الحمض النووي [GO: 0006355] | 4.98 × 10 -4 | PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDS3 SWI3 KTI12 ASH1 SWI6 IKI3 GCR2 POP2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 | 27 | 507 |
| البروتين urmylation [GO: 0032447] | 6.33 × 10 -4 | NCS6 URM1 URE2 | 3 | 7 |
| تصدير مرنا من نواة في استجابة للإجهاد الحراري [GO: 0031990] | 2.04 × 10 -3 | RPB4 NUP120 NUP133 | 3 | 10 |
| تذييل بعديد الأدينيلات التي تعتمد النووي CUT عملية تقويضي [GO: 0071039] | 2.04 × 10 -3 | AIR1 TRF5 MPP6 | 3 | 10 |
| عملية التمثيل الغذائي التربتوفان [GO: 0006568] | 2.15 × 10 -3 | TRP5 TRP3 | 2 | 3 |
| دخلول؛ جسيم داخلي في وقت مبكر من وسائل النقل جولجي [GO: 0034498] | 2.75 × 10 -3 | ENT5 TCA17 RCY1 | 3 | 11 |
| الريباسي صغيرة نشوء حيوي فرعية [GO: 0042274] | 3.63 × 10 -3 | SAC3 LTV1 RPS19B RPS19A | 4 | 24 |
| تعديل الكروماتين [GO: 0016568] | 3.64 × 10 -3 | LDB7 HIR1 SPT7 NGG1 SPT3 SDS3 ASH1 SGF11ELP3 | 9 | 114 |
| عملية التمثيل الغذائي ATP [GO: 0046034] | 4.23 × 10 -3 | VMA2 VMA1 | 2 | 4 |
| فجوي والنقل بروتون V-نوع أتباز التجمع معقدة [GO: 0070072] | 4.23 × 10 -3 | VMA21 VPH2 | 2 | 4 |
| كروموسوم التعريب [GO: 0050000] | 4.23 × 10 -3 | NUP120 NUP133 | 2 | 4 |
| النقل مرنا [GO: 0051028] | 4.59 × 10 -3 | DHH1 SAC3 LOC1 KAP114 NUP120 NUP133 | 6 | 58 |
| تحمض فجوي [GO: 0007035] | 4.89 × 10 -3 | VMA2 VMA1 VMA5 VPH2 | 4 | 26 |
| تصدير الريباسي من نواة [GO: 0006407] | 5.63 × 10 <سوب> -3 | NUP120 NUP133 RPS19B RPS19A | 4 | 27 |
| الإلتقام [GO: 0006897] | 6.57 × 10 -3 | SLA1 EDE1 CDC50 ART5 RCY1 VPS1 END3 | 7 | 82 |
| مراقبة مرنا النووية لمعالجة مرنا 3'نهاية [GO: 0071031] | 6.92 × 10 -3 | AIR1 MPP6 | 2 | 5 |
| ncRNA تذييل بعديد الأدينيلات [GO: 0043629] | 6.92 × 10 -3 | AIR1 TRF5 | 2 | 5 |
| تذييل بعديد الأدينيلات التي تعتمد النووي عملية تقويضي snoRNA [GO: 0071036] | 6.92 × 10 -3 | AIR1 TRF5 | 2 | 5 |
| تذييل بعديد الأدينيلات التي تعتمد النووي عملية تقويضي snRNA [GO: 0071037] | 6.92 × 10 -3 | AIR1 TRF5 | 2 | 5 |
| عملية السكروز التربتوفان [GO: 0000162] | 6.92 × 10 -3 | TRP5 TRP3 | 2 | 5 |
| البروتين الإدراج في غشاء ER [GO: 0045048] | 6.92 × 10 -3 | GET1 GET4 | 2 | 5 |
| استقرار مرنا [GO: 0048255] | 6.92 × 10 -3 | ATP25 IGO1 | 2 | 5 |
| ردا على الحمض النووي من التلف التحفيز [GO: 0006974] | 7.05 × 10 -3 | MUS81 RAD2 MET18 CTK2 RPB4 GRR1 DEF1 MMS22 RAD52 MRE11 RAD50 RMI1 | 12 | 197 |
| GO الفئة | P ذات القيمة | الجينات التي تم تحديدها (زيارة) | في "> # الزياراتإجمالي # من الجينات في GO الفئة | |
| تذييل بعديد الأدينيلات التي تعتمد النووي عملية تقويضي الريباسي [GO: 0071035] | 8.46 × 10 -3 | AIR1 TRF5 MPP6 | 3 | 16 |
الجدول 1: الأنطولوجيا الجينات (GO) توصيف 5 فلورويوراسيل المسوخ الحساسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المبين هنا هو نهج لتوليد ملامح التفاعل الكيميائي الوراثية. وطريقة بسيطة: من خلال مقارنة أحجام مستعمرة من كل سلالة في مجموعات الحذف الجين شاملة في وجود وعدم وجود مادة كيميائية، ويتم تحديد جميع الجينات اللازمة لتحمل إهانة الكيميائية. ويمكن بعد ذلك استخدام تحليل تخصيب الشرح من القائمة الناتجة من سلالات حساسة لتوفير نظرة ثاقبة وضع المواد الكيميائية للعمل. في حين تم تحسين هذا البروتوكول لفي مهدها الخميرة، فإنه يمكن أيضا أن تتكيف للاستخدام مع غيرها من المجموعات المحتشدة حذف الميكروبية، مثل E. جمع القولونية كيو، والتي تم استخدامها بنجاح للتحقيق في مئات من الاضطرابات الخلوي 26،27.
وراسخة التنميط والكيميائية الوراثية في الخميرة والكائنات الحية الأخرى. وقد اعتمدت معظم هذه الدراسات على المقايسات المنافسة التي تجمع تحديد طفرات الحذف من خلال تحليل ميكروأري أو الإنتاجية العالية sequencing من الباركود جينية فريدة. وقد أثبت هذا النهج الناجح في انتاج لمحات من المواد الكيميائية وراثية قوية المكتبات الكيميائية الكبيرة. منهجية الموصوفة هنا يوفر بديلا مفيدا للتحليل الكيميائي الوراثية لعدد أقل من المركبات الاختبار. يوفر الفحص قراءات البسيطة التي هي أقل تكلفة باهظة من التسلسل الإنتاجية العالية أو تحليل ميكروأري ولا تعاني من التحيز التسلسل. في حين أن البروتوكول على النحو المبين يتطلب أداة الروبوتية للتلاعب مستعمرة، مثل هذه النظم أصبحت أكثر بأسعار معقولة، وبالتناوب بروتوكول يمكن تعديلها للاستخدام مع أدوات التدبيس اليدوية، والأمثلة التي أدرجت في قائمة المواد.
من المهم أن يكون على بينة من القيود المفروضة على هذا النهج والتنميط الجيني الكيميائية بشكل عام. أولا، يجب أن يكون المجمع تأثير على جدوى في مهدها الخميرة، أو كائن محدد يجري استخدامها. بينما العديد من العمليات البيولوجية الأساسيةوظائف وحفظها جيدا بين حقيقيات النوى، قد تختلف كائن التفاعلات الكيميائية المحددة الوراثية على نطاق واسع، وكذلك امتصاص المواد الكيميائية في الخلايا. كما تجدر الإشارة إلى أن عدة سلالات الحذف وقد وجد أن تكون حساسة للعلاجات الدوائية متعددة 8. وتشمل هذه الجينات المسؤولة عن هروب رأس المال المخدرات، وظيفة فجوي، وسلامة الغشاء. من المهم أن تأخذ في الاعتبار المقاومة للعقاقير المتعددة عند اتخاذ الاستنتاجات فيما يتعلق مباشرة وغير مباشرة وسائط للعمل.
تم تنفيذ الشاشة الموضحة هنا باستخدام مجموعة الحذف فرداني، نهج مشترك لتحليل الكيميائي الوراثية في الخميرة. هناك الآن مجموعات متعددة من المسوخ الخميرة المتاحة لمزيد من المساعدات في تحديد وضع مركب كيميائي للعمل. هذا لا يشمل فقط متماثل الكامل ومتخالف مجموعات الحذف مضاعفا، ولكن أيضا مشروطة المسوخ الجينات الأساسية حساسة للحرارة، وDecreASED وفرة من مرنا التشويش (الخام) الخميرة مكتبة متحولة، وهيستون H3 H4 الاصطناعية وجمع متحولة، والتي يمكن استخدامها لتحقيق جينية العلاجات الجزيئية أساس 3،4،28، نظرا لعمق لا تصدق من الأدوات المتاحة، وسهولة هذه المنهجية، والبنية التحتية المطلوبة محدودة، ويوفر هذا النهج شكل يسهل الوصول إليها للوصول إلى المعلومات وظيفية غنية فيما يتعلق بآلية مركب كيميائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ويدعم البحوث في المختبر CJN من المنح التي تعمل من NSERC، المعهد الكندي للسرطان جمعية أبحاث (CCSRI)، والثدي المؤسسة الكندية للسرطان (فرع BC-يوكون).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v) |
| Tyrptone Powder | BD Biosciences | 211820 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| Dextrose | Anachemia | 31096-380 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) — do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving. |
| Agar A | Bio Basic | FB0010 | For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| G418 | A.G. Scientific Inc. | G-1033 | Prepare 1,000x stock at 200 mg/ml in dH2O and filter sterilize. |
| 12-well plate | Greiner Bio One | 655180 | |
| 5 ml culture tubes | Evergreen Scientific | 222-2376-080 | |
| 10 cm Petri Dish | VWR | 25384-302 | |
| ROTOR HDA | Singer Instruments | ROT-001 | high-throughput microbial array pinning robot |
| PLUSPLATE© Petri Dish | Singer Instruments | PLU-001 | Box of 200 dishes |
| 384 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-384 | Box of 1,000 pads |
| 1536 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-1536 | Box of 1,000 pads |
| Alternative Pinning Tools: | |||
| Fully Automated Robtic Systems | S&P robotics | http://www.sprobotics.com | Several automated colony handling robitic and imagining systems available. |
| Manual Pinning Tools | V&P Scientific | http://www.vp-scientific.com | Handheld replication tools and accessories. |
References
- Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
- Winzeler, E. A., et al. Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science. 285, 901-906 (1999).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5, 711-718 (2008).
- Li, Z., et al. Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants. Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).
- Parsons, A. B., et al. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Parsons, A. B., et al. Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast. Cell. 126, 611-625 (2006).
- Hillenmeyer, M. E., et al. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320, 362-365 (2008).
- Hillenmeyer, M. E., et al. Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action. Genome Biol. 11, R30 (2010).
- Smith, A. M., et al. Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries. J Vis Exp. (54), (2011).
- Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides. Organic & Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).
- Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast. BMC Chem Biol. 10 (6), (2010).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).
- Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).
- Young, B. P., Loewen, C. J. Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments. BMC Bioinformatics. 14, 354 (2013).
- Wagih, O., et al. SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens. Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).
- Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data. BMC Bioinformatics. 11, 353 (2010).
- Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. 5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies. Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).
- Lum, P. Y., et al. Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes. Cell. 116, 121-137 (2004).
- Toussaint, M., Conconi, A. High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents. Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).
- Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast. BMC Bioinformatics. 3, 35 (2002).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).
- Hong, E. L., et al. Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods. Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).
- Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. 5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs. Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol. 2, 0008 (2006).
- Nichols, R. J., et al. Phenotypic landscape of a bacterial cell. Cell. 144, 143-156 (2011).
- Dai, J., et al. Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants. Cell. 134, 1066-1078 (2008).
