Abstract
Terapeutiska och mekanistiska studier av presynaptiskt riktade klostridie neurotoxiner (cnts) har begränsats av behovet av en skalbar, cellbaserad modell som producerar fungerande synapser och genomgår fysiologiska reaktioner på berusning. Här beskriver vi en enkel och robust metod för att effektivt skilja murina embryonala stamceller (EKSG) till definierade härstamningar av synaptically aktiva, nätverks nervceller. Efter en 8 dagars differentiering protokoll, mus embryonala stamcells-härledda neuron (ESNs) snabbt uttrycka och compartmentalize neurotypic proteiner, bildar neuronala morfologier och utveckla inneboende elektriska svar. Genom 18 dagar efter differentiering (DIV 18), ESNs uppvisar aktiv glutamaterg och γ-aminosmörsyra (GABA) erga synapser och framväxande nätverks beteenden som kännetecknas av en excitatorisk: inhiberande balans. För att avgöra om förgiftning med cnts motverkar funktionellt synaptiska neurotransmission och därmed replikerar the in vivo patofysiologi som ansvarar för kliniska manifestationer av botulism eller stelkramp, var helcells-patch clamp elektrofysiologi används för att kvantifiera spontana miniatyr excitatoriska postsynaptiska strömmar (mEPSCs) i ESNs exponerats för tetanus neurotoxin (tält) eller botulinum-neurotoxin (BoNT) serotyper / A- / G. I samtliga fall ESNs uppvisade nästan fullständig förlust av synaptisk aktivitet inom 20 timmar. Berusade nervceller förblev livskraftig, vilket framgår av oförändrade vilande membranpotentialer och inneboende elektriska svar. För att ytterligare karakterisera känsligheten hos denna metod, var dosberoende effekter berusning på synaptisk aktivitet uppmätt 20 timmar efter tillsats av BoNT / A. Berusning med 0,005 pM BoNT / A resulterade i en signifikant minskning i mEPSCs, med en median hämmande koncentration (IC 50) av 0,013 pM. Jämförelser av median doser indikerar att funktionella mätningar av synaptiska inhibition är snabbare, mer specifika och känsligare än SNAREspalt analyser eller analys musen dödlighet. Dessa data validera användningen av synaptically kopplade, stamcellsderiverade neuroner för mycket specifika och känslig detektion av cnts.
Introduction
Det övergripande målet med denna metod är att funktionellt utvärdera synaptisk aktivitet i nätverkskulturer av stamcellsderiverade neuroner utsätts för klostridie nervgifter. Detta är den första demonstrationen av en in vitro härledd modell som funktionellt replikerar pathophysiologies ansvarar för kliniska manifestationer av botulism och validerar ESNs som en lämplig modell för detektering av cnts, terapeutisk screening och mekanistiska studier.
BoNTs är mycket dödliga bakterieneurotoxiner producerade av medlemmar av Clostridium arter. Inklusive den nyligen föreslagna BoNT / H, har åtta antigen distinkta BoNT serotyper beskrivits (/ A- / H) 1,2. Alla serotyper är uttryckta som 150 kDa peptider som är post-translation nicked att producera en dichain sammansatt av en 100 kDa tung kedja (HC) och en 50 kDa lätt kedja (LC) förenade genom en disulfidbindning 3. HC medierar bindning till presynaptiska receptorer och entry av toxinet in i neuron via synaptiska endocytos. Under endosomal bearbetning, HC genomgår strukturella omorganisation för att bilda en por i vesikelmembranet, lätta sloka av LC i presynaptiska cytosolen. LC då specifikt riktar och klyver lösliga N -ethylmaleimide känsliga fusionsfästproteinreceptor (Snare) proteiner i presynaptiska facket: SNAP-25 (BoNT / A, / C, / E), VAMP2 (BoNT / B, / D, / F, / G) eller syntaxin (BoNT / C) 1. Klyvning av något av dessa SNARE proteiner förhindrar montering av den synaptiska exocytos maskiner, och därigenom blockera neurotransmittorfrisättning. Denna kombination av effektiv neuronal inriktning och presynaptiska lokalisering gör BoNTs de mest potenta gifter kända, med beräknade mänskliga dödliga doser så låga som 0,1-1 ng / kg 1.
Biokemiska analyser kan användas för att detektera närvaron av eller aktiviteten hos CNT LCs med hög känslighet. Men dessa metoder misslyckas till Interrogate förmåga toxinet att binda, ange, aktivera och funktion inom nervceller, och därför är indirekta och eventuellt vilseledande mått på förekomst av aktiva toxin. Däremot funktionella analyser av berusning såsom analys musen dödlighet (MLA) utvärdera övergripande förmåga cnts att framgångsrikt förhandla om alla faser av upptag och aktivering, vilket ger mer relevanta och specifika bedömningar av toxinaktivitet. Medan MLA är guldstandarden BoNT upptäckt, det är en in vivo-metod som använder döden som en slutpunkt och har därför begränsad användbarhet som forskningsplattform. Försök att utveckla cellbaserade modeller av CNT berusning lämplig för mekanistiska studier och terapeutiskt screening har också drabbats betydande begränsningar. Medan primära neuron kulturer erbjuder en hög grad av fysiologisk relevans, är deras användning kompliceras av ett antal faktorer, inklusive höga resurskostnaden, relativt låg avkastning, förekomsten av flera neuronala subtyper och omfattande tillsyn rättsliga och administrativa involverad med djuranvändning. Som ett alternativ till primära neuroner, har neurogena cellinjer (som kan induceras att anta neuron liknande egenskaper genom kemisk stimulering) såsom neuroblastom och adrenal kromaffinceller använts som in vitro-modeller av berusning. Eftersom dessa celler är ständigt odlade före induktion, de är mycket skalbar och därför väl lämpad för måttlig genomströmning tillvägagångssätt. Dock är deras relevans ifrågasättas eftersom inducerade fenotyper är typiskt heterogena, är dåligt känsliga för cnts och misslyckas med att uppvisa kritiska neuronala beteenden, inklusive oförmåga att bilda pre- och postsynaptiska fack som monterar in fungerande synapser 4. I avsaknad av fysiologiskt intakta presynaptiska fack, hela skalan av toxin: kan neuron interaktioner inte replikeras och därför funktionella mätningar av berusning är inte möjliga 5. Ingent överraskande, försök att genomföra mekanistiska studier eller drogscreening för BoNTs använder inducerade neurogena cellinjer har resulterat i fynd som är oförenliga med in vivo och primära neuron studier 6.
Det har föreslagits att stamcells härrörande centrala nervsystemet (CNS) nervceller kan ge en nästa generations cellbaserad plattform för BoNT forskning som kombinerar relevansen av primära nervceller med flexibiliteten hos odlade cellinjer 7-10. I synnerhet har mus stamceller härrörande neuron (ESNs) visat sig vara mycket känslig för fysiologiska doser av BoNT / A- / G och att replikera många in vivo svar på berusning, inklusive differential persistences, förbättrad aktivitet berusning och serotyp -specifika potenser 5,8,11. Dessa beteenden tyder på att in vivo mekanismer BoNT upptag, bearbetning, handel och aktivitet är bevarade i ESNs. Emellertid hämning av synaptisk Activity är signaturen manifestation av botulism, och därmed visar en förlust av synaptisk aktivitet efter förgiftning av cnts är nödvändig innan den drog slutsatsen att ESNs är en lämplig in vitro härrör cellbaserad modell för CNT studier.
För att mäta effekterna av förgiftning med cnts på synaptisk aktivitet, var hel-cell patch-clamp elektrofysiologi används för att kvantifiera monosynaptic strömmar i vehikelbehandlade eller CNT-behandlad DIV 21 + ESNs. Vi fann att förgiftning av ESNs med BoNT / A / G eller tält orsakade> 95% förlust av synaptisk aktivitet inom 20 h i samtliga fall. Ytterligare karakterisering genomfört 20 timmar efter intoxikation med BoNT / A avslöjade en dosberoende effekt på synaptisk aktivitet, med en detektionsgräns under 0,005 pM och ett IC50 värde på 0,013 pM. Dessa fynd tyder på att känsligheten och tidsramen för elektro upptäckt av berusning är avsevärt förbättrats under jämförbara immunoblot baserade analyserar av SNAP-25 klyvning och i analyser vivo musen dödlighet, som visar att funktionella mätningar av berusning i synaptically aktiva neuron kulturer kan underlätta mer känsliga, specifika och snabba metoder för att karakterisera cellulära svaret på BoNT.
Protocol
1. Anpassning av ekonomiska och sociala råd att matarcellfria Suspension Kultur
- Tina ESCs vid 37 ° C tills en flisa av is återstår.
- Med hjälp av en P1000 pipett försiktigt överföra 1-2,5 x 10 6 dissocierade ekonomiska och sociala råd till en icke-vävnadskultur-behandlade skål innehållande 10 ml förvärmda ESC-medium. Inkubera i en fuktad vävnadskulturinkubator under 20 h vid 37 ° C och 5% CO2.
- Efter 20 timmar, tvätta cellerna genom att försiktigt överföra suspensionskultur till en 15 ml koniska rör med hjälp av en 10 ml serologisk pipett. Pellet ESCs under 3 min vid 200 x g. Under spinn, tillsätt 10 ml färskt ESC medelhög till låg friktion skålen.
- Sug ut supernatant, för att ta hand undvika att rubba cellpelleten, och tillsätt 1 ml färskt ESC medium till cellpellet. Överför celler till den bakteriella skål med en P1000 pipett och återgå till inkubatorn.
- Observera celler dagligen tills aggregat blir synliga för blotta ögat (vanligen 4-8 dagar (d); aggregat blir 0,2- 0,5 mm). Om aggregat inte uppenbar efter 4 d, upprepa steg 1.3. När aggregat är synliga, dissociera och underhålla ekonomiska och sociala råd som beskrivs i avsnitt 2.
2. ESC Pass och underhåll
- Överför ESC aggregat till en 15 ml koniska rör med en steril 10 ml pipett och tillåta aggregat för att lösa till en kompakt pellet (vanligtvis 3 - 5 min). Sug supernatanten, var noga med att inte störa cellpelleten, och tvätta aggregat med 5 ml PBS. Fastän gravitationssedimente rekommenderas, alternativt pellets celler vid 100 xg under 2,5 minuter istället för att spara tid.
- Sug PBS och tillsätt 500 l trypsin. Inkubera aggregat i trypsin under 3 min i ett vattenbad vid 37 ° C. Tillsätt 500 l ESC medium för att späda ut trypsin och försiktigt mal sönder 10 gånger med en P1000 pipett för att bryta upp aggregat. Räkna celler med användning av en hemocytometer.
- Pellets dissocierade cellerna under 3 min vid 200 xg och återsuspendera cellerna till en slutlig koncentration av 1,0x 10 7 celler / ml i ESC medium. Överför 150 l (1.5 x 10 6 celler) till 10 ml färskt ESC-medium i en 10 cm bakteriell skålen och återgå till vävnadsodling inkubator för 48 timmar. Överskott ekonomiska och sociala råd kan differentieras, frysförvarade på 1-5 x 10 6 celler / ml i 90% ESC-medium kompletterat med 10% DMSO, eller kasseras.
- Passage aggregerar varje 48 h. Aggregat klara för passage kommer synas tydligt, med diametrar på över 0,5 mm.
OBS: Upptining och kultur frysförvarade, fjädring anpassade celler uppnås per steg 1,2-1,4. Aggregat kommer att vara redo för passage inom 48-72 timmar.
3. neuronal differentiering
OBS: Conduct steg 3,1-3,5 före middagstid och steg 3,7 efter kl. En översikt av de differentierings förfaranden presenteras i Figur 1A.
- Dissociera ekonomiska och sociala råd som i steg 2,1-2,5. Överför 350 l (3,5 x 10 6) av dissocierad ekonomiska och sociala råd till en 10 cm låg fästskål innehållande 25 ml differentiering medium. Placera på en orbital skakanordning inställd på 30 - 45 rpm inuti en vävnadsodlingsinkubator vid 37 ° C med 5% CO2. Detta är den första dagen av differentiering, benämnd dag in vitro (DIV) -8.
OBS: Användning av en extremt låg fäst skålen ökar kostnaderna för metoden, men ger något större avkastning än bakteriella petriskålar eftersom aggregat ibland kan ansluta sig till petriskålar. Om olika skålstorlekar är att föredra, kan medel volymer och cellantal skalas därefter. - Efter 48 timmar (DIV -6), använd en 25 ml pipett för att överföra de differentierande cellaggregat till en 50 ml koniska rör. Omedelbart tillsätt färsk 25 ml differentieringsmedium till petriskål.
- Låt aggregat att bosätta över 2-5 minuter, vilket ger en synlig pellet som är 1 - 2 mm djup. Ignorera enskilda celler eller små aggregat kvarstår i suspension. Försiktigt aspirera på medellång och överföra cell pellets tillbaka till petriskål med en P1000. Placera på rotationsskakapparat i en vävnadskultur inkubator.
- Vid DIV -4 upprepa steg 3.2. Pelleten blir 2-4 mm djup. Ersätt 30 ml differentieringsmedium kompletterat med 6 pM all-trans-retinoinsyra (RA) och petriskålen. Återgå till rotationsskak i vävnadsodlingsinkubator under ytterligare 48 h.
- Vid DIV -2 upprepa steg 3.3. Pelleten blir 4-8 mm djupt på denna punkt.
- Vid DIV -1, förbereda plating ytor som i avsnitt 4.
- Vid DIV 0, tina 5 ml av pre-alikvoteras och frysta NPC trypsinization medium vid 37 ° C under 5 - 10 min och placera i en vävnadskultur huva. Med hjälp av en 25 ml pipett, överföring differentiera aggregat till en 50 ml koniska rör. Låt aggregat för att bosätta sig och försiktigt aspirera medium. Tvätta pellets två gånger med 10 ml PBS, vilket gör aggregaten att bosätta mellan tvättar.
- Efter den andra PBS tvätt, tillsätt 5 ml NPC trypsinization medium till pelleten och inkubera vid 376; C under 5 min. Flick försiktigt röret efter 2,5 minuter.
- Tillsätt 5 ml 0,1% sojaböntrypsininhibitor (STI) för att inaktivera trypsin och blanda genom att vända. Mal sönder försiktigt 10 - 15 gånger med en 10 ml serologisk pipett tills en relativt homogen cellsuspension produceras.
- Långsamt överför cellsuspensionen till en 40 | im eller 70 | im cellfilter placeras i toppen av en 50 ml koniskt rör. När all suspensionen har filtrerats, tillsätt 1 ml N2-medium för att tvätta återstående cellerna genom filtret och pelletera dissocierade cell suspension 6 min vid 200 x g.
- Aspirera medium utan att störa pelleten. Tvätta cellerna två gånger med 10 ml N2-medium, pellete celler under 5 minuter vid 200 xg och triturering mellan tvättar med en P1000. Före den andra tvättningen, räkna celler med hjälp av en hemocytometer.
- Resuspendera cellerna i N2-medium vid en x 10 7 celler per ml och platt ESNs vid en celltäthet av 150000 - 200000 celler / cm 2.
- Överför nyligen plated ESNs till en fuktad vävnadsodling inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 och underhålla som i avsnitt 5.
4. Förbereda Kultur Ytor för Plating Neural prekursorer vid DIV 0
- Förbered vävnadskulturbehandlade rätter minst 1 dag före plätering. Tillsätt tillräcklig mängd polyetylenimin (PEI; 25 | ig / ml i sterilt H2O) eller poly-D-lysin (PDL, 100 | ig / ml i sterilt H2O) för att täcka vävnadsodlingsbehandlade plastskålar och inkubera O / N vid 37 ° C.
- Morgonen plätering, diska två gånger med dubbeldestillerat H2O och en gång med PBS. Efter den slutliga tvätten, tillsätt tillräckligt med N2-medium för att täcka skålen (t.ex., 1 ml per brunn i en 12-brunnsskål eller 4 ml per 6 cm skål).
- Förbered 18 mm täckglas minst en dag före neuron plätering. Rena täck av plasma-rengöring för 4 min.
- Överför omedelbart rengjorda täckglas till en etanoltvättad parafilm i botten av enstor steril skål och tillsätt 400 ìl av PEI eller PDL-lösning, beredd som i steg 4.1. Inkubera O / N vid 37 ° C i en vävnadsodlingsinkubator.
- På morgonen, täckglas tvätta tre gånger med vatten och tillsätt 5 | ig / ml laminin i PBS under 1-3 h vid 37 ° C. Innan dissociation nervceller, aspirera laminin och omedelbart överföra täck till en brunn på en 12-väl skål innehållande 1 ml NPC-medium, att se till att hålla den behandlade sidan uppåt.
- Store rätter och täckglas vid 37 ° C tills NPC är redo att plätera.
5. Underhåll av nervceller
- Vid DIV 1, aspirera medium och ersätta med N2 odlingsmedium.
- Vid DIV 2 och 4, aspirera medium och ersätta med B27 odlingsmedium.
- Vid DIV 8, för att aspirera medium och ersätta med B27 odlingsmedium som innehåller mitosinhibitorer eliminera förorenande icke-neuronala celler.
- Vid DIV 12, ersätt med B27 odlingsmedium.
- Ta inte bort DIV12 + ESNs från 5% CO2 tills den ska användas.
6. Uppmätt Hämning av Synaptic Transmission (MIST) analys för att kvantifiera Miniatyr excitatoriska postsynaptiska Strömmar
VARNING: klostridie neurotoxiner är de mest giftiga ämnen som är kända, med beräknade människa LD 50 värden så låga som 0,1-1 ng / kg. Skaffa nödvändiga tillstånd innan du använder dessa toxiner och vidta lämpliga försiktighetsåtgärder.
- Späd försiktigt BoNT / A till 100x den önskade slutkoncentrationen i ESN odlingsmedium och värm till 37 ° C. Lägg lämplig volym av toxin till div 21 + ESN kulturer, snurra kulturen skålen, och återgå till inkubatorn.
- Om celler kommer att analyseras mer än 4 h efter berusning, lägg toxin till skålen och virvel utan att avlägsna från 5% CO 2, såsom direkt i inkubatorn eller i ett konstant CO 2 kammare.
- Vid lämplig tidpunkt, Aspirate ESN odlingsmedium och tvätta två gånger med extracellulärt inspelning buffert (ERB). Lägg 4 ml ERB kompletterat med 5,0 iM tetrodotoxin och 10 iM bikukullin, blockering aktionspotentialer och motverka GABA A-receptoraktivitet, respektive.
- Överför skålen elektrofysiologi riggen. Varken perfusion eller temperaturkontroll krävs för MIST analysen.
- Dra borosilikatglas med hjälp av en mikropipett avdragare för att producera en inspelning pipett med 5-10 mQ av motstånd och fyll med intracellulära inspelning buffert. Doppa försiktigt fylld inspelnings pipetten med silikon reagens före inspelningen.
- Använda en luftfylld spruta, ger övertryck som inspelnings pipetten sänks ner i ERB. Efter försiktigt landning inspelnings pipetten på soma av neuron som ska spelas in, ta bort övertryck och bildar en gigatätning. Minska innehavet spänningen till -70 mV. Tillämpa undertryck att bryta sig in helcell- konfiguration försiktigt.
- Växla till ström-klämma för att övervaka och registrera vilande membranpotential. Utan justering för flytande kopplingspotentialer kommer vilomembranpotentialen vara mellan -67 till -82 mV.
- Utför en kontinuerlig -70 mV spänningsklämma inspelning för 4-5 minuter för att upptäcka miniatyr excitatoriska postsynaptiska strömmar (mEPSCs).
- Analysera 4 min av inspelade data för mEPSC detektion använder spik upptäckt programvara med följande inställningar: Threshold, 5; Period att söka ett lokalt maximum, 10000 ps; Tid innan en topp för baslinje, 5.000 isek; Period att söka en efterklangstid, 20000 ps; Bråkdel av topp för att hitta en efterklangstid, 0,37; Period genomsnitt en baslinje, 1000 ps; Område tröskel, 20; Antal poäng till genomsnittlig topp, 1; Riktning av topp, negativ.
- Samla och spara information om upptäckta händelser. Dividera antalet upptäckta händelser 4 min med 240 för att bestämma mEPSC frekvensen i Hz.
- Samla mEPSC frekvenser för 8-12 fortsrols och 8-12 BoNT-behandlade prov för varje exponeringsförhållande. Analysera frekvens mot ålders- och partimatchade kontroller. Bestäm den statistiska signifikansen i% hämning av synaptisk aktivitet med användning av en envägs ANOVA testning och Dunnetts post hoc-test.
Representative Results
Vi har utvecklat en differentiering protokoll som möjliggör ekonomisk produktion av stora mängder högren stamcellsderiverade neuroner från mus ekonomiska och sociala råd (i detalj i figur 1A) 8,11. Denna metod har använts under en period av år att reproducerbart differentiera genereras och privat kommersiellt tillgängliga ESC linjer i nervceller i definierade härstamningar 12-14. Kritiska delar av detta protokoll omfattar (1) anpassning av ekonomiska och sociala råd att matarcellfria suspensionskultur; (2) korrekt underhåll av suspensionskulturer; och (3) differentiering i roterande förhållanden. Övergång till suspensionskultur minskar dramatiskt tiden och kostnaden för ESC underhåll, och undanröjer behovet av att avlägsna matar celler före differentiering. Efter fjädring anpassning, är Oct3 / 4 uttryck konsekvent genom minst 30 passager, vilket indikerar att uppskov anpassning ändrar inte uttryck för pluripotens markörer (Figur 1B-D 7 celler per passage. Detta inträffar vanligen inom tio passager som tidigare har inne anpassning eller fem passager efter upptining av ekonomiska och sociala råd som tidigare var fjädring anpassade. Mekanisk rotation differentiera aggregat har också visat sig vara avgörande för ökad neuronal avkastning. Tillsatsen av en rotationsskakare eliminerade superaggregatbildning, ökad aggregat livskraft och producerar en ökning av utbytet av neurala stamceller (NPC) vid DIV 0 (figur 1E) ~ 300%.
En typisk differentiering börjar med 3,5 x 10 6 Ekonomiska och sociala råd vid DIV -8 och producerar 115 x 10 6 NPCs på DIV 0, ungefär 60% av dessa kommer överleva och bli nervceller. Resterande 40% omfattar icke-neuronala celler och är till stor del elimineras genom serumdeprivation mellan DIV 0 - 1. Det lilla antalet kvar glia kan avlägsnas genom tillsats av mitotiska inhibitors från DIV 2-4 eller DIV 8 - 12. Plating tätheten är avgörande vid DIV 0; nervceller pläterade alltför glest kommer inte att överleva längre än 2 veckor. Inom dagar av bordläggningen, differentierade nervceller uppvisar neuronala morfologier och compartmentalize neurotypic proteiner, såsom somatodendritisk markör MAP2 och axonal markör Tau (Figur 2A). Genom DIV 14 synapsin-1 + puncta kan identifieras vid axodendritic gränssnitt, som tyder på synaps bildning. Detta stämmer överens med uttryck av synaptiska markörproteiner före DIV 7 8,11. Neuronala morfologier fortsätter att mogna genom DIV 21, vid vilken tidpunkt kulturerna uppvisar arbetade axodendritic arbors och stora synaptiska puncta (Figur 2A). Om underhålls på rätt sätt, ESNs förbli livskraftig och aktiv i minst 4 veckor efter plätering.
Längsgående uttrycksprofilering användning av RNA-sekvensering bekräftade morfologiska och proteomic bevis på neuronal specifikation end Mognad 11,15. Representativa markörer för utvecklings progression uppvisade scenspecifika uttryck profiler, däribland Oct3 / 4, nestin, DCX, NeuN och KCC2 (Figur 2B). Genom DIV 0, ESNs uttryckte rikliga kopior av neuronspecifika strukturella proteiner, inklusive MAP2 och Tau. I överensstämmelse med tidigare fynd, markörer för endast två neuronala subtyper observerades: Vglut2-uttryckmitthjärnan / bakhjäman glutamaterga nervceller och GABAerga interneuronen 8. På motsvarande sätt ett brett utbud av glutamaterga och GABAerga markörer uppvisade kraftiga uttryck mellan DIV 0 och DIV 7, inklusive pre-synaptiska SNARE proteiner som krävs för frisättningen av neurotransmittorer; neurotransmittorreceptorer som krävs för post-synaptiska svar; och byggnadsställningar proteiner som krävs för att tjudra dessa receptorer till postsynaptiska membran. Nervceller uppvisar mogna inneboende elektriska egenskaper från DIV 14 och spontana miniatyr excitatoriska postsynaptiska strömmar från DIV16 16.
Den Uppmätt Hämning av Synaptic Transmission (MIST) analys användes för att utvärdera effekten av berusning på synaptisk aktivitet. Genom att jämföra mEPSC frekvenser mellan berusade och fordon behandlade DIV 24 + ESNs ger MIST en kvantitativ och specifik mätning av berusning baserad på den funktionella hämning av synaptisk aktivitet (Figur 3A). MIST användes för att mäta effekterna av BoNT / A- / G eller tält på synaptisk aktivitet i ESNs vid 20 timmar efter badet tillsats av varje toxin. Gifter sattes vid en koncentration motsvarande 10 gånger den EC50 värde, som tidigare bestämts genom immunoblotanalys av SNARE protein klyvning 11. Alla gifter minskat mEPSC frekvenser till mindre än 5% av vehikelbehandlade kontroller. Minskningar i synaptiska priser inte var hänförlig till celldöd eller ändrade inneboende svar, eftersom berusade ESNs var i stånd att lappat, sköt upprepade aktionspotentialersom svar på ströminjektion och uppvisade ingen signifikant förändring i vilande membranpotential (Figur 3B, C).
Att jämföra känsligheten hos MIST till befintliga metoder för att upptäcka cnts, detektionsgränsen och median hämmande koncentration (IC50) bestämdes 20 timmar efter tillsats av BoNT / A till ESNs. Förgiftning med så lite som 0,005 pM BoNT / A producerade en statistiskt signifikant minskning mEPSC frekvens, med ett IC50-värde av 0,013 pM och hela ljuddämpnings av synaptisk aktivitet över 12:05 (Figur 4A). Denna IC 50 värde motsvarar ca 0,5 mus letala enheter / ml, vilket antyder att DIMMA är dubbelt så känslig och 2- till 4-faldiga snabbare än MLA vid detektering av närvaron av BoNT / A. Immunoblot mätningar av SNAP-25 klyvning producerade ett EC50 värde på 12:38 och en minsta detekterbar dos på 12:05, vilket indikerar att MIST är ungefär 30 gånger mer känsligaän immunoblot baserad detektion av kluvna SNARE proteiner (Figur 4B).
Figur 1. Uppskov anpassade ESNs förblir mitotiskt stabila och uttrycka markörer för pluripotens. (A) Schematisk bild av ESC underhåll och differentiering. Närvaron eller frånvaron av retinsyra (RA) eller leukemihämmande faktor (LIF) är märkt med ett + eller -. En jämförelse mellan dagar in vitro (DIV) och klassiska utvecklingsstadier (DS) för primära neuron kulturer ges 17. (B) Proliferation priser för R1, D3 och C57BL / 6J ES cellinjer stabiliseras med fem passager efter övergången till suspensionskultur. (C) Flödescytometri data visar inte någon ändring i Oct3 / 4 uttryck i R1, D3 och C57BL / 6J ES cellinjer mätt över 25 passager i suspensionskultur (n = 6 för varje). (D) Faktiska cellutbyten under rutinaging för en suspension anpassad R1 ESC linje mäts mellan passagerna 5 och 30 (svart linje). Teoretiska kumulativa avkastningen om inga celler kastas under passage presenteras också (röd linje). (E) Bright-fält bilder av DIV 0 aggregat producerats enligt statiskt (vänster) eller roterande villkor (höger). Vrid betingelser produceras sfäriska aggregat utan agglomerering och ökad NPC ger 3-faldig (p <0,001, bestämdes med användning av Students t-test) 11. * Indikerar ett P <0,05. Denna siffra har modifierats Hubbard et al. 11 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. morfologisk, proteomic och transcriptomic bevis på neuronal specifikation och mognad (A) Immunocytokemi från DIV 7 -. DIV 49 visar neuronal arborization och utseendet av synaptisk puncta vid axodendritic gränssnitt. Axoner är märkta med Tau (grön), är dendriter märkta med MAP2 (röd), är presynaptiska fack märkt med synapsin (vit), och kärnor färgas med DAPI (blå). (B) Längsgående uttryck profilering av representativa gener som visar utvecklingsstadium specifika uttryck och specificerar neuronala subtyper. Alla gentranskript uttrycks som ungefärligt antal utskrifter per cell. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. ESNs enligt. go hämning av synaptisk aktivitet när de utsätts för BoNT / AG och tält (A) Representativa spår från ESNs insamlade 20 timmar efter badet tillsats av ~ 10 x EG 50 värden av BoNT / A - / G, tält eller fordon. Varje nervgift minskad synaptisk aktivitet med över 95% i jämförelse med kontroller. (B) Berusade nervceller förblev kunna skjuta upprepade APs som svar på depolariserande aktuella injektion (som visats för BoNT / A, men observerades i alla berusade kulturer) och (C) uppvisade inga förändringar i den negativa vila membranpotential (C; n> 18 för varje behandling). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Fastställande av känslighet MIST i BoNT / A-behandladESNs. (A) MIST mätningar av synaptisk aktivitet 20 timmar efter badet tillsats av BoNT / A. Representativa spänning-clamp spårsegmenten uppvisade en minskning i mEPSC frekvens efter BoNT / A exponering (vänster sida). Kvantifiering av mEPSC frekvens (stapeldiagram, höger sida, n = 20 för kontroll, n = 11 till 22 för varje dos) bekräftar en dosberoende minskning i mEPSC frekvens. Median hämmande koncentrationen bestämdes med en minstakvadratanpassning av en icke-linjär regression med användning av en fyra parameter variabel lutning (R 2> 0,91). Notera detektionsgränsen genom MIST i ESNs är minst 0,005 pM. (B) BoNT / A-rus av ESNs resultaten i klyvning av SNAP-25 som visualiseras genom gel rörlighetsskiftningar (en representativ Western blöt på vänster sida med ett stapeldiagram som visar kvantifiering av SNAP-25 klyvning höger; n = 4) . Notera den minskade känsligheten med hjälp SNARE protein klyvning (SNAP-25) som slutpunkt (EG 50 av 12:36) vs. (IC50 av 0,013 pM). * Indikerar ett P <0,05; *** Indikerar ett P <0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Den nuvarande standarden för CNT detektion, serotyp beslutsamhet och kvantifiering är MLA. Den MLA förfrågar hela intervallet av värden: toxin interaktioner krävs för berusning att ske in vivo (t ex toxin bindning till en cellytreceptor, internalisering av toxin-receptorkomplexet, LC sloka in i cytoplasman, LC-medierad klyvning av substrat och hämning av synaptisk neurotransmission) 18. Men även om MLA erbjuder ett fysiologiskt relevant modell av berusning, är det resurskrävande, kan komma på skam med föroreningar och innebär ett stort antal möss med döden som slutpunkt. Alternativt har cellbaserade analyser för BoNT detektion och kvantifiering begränsats till primära neuron kulturer, vilket också kräver användning av djur, eller till neuroblastom cellinjer, som inte bildar synapser och typiskt uppvisar dålig känslighet för nervgifter 8. Hittills har de flesta mätningar av berusning i thESE cellbaserade plattformar har förlitat sig på detektion av proteolytisk klyvning av SNAP-25, VAMP1 / 2 eller syntaxin-en 11. Detta är problematiskt eftersom SNARE protein klyvning har visat sig vara icke-linjärt samband med synaptisk inhibition in vivo och därför kanske inte korrekt representera berusning eller återhämtning från berusning 19,20.
En idealisk cellbaserade modellsystem för CNT detektion skulle (i) vara neuron-baserade; (Ii) vara synaptically kombination med neurotypic elektriska svar; (Iii) vara mycket känsliga för alla serotyper CNT eller subtyper; och (iv) erbjudande skalbarhet, genomströmning och analystider som motsvarar eller förbättrats under det MLA, till lägre kostnad, och utan att kräva användning av djur. För att möta dessa krav har vi utvecklat en metod för att producera stora mängder av höganrikat, nätverkskulturer av glutamaterga och GABAerga nervceller från kommersiellt tillgängliga mus ESC linjer. Vi utvecklade sedan MIST analys för att kvantifierasynaptiska inhibition som svar på intoxikation med tält och BoNT / A- / G. Medan MIST analysen kan utföras på något synaptically aktiva neuron befolkningen (t.ex. primära nervceller eller hjärnan skivor), för närvarande ESNs är de enda in vitro härrör neuron modell som reproducerbart utvecklar framväxande nätverksbeteenden och är därför lämpligt för MIST analysen.
Producera tillräckliga mängder nervceller i definierade härstamning för CNT studier krävs flera innovationer i ESC kultur och differentiering. Först, genom att selektera för och odling ESCs som kan överleva suspension-anpassning, eliminerade vi risken för förorening av matarceller och behovet att rena matarceller från ESC vid starten av differentiering. Även de molekylära mekanismerna bakom fjädring-anpassning är okända, fjädring anpassade ekonomiska och sociala råd förblir mitotiskt aktiva, behålla Oct3 / 4 uttryck och fortsätter att vara neurogen. Med användning av denna metod, ~ 1,5 x 10 7 ESCS typiskt återvinns varje passage. För det andra, var produktionen av NPCs ökade ~ 300% genom att införliva mekanisk omrörning för att förhindra agglomerering under differentiering, skenbart öka närings tillgängligheten till inredningen av aggregaten. Under processen, fann vi att serum som används för ESC kultur och neuronal differentiering är den mest kritiska komponenten för att upprätthålla neurogena ekonomiska och sociala råd. För bästa framgång, rekommenderar vi fjädring anpassar ES-celler till varje parti av serum och lagring serum vid -20 ° C för att stödja ESC kultur och neuronal differentiering genom utgångsdatum.
Som med de flesta synaptically aktiv kulturer, DIV 14 + ESNs är mycket mottagliga för plötsliga förändringar i pH, och även en kortvarig exponering för atmosfärisk CO2 koncentrationer kan leda till neurotoxicitet inom 24 timmar. För experiment som kräver behandling av kulturer följt av inkubationer bestående O / N eller längre, nervceller bör behandlas direkt in inkubatorn eller överföras till en konstant CO2 kammaren före experiment.
Ett flertal tekniker bekräftade neurogenes och neuronal mognad, inklusive ICC, transkriptionell profilering och hel-cell patch-clamp elektrofysiologi. Tidsmässiga förändringar i genuttryck och neuron morfologi överensstämde med en snabb progression genom de utvecklingsstadier av neurogenes och genom DIV 16, ESNs uppvisade retande och hämmande miniatyr postsynaptiska strömmar med emergent nätverk beteenden 16. Bevis på synaptisk aktivitet föreslog att ESNs kan replikera pathophysiologies ansvariga för de kliniska manifestationer av botulism och stelkramp. Detta bekräftades genom att använda MIST för att visa att intoxikation med BoNT / A- / G eller tält nedsatt mEPSC frekvenser med> 95% jämfört med vehikelbehandlade eller obehandlade neuroner.
Mätningar av känslighet MIST för BoNT / A indikerade en median hämmandekoncentration (IC 50) av 0,013 pM (motsvarande 0,5 mus dödliga enheter / ml) och en gräns-of-detektion under 0,005 pM, mätt vid 20 timmar efter badet tillsats. Utifrån dessa värden, är MIST ungefär dubbelt så känsliga som och 2 - 4 gånger snabbare än MLA och 30 gånger mer känsliga än immunoblot baserad detektion av kluvna SNAP-25.
Tillsammans står dessa data tyder på att nätverks populationer av stamcells-härledda neuron erbjuder ett fysiologiskt relevant, cellbaserad modell för berusning. I kombination med förbättrade metoder för att härleda nätverks ESN kulturer från upphängningsanpassade ekonomiska och sociala råd, bör användningen av MIST minska behovet av djurförsök och de tillhörande nackdelar, kostnader och etisk fråga MLA samtidigt som en snabbare, känslig och specifik åtgärd berusning. Även hel-cell patch-clamp elektrofysiologi är en låg genomströmning metod för att identifiera förekomst av aktiva nervgifter och erbjuder en upplösning och speed som är ouppnåeligt använder molekylära metoder. Dessa resultat ger också belägg för att tillämpningen av aktivitetsberoende metoder för att utvärdera synaptisk aktivitet och nätverksbeteende kan möjliggöra snabb och specifikt påvisande av nervgifter. Sådana högre genomströmning tillvägagångssätt skulle göra mekanistiska studier, terapeutisk screening eller diagnostiska analyser genomförbart för ett brett spektrum av neuromodulatory medel, inklusive cnts.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av National Institutes of Health National Institute of Allergy och infektionssjukdomar (IAA nummer AOD12058-0001-0000) och Reduction Agency Defense Threat - Gemensamt Science and Technology Office, medicinsk vetenskap och division (siffror bidrags CBM.THRTOX.01.10 .RC.023 och CBM.THRTOX.01.RC.014). Denna forskning utfördes medan PB höll en Defense Threat Reduction Agency-National Research Council Research Associateship Award och KH höll en National Research Council Research Associateship Award. Vi tackar Angela Adkins och Kaylie Tuznik (USAMRICD) för tekniskt stöd; och Cindy Kronman (USAMRICD) för redaktionell hjälp. De åsikter som uttrycks i artikeln är författarnas och återspeglar inte den officiella politiken av avdelningen av armén, försvarsdepartementet, eller den amerikanska regeringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1. ESC and ESN | |||
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC culture medium Formulation and notes: 500 mL |
| 100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 6 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 6 mL |
| ES qualified FBS | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 90 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 3 mL |
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 1.1 mL |
| 107 Units/mL LIF | Millipore | ESG1107 | 60 μL |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC differentiation medium Formulation and notes: 436.6 mL |
| 100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL |
| ESC-qualified serum | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 50 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 0.9 mL |
| Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Media: NPC trypsinization medium Formulation and notes: 100 mL |
| 0.5 M EDTA (18.3%) | Sigma-Aldrich | 3690 | Media: freeze in 5 mL aliquote Formulation and notes: 0.266 mL |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | 50 mg |
| Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Media: Surface coating solutions Formulation and notes: 2.5 µg/mL in H20 |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigma-Aldrich | P7280 | Media: use within 1 wk Formulation and notes: 100 µg/mL in H20 |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 5 µg/mL in H20 |
| DMEM/F12 + GlutaMAX | Life Technologies | 10565-018 | Media: NPC culture medium Formulation and notes: 492.5 mL |
| 100x N2 vitamins | Life Technologies | 17502-048 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888-022 | Media: ESN culture medium Formulation and notes: 482.5 mL |
| 50x B27 vitamins | Life Technologies | 17504-044 | Media: store at 4 °C for up 1 month Formulation and notes: 10 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| 5-fluoro-2'-deoxyuridine (5FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | Media: 2000x Mitotic inhibitors aliquot and store at -20 °C Formulation and notes: dd 150 mg 5FDU and 350 mg uridine to 10 mL Neurobasal A. Sterile filter, aliquot and freeze. Use 2000x in ESN culture medium. |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| TrypLE Express Trypsin | Life Technologies | 12605-010 | Media: Miscellaneous Formulation and notes: store at RT |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | store at RT |
| soybean trypsin inhibitor (STI) | Sigma-Aldrich | T6414 | store at -20 °C |
| ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | store at RT |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Prepare 100 mM stock by dissolving 100 mg ascorbic acid in 5.7 mL of 50:50 DMSO/ethanol mix. |
| retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | Resuspend 15 mg RA in 9 mL 50:50 DMSO/ethanol. Supplement with 1 mL of 100 mM ascorbic acid stock. Aliquot and stored at -80 °C. Stable for 6 mos. |
| Table 2. MIST | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: Extracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 58.44 MW: 140 |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60135 | Media: (ERB; pH = 7.3, 315 mO) Final Concentration (mM): 74.56 MW: 3.5 |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 119.98 MW: 1.25 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Final Concentration (mM): 110.98 MW: 2 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | Final Concentration (mM): 180.16 MW: 10 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
| K-gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Media: Intracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 234.5 MW: 140 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: (IRB; pH = 7.3, 320 mO) Final Concentration (mM): 58.44 MW: 5 |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 507.18 MW: 2 |
| Li-GTP | Sigma-Aldrich | G5884 | Final Concentration (mM): 523.18 MW: 0.5 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 110.98 MW: 0.1 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | 380.35 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
| bicuculline | Tocris | 131 | Media: Miscellaneous Final Concentration (mM): 0.01 MW: 417.85 |
| CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Final Concentration (mM): 0.01 MW: 276.12 |
| Tetrodotoxin | Sigma-Aldrich | A8001 | Final Concentration (mM): 0.005 MW: 645.74 |
| BoNT/A-/G | Metabiologics | N/A | Media: Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
| Tetanus toxin | Sigma-Aldrich | T3194 | Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL-2 | Final Concentration (mM): N/A MW: N/A |
| Table 3. Equipment and Software | |||
| MiniAnalysis (version 6.0.7) | Synaptosoft, Inc. | N/A | Event detection software |
| Igor Pro (version 6.22A) | WaveMetrics | N/A | Software for visualization of recordings |
| Patchmaster | Heka | N/A | Data acquisition software |
| Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | N/A | |
| micromanipulator | Sutter Instrument | MPC-365 | |
| patch-clamp amplifier | Heka | ECB10USB | |
| micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| borosilicate capillary tubes | Sutter Instrument | B150-86-10 | Corning 7740 |
| 18 mm glass coverslips | Fisher | 12-545-84 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| cell strainer (40 µm) | Fisher | 08-771-1 | |
| Stovall Belly Dancer Shaker | Fisher | 15-453-211 | |
| low adhesion dishes | Fisher | 05-539-101 | Corning 3262 |
| bacterial dishes | VWR | 25384-302 | 100 x 15 mm |
References
- Simpson, L. L. Identification of the major steps in botulinum toxin action. Annual Review Of Pharmacology And Toxicology. 44, 167-193 (2004).
- Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene. The Journal Of Infectious Diseases. , (2013).
- Singh, B. R. Botulinum neurotoxin structure, engineering, and novel cellular trafficking and targeting. Neurotoxicity Research. 9, 73-92 (2006).
- Larsen, J. C. U. S. Army botulinum neurotoxin (BoNT) medical therapeutics research program: past accomplishments and future directions. Drug Development Research. 70, 266-278 (2009).
- McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research. Biochem Bioph Res Co. 405, 85-90 (2011).
- Eubanks, L. M., et al. An in vitro and in vivo disconnect uncovered through high-throughput identification of botulinum neurotoxin A antagonists. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2602-2607 (2007).
- Pellett, S., et al. Sensitive and quantitative detection of botulinum neurotoxin in neurons derived from mouse embryonic stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 404, 388-392 (2011).
- Mesngon, M., McNutt, P. Alpha-Latrotoxin Rescues SNAP-25 from BoNT/A-Mediated Proteolysis in Embryonic Stem Cell-Derived Neurons. Toxins. 3, 489-503 (2011).
- Kiris, E., et al. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).
- Whitemarsh, R. C., et al. Novel application of human neurons derived from induced pluripotent stem cells for highly sensitive botulinum neurotoxin detection. Toxicological Sciences. 126, 426-435 (2012).
- Hubbard, K. S., et al. High yield derivation of enriched glutamatergic neurons from suspension-cultured mouse ESCs for neurotoxicology research. BMC Neurosci. 13, 127 (2012).
- Brook, F. A., Gardner, R. L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 5709-5712 (1997).
- Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 8424-8428 (1993).
- Hubbard, K., Gut, I. M., Lyman, M. E., McNutt, P. M. Longitudinal RNA sequencing of the deep transcriptome during neurogenesis of cortical glutamatergic neurons from murine ESCs. F1000Research. 2 (35), (2013).
- Gut, I. M., et al. Novel application of stem cell-derived neurons to evaluate the time- and dose-dependent progression of excitotoxic injury. PLoS One. 8, e64423 (2013).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 8, 1454-1468 (1988).
- Capek, P., Dickerson, T. J. Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection. Toxins. 2, 24-53 (2010).
- Raciborska, D. A., Trimble, W. S., Charlton, M. P. Presynaptic protein interactions in vivo: evidence from botulinum A, C, D and E action at frog neuromuscular junction. The European Journal Of Neuroscience. 10, 2617-2628 (1998).
- Baskaran, P., Thyagarajan, B. Acute and chronic effects of botulinum neurotoxin a on the mammalian neuromuscular junction. Muscle & Nerve. 50, 206-215 (2014).
