Abstract
Therapeutische und mechanistische Studien der präsynaptisch gezielte Clostridien-Neurotoxine (CNTs) sind von der Notwendigkeit einer skalierbaren, zellbasierte Modell, das funktionierende Synapsen produziert und unterliegt einem physiologischen Reaktionen auf Intoxikation beschränkt. Hier beschreiben wir eine einfache und robuste Methode, um murine embryonale Stammzellen (ESC) in definierte Linien der synaptisch aktive, vernetzten Neuronen effizient zu unterscheiden. Nach einer 8-tägigen Differenzierung Protokoll, Maus embryonalen Stammzellen abgeleiteten Neuronen (ESN) schnell zu äußern und compartmentalize neurotypic Proteine bilden neuronale Morphologien und entwickeln Eigen elektrischen Antworten. Von 18 Tage nach Differenzierung (DIV 18), ESN zeigen aktive glutamatergen und γ-Aminobuttersäure (GABA) erge Synapsen und Schwellen Netzwerk Verhaltensweisen gekennzeichnet durch eine erregende: hemmende Gleichgewicht. Um festzustellen, ob Vergiftung mit CNTs funktionell antagonisiert synaptischen Neurotransmission und damit die Replikation thE in vivo Pathophysiologie, die klinischen Symptome von Botulismus oder Tetanus verantwortlich ist, Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie wurde verwendet, um spontane Miniatur exzitatorischen postsynaptischen Ströme (mEPSCs) in ESN an Tetanus-Neurotoxin (Zelt) oder Botulinum-Neurotoxin ausgesetzt (BoNT) zu quantifizieren Serotypen / A- / G. In allen Fällen zeigten ESNs nahezu vollständigen Verlust der synaptischen Aktivität innerhalb von 20 Stunden. Intoxicated Neuronen blieben lebensfähig, wie unverändert Ruhemembranpotentials und der intrinsischen elektrischen Antworten gezeigt. Zur weiteren Charakterisierung der Empfindlichkeit dieses Ansatzes wurden dosisabhängige Wirkung des Rausches auf synaptische Aktivität 20 Stunden nach der Zugabe von BoNT / A gemessen. Intoxikation mit 0,005 pM BoNT / A führte zu einer signifikanten Abnahme in mEPSCs, mit einer medianen Hemmkonzentration (IC 50) von 0,013 pM. Vergleiche der mittleren Dosen zeigen, dass funktionale Messungen der synaptischen Hemmung sind schneller, präziser und empfindlicher als SNARESpaltungs-Assays oder die Maus Letalität Assay. Diese Daten bestätigen die Verwendung von synaptisch gekoppelt Stammzellen abgeleiteten Neuronen für die hochspezifische und empfindliche Detektion von CNTs.
Introduction
Das allgemeine Ziel dieser Methode ist es, funktionell auszuwerten synaptische Aktivität in vernetzten Kulturen Stammzellen abgeleiteten Neuronen clostridialen Neurotoxine freigelegt. Dies ist die erste Demonstration eines in vitro-Modell abgeleitet, das funktionell repliziert die Pathophysiologien für klinische Manifestationen von Botulismus verantwortlich und validiert ESN als geeignetes Modell für den Nachweis von CNTs, therapeutische Screening und mechanistische Studien.
BoNTs sind sehr tödlichen bakteriellen Neurotoxine von Mitgliedern der Clostridium-Spezies produziert. Einschließlich der kürzlich vorgeschlagenen BoNT / H wurden acht antigenetisch unterschiedliche BoNT-Serotypen beschrieben worden (/ A / H) 1,2. Alle Serotypen als 150 kDa Peptide, die sich geäußert posttranslational eingekerbt, um eine Doppelkette aus einem 100 kDa schweren Kette (HC) und einem 50 kDa leichte Kette (LC) durch eine Disulfidbrücke 3 verbunden zu produzieren. Der HC vermittelt die Bindung an präsynaptischen Rezeptoren und entry des Toxins in das Neuron über Synapsen Endozytose. Während endosomalen Verarbeitung der HC eine strukturelle Umorganisation, eine Pore in der Vesikelmembran bilden, die Erleichterung der Translokation des LC in die präsynaptischen Cytosol. Die LC dann gezielt und spaltet lösliche N -ethylmaleimide empfindlichen Fusion Befestigung Protein-Rezeptor (SNARE) Proteine in der präsynaptischen Fach: SNAP-25 (BoNT / A, / C, / E), VAMP2 (BoNT / B / D, / F / G) oder Syntaxin (BoNT / C) 1. Spaltung eines dieser SNARE-Proteine verhindert die Anordnung der synaptischen Exozytose Maschinen, wodurch die Neurotransmitterfreisetzung Blockierung. Diese Kombination von effizienten neuronale Targeting und präsynaptische Lokalisation macht BoNTs die stärksten Gifte, mit geschätzten menschlichen tödliche Dosis von nur 0,1 bis 1 ng / kg 1.
Biochemische Assays können verwendet werden, um das Vorhandensein oder die Aktivität des CNT LCs mit hoher Empfindlichkeit zu detektieren. Allerdings sind diese Methoden nicht zu interrogate die Fähigkeit des Toxins zu binden, einzugeben, zu aktivieren und die Funktion in Neuronen und sind daher indirekt und möglicherweise irreführend Maßnahmen der Anwesenheit von aktiven Toxin. Im Gegensatz dazu funktionelle Assays Vergiftungs wie Maus Letalität Assay (MLA) umfassend zu bewerten die Fähigkeit von CNTs auf alle Phasen der Aufnahme und Aktivierung erfolgreich zu verhandeln, die Bereitstellung relevanter und spezifische Beurteilungen von Toxinaktivität. Während die MLA ist der Goldstandard der BoNT-Erkennung ist es ein In-vivo-Verfahren, die den Tod als Endpunkt verwendet und hat daher begrenztem Nutzen als Forschungsplattform. Versuche, zellbasierte Modelle der CNT Rausch für mechanistische Untersuchungen und therapeutische Screening entwickeln auch erlitten erhebliche Einschränkungen. Während Primärneuronenkulturen bieten eine hohe physiologische Relevanz, ist ihre Verwendung durch eine Reihe von Faktoren erschwert, darunter hohe Ressourcenkosten, relativ geringe Ausbeute, die Anwesenheit von mehreren neuronalen UnterTypen und umfangreichen rechtlichen und administrativen Versehen mit Tierarzneimitteln beteiligt. Als Alternative zu primären Neuronen wurden neurogenen Zelllinien (die veranlasst werden können, um die nerven-ähnliche Eigenschaften durch chemische Stimulation erlassen werden), wie Neuroblastomen und chromaffine Nebennierenzellen in vitro-Modellen der Intoxikation verwendet. Da diese Zellen kontinuierlich kultiviert, vor der Induktion, sind sie hochgradig skalierbar und somit gut geeignet für die moderate Probendurchsatz. Allerdings ist ihre Relevanz fraglich, da induzierte Phänotypen sind in der Regel heterogen sind schlecht empfindlich auf CNTs und nicht zu kritischen neuronalen Verhalten, einschließlich der Unfähigkeit, prä- und postsynaptischen Kompartimente, die in funktionierende Synapsen 4 montieren bilden aufweisen. In Ermangelung einer physiologisch intakten präsynaptischen Kompartimente, die gesamte Palette von Toxin: Neuron kann Wechselwirkungen nicht repliziert werden und damit funktionelle Messungen des Rausches sind nicht möglich 5. Keinet überraschend, versucht, mechanistische Studien und Wirkstoff-Screening für BoNT mit induzierten neurogenen Zelllinien wurden in Erkenntnisse, die nicht mit in vivo und primären Neuronen Studien 6 führte durch.
Es wurde vorgeschlagen, dass Stammzellen abgeleiteten zentralen Nervensystems (ZNS) Neuronen der nächsten Generation zellbasierten Plattform für BoNT Forschung, die die Relevanz des primären Neuronen mit der Flexibilität von kultivierten Zellinien 7-10 kombiniert. Insbesondere Maus Stammzellen gewonnenen Neuronen (ESN) gefunden wurden sehr empfindlich auf physiologische Dosen von BoNT / A / G zu sein und viele in-vivo-Reaktionen auf Trunkenheit, einschließlich Differenz Persistenzen, gesteigerter Wirksamkeit Rausch und Serotyp replizieren -spezifische Potenzen 5,8,11. Diese Verhaltensweisen zeigen, dass in vivo Mechanismen der BoNT-Aufnahme, Verarbeitung, Handel und Aktivität sind in ESN konserviert. Jedoch Hemmung der synaptischen activity ist die Signatur Manifestation von Botulismus, und somit zeigt einen Verlust der synaptischen Aktivität nach Intoxikation durch CNTs ist wichtig, vor der Feststellung, dass ESN sind eine geeignete in vitro abgeleitet zellbasierte Modell für CNT-Studien.
Um die Auswirkungen der Vergiftung mit CNTs auf synaptische Aktivität zu messen, wurde Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie zur monosynaptische Ströme in Vehikel-behandelten oder CNT-behandelt DIV 21 + ESN quantifizieren. Wir fanden, dass Rausch der ESN mit BoNT / A / G oder Zelt verursacht> 95% Verlust der synaptischen Aktivität innerhalb von 20 Stunden in allen Fällen. Die weitere Charakterisierung durchgeführt 20 Stunden nach Intoxikation mit BoNT / A zeigte eine dosisabhängige Wirkung auf die synaptische Aktivität, mit einer Nachweisgrenze von unter 0,005 pM und einem IC 50 -Wert von 0,013 pM. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Empfindlichkeit und Zeitrahmen von elektrophysiologischen Detektion von Rausch erheblich gegenüber vergleichbaren Immunoblot-basierte ana verbessertLyse von SNAP-25-Spaltung und in vivo Maus Letalität Assays, die zeigen, dass funktionale Messungen des Rausches in synaptisch aktive Neuronenkulturen kann mehr empfindlich, spezifisch und Schnellverfahren zu erleichtern prägen die zelluläre Reaktion auf BoNT.
Protocol
1. Anpassung der WSR, um zellfreie Suspensionskultur Feeder
- Thaw WSR bei 37 ° C, bis ein Splitter aus Eis bleibt.
- Verwendung einer P1000-Pipette sanft Transfer 1 - 2,5 × 10 6 dissoziiert WSR zu einem nicht-Gewebekultur-behandelte Schale mit 10 ml vorgewärmten ESC Medium. Inkubieren in einem befeuchteten Brutschrank 20 h bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Nach 20 Stunden, waschen Sie die Zellen vorsichtig Übertragung der Suspensionskultur in ein 15 ml konischen Rohr mit einem 10 ml serologische Pipette. Pellet WSR für 3 min bei 200 x g. Während Spin, 10 ml frisches Medium ESC zurück zu geringer Haftung Gericht.
- Überstand entfernen, wobei darauf zu achten Ablösen des Zellpellets, und 1 ml frisches Medium, um ESC Pellet Zelle. Übertragungszellen zur Bakterienschale mit einer P1000-Pipette und zurück zum Inkubator.
- Beachten Zellen täglich bis Aggregate mit bloßem Auge (in der Regel 4 werden - 8 Tage (d); Aggregate werden 0,2- 0,5 mm). Wenn Aggregate sind nicht ersichtlich nach 4 d, wiederholen Sie Schritt 1.3. Sobald Aggregate sichtbar sind, distanzieren und zu pflegen WSR wie in Abschnitt 2 beschrieben.
2. ESC Passagieren und Wartung
- Übertragen Sie ESC Aggregate zu einem 15 ml konischen Röhrchen mit einer sterilen 10 ml-Pipette und lassen Aggregate zu einem kompakten Pellet absetzen (in der Regel 3-5 min). Den Überstand aspirieren, dabei darauf achten, nicht zu stören das Zellpellet, und waschen Aggregate mit 5 ml PBS. Auch wenn die Schwerkraft Absetzen wird alternativ Pellet-Zellen empfohlen bei 100 · g für 2,5 Minuten statt, um Zeit zu sparen.
- Absaugen PBS und fügen Sie 500 ul Trypsin. Aggregate in Trypsin Inkubieren für 3 min in einem Wasserbad bei 37 ° C. Fügen Sie 500 ul ESC Medium, um das Trypsin zu verdünnen und sanft verreiben 10-mal mit einem P1000-Pipette, um Aggregate aufzubrechen. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer.
- Pellet dissoziierten Zellen für 3 min bei 200 xg und resuspendieren Zellen zu einer Endkonzentration von 1,0x 10 7 Zellen / ml in Medium ESC. Transfereinrichtung 150 ul (1,5 x 10 6 Zellen) zu 10 ml frischem Medium in einem ESC 10 cm Bakterienschale und zum Brutschrank 48 h. Überschüssiges WSR unterschieden werden können kryokonserviert bei 1-5 x 10 6 Zellen / ml in 90% ESC-Medium mit 10% DMSO, oder verworfen ergänzt.
- Passage aggregiert alle 48 Stunden. Aggregate bereit für Durchgang wird klar ersichtlich sein, mit einem Durchmesser von mehr als 0,5 mm.
HINWEIS: - 1.4 Auftauen und Kultur von kryokonservierten, Suspensions-adaptierten Zellen pro Schritte 1.2 durchgeführt. 72 Stunden - Aggregate bereit Passagieren innerhalb von 48 sein.
3. Neuronale Differenzierung
HINWEIS: Führen Sie die Schritte 3,1 bis 3,5 vor der Mittagszeit und Step 3.7 nach Mittag. Eine Übersicht über die Differenzierungsverfahren ist in 1A dargestellt.
- Distanzieren WSR wie in Schritten von 2,1 bis 2,5. Transfer 350 ul (3,5 x 10 6) von dissoziiertend WSR auf eine 10 cm Niederbefestigungsschale mit 25 ml Differenzierungsmedium. Platzieren Sie auf einem Rundschüttler auf 30 - 45 Umdrehungen pro Minute in einem Gewebekultur-Inkubator mit 5% CO 2 bei 37 ° C. Dies ist der erste Tag der Differenzierung bezeichnet Tag in vitro (DIV) -8.
HINWEIS: Die Verwendung eines Ultra-Low Befestigung Gericht erhöht die Kosten des Verfahrens, aber produziert etwas größere Erträge als bakteriellen Petrischalen, da Aggregate können gelegentlich Petrischalen halten. Wenn unterschiedliche Schalengrößen bevorzugt sind, können mittlere Volumen und Zellzahlen entsprechend skaliert werden. - Nach 48 Stunden (DIV -6), mit einem 25-ml-Pipette, um die differenZellAggregate in ein 50 ml konisches Röhrchen übertragen. Sofort einen frischen 25 ml Differenzierungsmedium auf die Petrischale hinzufügen.
- Lassen Aggregate auf über 2 beigelegt werden - 5 min, eine sichtbare Pellet, die 1 - 2 mm tief. Ignorieren einzelne Zellen oder kleine Aggregate in der Schwebe bleiben. Das Medium vorsichtig absaugen und übertragen Sie die cell Pellet wieder in die Petrischale mit einem P1000. Zeigen auf Rotationsschüttler in einem Gewebekultur-Inkubator.
- Bei DIV -4 wiederholen Sie Schritt 3.2. Das Pellet wird 2-4 mm tief. Ersetzen 30 ml Differenzierungsmedium mit 6 uM all-trans-Retinsäure (RA) zu der Petrischale ergänzt. Zurück zur Rotationsschüttler in der Gewebekultur-Inkubator für weitere 48 Stunden.
- Bei DIV -2 wiederholen Sie Schritt 3.3. 8 mm tief an diesem Punkt - Das Pellet wird 4 sein.
- Bei DIV -1, bereiten Beschichtung Oberflächen, wie in Abschnitt 4.
- Bei DIV 0, tauen 5 ml vorge aliquotiert und eingefroren NPC Trypsinierung Medium bei 37 ° C für 5 bis 10 min und in eine Gewebekultur Kapuze. Unter Verwendung einer 25 ml Pipette Übertragungsdifferen Aggregate zu einem 50 ml konischen Röhrchen. Lassen Aggregate absetzen und sorgfältig absaugen Medium. Waschen Sie das Pellet zweimal mit 10 ml PBS, so dass die Aggregate zwischen Wäschen begleichen.
- Nach dem zweiten Waschen mit PBS, 5 ml NPC Trypsinierung Medium dem Pellet und bei 376; C für 5 min. Flick vorsichtig das Rohr nach 2,5 min.
- 5 ml 0,1% Sojabohnen-Trypsininhibitor (STI) um Trypsin zu inaktivieren, und durch Umschütteln. Vorsichtig trituriert 10-15 Stunden mit einer 10 ml serologische Pipette, bis eine relativ homogene Zellsuspension wird hergestellt.
- Langsam übertragen die Zellsuspension auf eine 40 & mgr; m oder 70 & mgr; m Zellsieb in der Spitze eines konischen 50 ml-Röhrchen gegeben. Nachdem die gesamte Suspension wurde filtriert, mit 1 ml N2 Medium, um die verbleibenden Zellen durch den Filter zu waschen und zu pelletisieren dissoziierten Zellsuspension für 6 min bei 200 x g.
- Absaugen Medium ohne das Pellet aufzurühren. Wasche die Zellen zweimal mit 10 ml N2-Medium, Pelletierung Zellen 5 min bei 200 × g und Zerreiben zwischen den Waschgängen mit einer P1000. Vor dem zweiten Wasch zählen Zellen unter Verwendung eines Hämocytometers.
- Zellen in N2-Medium mit 1 x 10 7 Zellen pro ml und Platten ESNs bei einer Zelldichte von 150.000 - 200.000 Zellen / cm 2.
- Übertragen neu plated ESNs zu einem befeuchteten Gewebekulturinkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 und, wie in Abschnitt 5 erhalten.
4. Vorbereitung Kultur Oberflächen für Plating neuralen Vorläuferzellen bei DIV 0
- Bereiten Gewebekultur-behandelten Geschirr mindestens 1 Tag vor dem Beschichten. Es wird ausreichend Polyethylenimin (PEI; 25 ug / ml in sterilem H 2 O) oder Poly-D-Lysin (PDL; 100 ug / ml in sterilem H 2 O) zu bedecken gewebekulturbehandelten Kunststoffgeschirr und inkubieren O / N 37 ° C.
- Am Morgen des Überzug, Geschirr spülen zweimal mit doppelt destilliertem H 2 O und einmal mit PBS. Nach dem letzten Waschen, gebe ausreichend N2-Medium, um das Gericht zu decken (zB 1 ml pro Vertiefung einer 12-Well-Schale oder 4 ml pro 6 cm Schale).
- Bereiten Sie 18 mm Deckgläser mindestens einen Tag vor der Neuron-Beschichtung. Saubere Deckgläser durch Plasmareinigung für 4 min.
- Gereinigt Deckgläser mit einem Ethanol-gewaschen Parafilm Sofortüberweisung in den Boden eingroße sterile Schüssel und fügen Sie 400 ul PEI oder PDL-Lösung, wie in Schritt 4.1 vorbereitet. Inkubieren O / N bei 37 ° C in einem Gewebekultur-Inkubator.
- Am Morgen waschen Deckgläser dreimal mit Wasser und mit 5 ug / ml Laminin in PBS für 1 bis 3 Stunden bei 37 ° C. Vor distanziert Neuronen absaugen Laminin und unmittelbar danach den Deckglas auf eine Vertiefung einer 12-Well-Schale mit 1 ml Medium NPC, dass auf jeden Fall der behandelten Seite nach oben zu halten.
- Shop Gerichte und Deckgläsern bei 37 ° C bis NPCs sind bereit, zu plattieren.
5. Wartung von Neuronen
- Bei DIV 1, absaugen Medium und tauschen Sie mit N2 Kulturmedium.
- Bei DIV 2 und 4, absaugen Medium und tauschen Sie mit B27 Kulturmedium.
- Bei DIV 8, absaugen Medium und tauschen Sie mit B27 Kulturmedium, das Mitoseinhibitoren zu beseitigen verunreinigen nicht-neuronalen Zellen.
- Bei DIV 12, ersetzen Sie sie durch B27 Kulturmedium.
- DIV nicht entfernen12 + ESN von 5% CO 2 bis zum Gebrauch.
6. Mess Hemmung der synaptischen Übertragung (MIST) Assay zur Quantifizierung Miniatur Exzitatorische postsynaptischen Ströme
ACHTUNG: Die Clostridien-Neurotoxine sind die giftigen Substanzen bekannt, mit einem geschätzten menschlichen LD50-Werte so günstig wie 0,1-1 ng / kg. Erhalten erforderlichen Genehmigungen vor der Verwendung diese Giftstoffe und verwenden Sie geeignete Vorsichtsmaßnahmen.
- Vorsichtig verdünnen BoNT / A, um die gewünschte Endkonzentration in Kulturmedium ESN und warm auf 37 ºC 100x. In geeigneten Volumen Toxin bis 21 + ESN Kulturen DIV, schwenken Sie die Kulturschale, und zum Inkubator.
- Wenn Zellen mehr als 4 Stunden nach Vergiftung analysiert werden, fügen Toxins an die Schüssel und Wirbel ohne Entfernung von 5% CO 2, beispielsweise direkt in den Inkubator oder in einem konstanten CO 2 Kammer.
- In geeigneten Zeitpunkt, aspirate ESN Kulturmedium und waschen zweimal mit extrazellulären Aufzeichnungspuffer (ERB). 4 ml ERB, ergänzt mit 5,0 & mgr; M Tetrodotoxin und 10 & mgr; M Bicucullin, Blockieren von Aktionspotentialen und Antagonisierung GABA A Rezeptoraktivität auf.
- Übertragen Gericht zu Elektro rig. Für die MIST Test wird weder Perfusion oder Temperaturkontrolle erforderlich.
- Ziehen Borosilikatglas mit einer Mikropipette Abzieher, um eine Aufnahme Pipette mit 5-10 mOhm Widerstand erzeugen und füllen mit intrazellulären Aufzeichnungspuffer. Tauchen Sie vorsichtig gefüllt Aufnahme Pipette in Silizieren Reagenz vor der Aufnahme.
- Verwendung einer Luftspritze bereitzustellen positiven Druck als Aufzeichnungspipette wird in das ERB abgesenkt. Nach vorsichtigem Landung des Aufzeichnungs Pipette auf dem Soma des Neurons aufgezeichnet werden soll, zu entfernen positiven Druck und bilden eine Giga-Dichtung. Verringern Sie die Haltespannung um 70 mV. Unterdruck, um in Gesamtzellkonfiguration brechen vorsichtig anzuwenden.
- Wechseln Sie in den Current-Clamp zur Überwachung und Aufzeichnung Ruhemembranpotential. Ohne Anpassung für die Flüssigkeitsdiffusionspotentiale wird das Ruhemembranpotential von -67 bis -82 mV.
- Führen Sie ein kontinuierliches 70 mV Voltage-Clamp-Aufzeichnung für 4-5 min auf Miniatur exzitatorischen postsynaptischen Ströme (mEPSCs) zu erkennen.
- Analysieren 4 min von aufgezeichneten Daten für mEPSC Detektion mit Spike-Erkennung Software mit den folgenden Einstellungen: Threshold, 5; Zeitraum um ein lokales Maximum zu suchen, 10.000 us; Zeit, bis ein Peak für Baseline, 5000 & mgr; s; Zeitraum, um eine Abklingzeit suchen, 20.000 us; Bruchteil der Spitze, eine Abklingzeit finden, 0,37; Zeitraum auf durchschnittlich eine Grundlinie, 1000 & mgr; s; Die Umgebung Schwelle, 20; Punkte an durchschnittliche Spitzen, 1; Richtung der Spitze, negativ.
- Sammeln und speichern Informationen über die erkannten Ereignisse. Teilen Sie die Anzahl der Fehler in 4 min um 240 um die mEPSC Frequenz in Hz zu bestimmen.
- Sammeln mEPSC Frequenzen für 8-12 Fortsetzungrols und 8-12 mit BoNT behandelten Proben für jede Belichtungsbedingung. Analysieren Frequenz gegen alters- und viel abgestimmte Kontrollen. Bestimmen der statistischen Signifikanz% ige Hemmung der synaptischen Aktivität mit one-way ANOVA Test und Dunnett Post-hoc-Test.
Representative Results
Wir haben ein Protokoll, das die Differenzierung der wirtschaftlichen Herstellung von großen Mengen von hochreinem Stammzellen abgeleiteten Neuronen aus Mäuse WSR (in 1A beschrieben) 8,11 ermöglicht. Dieses Verfahren wurde über einen Zeitraum von Jahren, um reproduzierbar zu unterscheiden privat erzeugt und im Handel erhältlich ESC Linien in Neuronen definierter Linien 12-14 verwendet. Kritische Elemente dieses Protokolls sind (1) Anpassung der Wirtschafts- und Sozialräte auf zellfreie Suspensionskultur Feeder; (2) die ordnungsgemäße Wartung der Suspensionskulturen; und (3) die Differenzierung unter Drehbedingungen. Übergang in Suspensionskultur reduziert die Zeit und Kosten der ESC Wartung und vermeidet die Notwendigkeit, Feeder-Zellen vor der Differenzierung zu entfernen. Nach Aussetzung Anpassung ist Oct3 / 4-Expression im Einklang über mindestens 30 Passagen, was darauf hinweist, dass die Aussetzung Anpassung nicht Ausdruck Pluripotenzmarker ändern (1B-D 7 Zellen pro Durchgang übersteigt. Dies geschieht in der Regel innerhalb von zehn Durchgängen nach der Aussetzung Anpassung oder fünf Stellen nach dem Auftauen der Wirtschafts- und Sozialräte, die zuvor in Suspension angepasst waren. Mechanische Drehdifferen Aggregate wurde auch gefunden, entscheidend für erhöhte neuronale Ausbeute zu sein. Die Zugabe von einem Rotationsschüttler eliminiert Superaggregatbildung zunehmenden Gesamt Lebensfähigkeit und Erzeugen einer Erhöhung ~ 300% mit einer Ausbeute von neuralen Vorläuferzellen (NSC) an DIV 0 (Figur 1E).
Eine typische Differenzierung beginnt mit 3,5 x 10 6 WSR bei DIV -8 und produziert 115 x 10 6 NPCs bei DIV 0, rund 60% davon werden überleben und Neuronen. Die restlichen 40% bestehen aus nicht-neuronalen Zellen und sind weitgehend durch Serumentzug zwischen DIV 0 eliminiert - 1. Die geringe Anzahl der anhalt Gliazellen kann durch Zugabe von mitotischen inh entfernt werdenibitors von DIV 2-4 oder DIV 8 - 12. Auflage Dichte ist entscheidend bei DIV 0; Neuronen zu dünn plattiert wird nicht über 2 Wochen überleben. Innerhalb weniger Tage nach Plattieren, differenzierte Neuronen weisen neuronale Morphologien und compartmentalize neurotypic Proteine, wie die somatodendritischen Marker MAP2 und axonalen Marker Tau (Abbildung 2A). Durch DIV 14 Synapsin-1 + puncta können axodendritic Schnittstellen, suggestive der Synapsenbildung identifiziert werden. Dies steht im Einklang mit der Expression von synaptischen Markerproteine vor DIV 7 8,11. Neuronal Morphologien weiterhin durch DIV 21 reifen, wonach Kulturen weisen aufwendige axodendritic Dorne und große synaptischen puncta (2A). Wenn in angemessener Weise aufrechterhalten bleiben ESN lebensfähig und aktiv für mindestens 4 Wochen nach der Plattierung.
Längs Expression Profiling mittels RNA-Sequenzierung bestätigt morphologischen und Proteom Hinweise auf neuronale Spezifikation eind Reifungs 11,15. Repräsentative Markierungen der Entwicklungsfortschritt zeigte stufenspezifischen Expressionsprofile, einschließlich Oct3 / 4, Nestin, DCX, NeuN und KCC2 (2B). Durch DIV 0, ausgedrückt ESN reichlich Kopien Neuronen-spezifischen Strukturproteine, einschließlich MAP2 und Tau. In Übereinstimmung mit früheren Befunden, Marker für nur zwei neuronalen Subtypen beobachtet: VGLUT2-exprimierenden Mittelhirn / Hinterhirn glutamatergen Neuronen und GABAergen Interneuronen 8. Entsprechend ist eine breite Palette von glutamatergen und GABAergen Marker zeigten starken Anstieg der Ausdruck zwischen 0 und DIV DIV 7, einschließlich präsynaptischen SNARE-Proteine für Freisetzung von Neurotransmittern erforderlich; Neurotransmitter-Rezeptoren für postsynaptischen Antworten erforderlich; und Gerüstproteine benötigt, um diese Rezeptoren an der postsynaptischen Membran anbinden. Neuronen zeigen reife intrinsische elektrische Eigenschaften von DIV 14 und spontanen Mini exzitatorischen postsynaptischen Ströme von DIV16 16.
Die gemessene Hemmung der synaptischen Übertragung (MIST) Test wurde verwendet, um die Wirkung der Vergiftung auf synaptische Aktivität zu bewerten. Durch Vergleichen mEPSC Frequenzen zwischen Rausch und Vehikel-behandelten DIV 24 + ESN liefert MIST eine quantitative und spezifische Messung der Intoxikation auf der Grundlage der funktionellen Hemmung der synaptischen Aktivität (3A). MIST wurde verwendet, um die Effekte von BoNT / A / G oder Zelt auf synaptischer Aktivität in ESN bei 20 h nach dem Bad Zugabe jedes Toxin zu messen. Toxine wurden bei einer Konzentration, die man 10-fachen der EC 50 Wert, wie zuvor durch Immunoblot-Analyse von SNARE-Proteinspaltung 11 bestimmt. Alle Gifte verringert mEPSC Frequenzen auf weniger als 5% der mit Vehikel behandelten Kontrollen. Reduzierung der synaptischen Raten waren nicht auf den Tod oder veränderte intrinsische Reaktionen der Zelle, da berauscht ESNs der Lage waren, die das Patch, feuerte wiederholte Aktionspotentialein Reaktion auf eine Strominjektion und zeigten keine signifikante Veränderung in Ruhemembranpotential (3B, C).
Um die Empfindlichkeit des MIST, bestehende Methoden zu vergleichen, um CNTs, die Nachweisgrenze und mittlere Hemmkonzentration (IC 50) zu erkennen wurden 20 Stunden nach der Zugabe von BoNT / A zu ESN bestimmt. Intoxikation durch so wenig wie 0,005 pM BoNT / A zu einer statistisch signifikanten Verringerung mEPSC Frequenz, mit einem IC 50 -Wert von 0,013 pM und vollständige Inaktivierung des synaptischen Aktivität über 0,5 pm (4A). Dieser IC 50 -Wert entspricht etwa 0,5 Maus tödlichen Einheiten / ml, was darauf hindeutet, dass die MIST ist doppelt so empfindlich und 2 schneller als der MLA 4-fach beim Nachweis der Anwesenheit von BoNT / A. Immunoblot Messungen der SNAP-25-Spaltung erzeugt einen EC 50 -Wert von 12.38 und einer minimal erfassbare Dosis von 12.05, was darauf hinweist, dass MIST ist etwa 30-mal empfindlicherals Immunoblot-Nachweis von gespalten SNARE-Proteine (Abbildung 4B).
Abbildung 1. Suspension angepassten ESN bleiben mitotisch stabile und Express Marker für Pluripotenz. (A) Schematische Darstellung der ESC Wartung und Differenzierung. - Die Anwesenheit oder Abwesenheit von Retinsäure (RA) oder Leukämie-inhibierender Faktor (LIF) wird durch ein + bzw. markiert. Ein Vergleich zwischen den Tagen in vitro (DIV) und klassische Entwicklungsstadien (DS) für die Primärneuronenkulturen vorgesehen ist 17. (B) Verbreitungsraten für R1, D3 und C57BL / 6J ES-Zelllinien zu stabilisieren um fünf Stellen nach dem Übergang in Suspensionskultur. (C) Die Durchflusszytometrie Daten zeigen keine inhaltliche Änderung in Oct3 / 4-Expression in der R1, D3 und C57BL / 6J ES-Zelllinien mehr als 25 Passagen in Suspensionskultur gemessen (n = 6 für jeden). (D) Die tatsächlichen Zellausbeuten während der routinemäßigen Passagieren eine Aussetzung angepasste R1 ESC Linie zwischen den Kanälen 5 und 30 (schwarze Linie) gemessen. Theoretische kumulative Erträge, wenn keine Zellen während der Passage verworfen werden ebenfalls vorgestellt (rote Linie). (E) Hellfeld-Bilder DIV 0 Aggregate unter statischen (links) oder Drehbedingungen (rechts) hergestellt. Rotary Bedingungen hergestellt sphärische Aggregate ohne Agglomeration und erhöht NPC liefert 3-fach (p <0,001, bestimmt mittels t-Test) 11. * Bezeichnet ein P <0,05. Diese Zahl hat sich von Hubbard et al. 11 geändert wurden Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. Morphologische, proteomic und transkriptomischen Nachweis neuronaler Spezifikation und Reifung (A) Immunocytochemistry von DIV. 7 - 49 veranschaulicht, DIV neuronalen arborization und das Auftreten von synaptischen puncta bei axodendritic Schnittstellen. Axone sind mit Tau (grün) markiert sind, werden Dendriten mit MAP2 (rot) gekennzeichnet sind, sind präsynaptischen Fächer mit Synapsin (weiß) bezeichnet, und Kerne mit DAPI (blau) gefärbt. (B) Längs Expression Profiling repräsentativer Gene demonstrieren Entwicklungsstadium spezifische Expression und Angabe neuronalen Subtypen. Alle Gentranskripte als ungefähre Anzahl der Transkripte pro Zelle exprimiert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. ESN unter. gehen Hemmung der synaptischen Aktivität, wenn zu BoNT / AG und TeNT ausgesetzt (A) Repräsentative Spuren von ESN gesammelten 20 Stunden nach dem Bad Zugabe von ~ 10 x EC 50 -Werte von BoNT / A - / G, Zelt oder Fahrzeug. Jeder Neurotoxin im Vergleich zu Kontrollen reduziert synaptische Aktivität von über 95%. (B) Berauschtes Neuronen blieb wiederholt APs in Reaktion zu brennen, um eine Strominjektion depolarisierenden (wie für BoNT / A gezeigt, aber in allen Rausch Kulturen beobachtet) und (C) zeigten keine Veränderungen in der negativen Ruhemembranpotential (C in der Lage ist, n> 18 für jede Behandlung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 4. Bestimmung der Empfindlichkeit von MIST in BoNT / A-behandeltESN. (A) MIST Messungen der synaptischen Aktivität 20 Stunden nach dem Bad Zugabe von BoNT / A. Vertreter Voltage-Clamp-Bahnsegmente zeigten eine Abnahme der Frequenz mEPSC folgenden BoNT / A-Exposition (linke Seite). Quantifizierung mEPSC Frequenz (Bargraph rechts, n = 20 für die Kontrollen, n = 11 - 22 für jede Dosis) bestätigt eine dosisabhängige Abnahme in mEPSC Frequenz. Der Median Hemmkonzentration wurde mit der kleinsten Quadrate eines nichtlineare Regression unter Verwendung einer Vierparameter variable Steigung (R 2> 0,91) bestimmt. Notieren Sie sich die Nachweisgrenze von MIST in ESN mindestens 0,005 pM. (B) BoNT / A Rausch der ESN ergibt Spaltung von SNAP-25 durch Gel-Mobilitätsverschiebungen sichtbar gemacht (mit einem Balkendiagramm, das die Quantifizierung von SNAP-25-Spaltung auf der rechten Seite einen repräsentativen Western-Blot auf der linken Seite; n = 4) . Beachten Sie die verminderte Empfindlichkeit mit SNARE-Protein-Spaltung (SNAP-25) als Endpunkt (EC 50 von 12.36) vs. 50 von 0.013 pM). * Bezeichnet ein P <0,05; *** Kennzeichnet eine p <0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Discussion
Der aktuelle Goldstandard für die CNT-Erkennung, Serotyp Bestimmung und Quantifizierung der MLA. Die MLA fragt den gesamten Bereich der host: Toxin Wechselwirkungen Intoxikation in vivo auftreten (wie zB das Toxin-Bindung an einen Zelloberflächenrezeptor, Internalisierung des Toxin-Rezeptor-Komplex, LC-Translokation in das Cytoplasma, LC-vermittelte Spaltung des Substrats und Hemmung der synaptischen Neurotransmission) 18. Obwohl der MLA bietet eine physiologisch relevante Modell des Rausches, ist jedoch ressourcenintensiv, kann durch Verschmutzungen verwechselt werden und beinhaltet eine große Anzahl von Mäusen, die mit dem Tod als Endpunkt. Alternativ wurden Assays auf Zellbasis für BoNT Detektion und Quantifizierung Primärneuronenkulturen, die ebenfalls erforderlich Tiergebrauch oder Neuroblastom-Zelllinien, die Synapsen bilden und typischerweise eine geringe Empfindlichkeit gegenüber Neurotoxinen 8 fehler beschränkt. Bisher wurden die meisten Messungen des Rausches in these zellbasierten Plattformen auf der Erfassung der proteolytischen Spaltung von SNAP-25, VAMP1 / 2 oder Syntaxin-1 11 gestützt. Dies ist problematisch, da die SNARE-Protein-Spaltung wurde gezeigt, dass sie nicht-linear mit synaptische Inhibition in vivo assoziiert und kann daher nicht genau Intoxikation oder Verwertung dar Intoxikation 19,20.
Ein idealer zellbasierten Modellsystem für CNT Detektions würde (i) Neuron Basis; (Ii) synaptisch mit neurotypic elektrischen Antworten gekoppelt zu werden; (Iii) ist sehr empfindlich gegenüber allen CNT-Serotypen oder Subtypen; und (iv) bieten Skalierbarkeit, Durchsatz und Testzeiten, die gleich oder verbessert gegenüber dem MLA, zu geringeren Kosten und ohne Tierversuche erforderlich sind. Um diesen Anforderungen gerecht zu werden, eine Methode, um große Mengen an hochangereichertem, vernetzten Kulturen der glutamatergen und GABAergen Neuronen aus handelsübliche Maus ESC Linien produzieren entwickelt. Dann entwickelte die MIST-Assay zu quantifizierensynaptische Inhibition als Reaktion auf mit Zelt und BoNT / A / G Rausch. Während die MIST-Test kann auf jedem synaptisch aktive Neuronenpopulation (zB primäre Neuronen oder Gehirnscheiben) durchgeführt werden, die derzeit ESN sind die einzige in vitro abgeleitet Neuronenmodell, die reproduzierbar entwickelt emergent Netzwerk Verhalten und ist damit für die MIST-Test geeignet.
Herstellung ausreichender Mengen von Neuronen des definierten Linie für CNT Studien erforderlich mehrere Innovationen in ESC Kultur und Differenzierung. Erstens, indem für das Züchten und WSR, die Suspension Adaption überleben können, eliminiert man die Gefahr der Verunreinigung durch die Feeder-Zellen und die Notwendigkeit der Feeder-Zellen zu Beginn der Differenzierung reinigen von WSR. Obwohl die molekularen Mechanismen, Suspensions-Anpassung zugrunde liegenden nicht bekannt sind, bleiben in Suspension angepasst WSR mitotisch aktiven behalten Oct3 / 4-Expression und weiterhin neurogene sein. Unter Verwendung dieses Verfahrens ~ 1.5 x 10 7 ESCs werden in der Regel erholt jeden Durchgang. Zweitens wurde die Produktion von NPCs, indem mechanische Bewegung, um eine Agglomeration während der Differenzierung zu verhindern, angeblich zunehmenden Nährstoff Zugang zu den Innenräumen von Zuschlagstoffen erhöhte ~ 300%. Während des Verfahrens haben wir festgestellt, dass das Serum für die ESC-Kultur und die neuronale Differenzierung verwendet wird, die die kritische Komponente bei der Aufrechterhaltung neurogener WSR. Für beste Erfolg, empfehlen wir Aussetzung Anpassung ES-Zellen auf jede Menge Serum und Lagerung Serum bei -20 ° C bis ESC Kultur und neuronale Differenzierung durch das Ablaufdatum zu unterstützen.
Wie bei den meisten synaptisch aktiven Kulturen, DIV 14 + ESN sind sehr anfällig für plötzliche Veränderungen in pH-Wert, und sogar eine kurze Exposition gegenüber atmosphärischen CO 2 -Konzentrationen können die Neurotoxizität von 24 h ergeben. Für Experimente Behandlung von Kulturen, gefolgt von Inkubationen dauerhafte O / N oder mehr, Neuronen sollten direkt behandeln erfordern in der Inkubator oder auf einen konstanten CO 2 Kammer vor dem Experiment übergeben.
Eine Vielzahl von Techniken bestätigt Neurogenese und neuronalen Reifung einschließlich ICC, Transkriptionsprofiling und Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie. Die zeitlichen Änderungen in der Genexpression und das Neuron Morphologie waren konsistent mit einem schnellen Fortschreiten durch den Entwicklungsstadien der Neurogenese und durch DIV 16 ESNs zeigte erregenden und hemmenden Miniatur postsynaptischen Ströme mit emergent Netzwerk Verhaltensweisen 16. Der Nachweis der synaptischen Aktivität vorgeschlagen, dass ESN kann die Pathophysiologien für die klinischen Symptome von Botulismus und Tetanus verantwortlich replizieren. Dies wurde durch die Verwendung MIST, dass Vergiftungen mit BoNT / A / G oder Zelt beeinträchtigt mEPSC Frequenzen von> 95% im Vergleich zu Vehikel-behandelten oder unbehandelten Neuronen zeigen, bestätigt.
Messungen der Sensibilität der MIST für BoNT / A zeigte eine mediane hemmendenbei 20 Stunden nach dem Bad zusätzlich Konzentration (IC 50) von 0,013 pm (entsprechend 0,5 Maus tödlich Einheiten / ml) und einem Grenzwert-of-Detektion unter 0,005 pM, gemessen. Basierend auf diesen Werten ist MIST etwa doppelt so empfindlich wie und 2-4 mal schneller als die MLA und 30-fach empfindlicher als Immunoblot-Nachweis von gespalten SNAP-25.
Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass vernetzte Populationen von Stammzellen gewonnenen Nervenzellen bieten eine physiologisch relevante, zellbasierten Modell des Rausches. In Kombination mit verbesserten Methoden zu vernetzten ESN Kulturen aus in Suspension angepasst WSR abzuleiten, sollte die Verwendung von MIST die Notwendigkeit von Tierversuchen und die damit verbundenen Nachteile, Kosten und ethische Bedenken des MLA reduzieren und gleichzeitig eine schnelle, empfindliche und spezifische Maß Rausch. Obwohl Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie ist ein niedriger Durchsatzverfahren zur Identifizierung der Anwesenheit von aktiven Neurotoxine, bietet es eine Auflösung und speed, die unerreichbar ist mit molekularen Methoden. Diese Ergebnisse belegen auch, dass die Anwendung der aktivitätsabhängigen Methoden synaptische Aktivität zu bewerten und das Netzwerkverhalten kann eine rasche und spezifischen Nachweis von Neurotoxinen zu ermöglichen. Solche höheren Probendurchsatz geeignet wäre mechanistische Studien, therapeutische Screening oder diagnostische Tests möglich für eine breite Palette von neuromodulatorischen Mittel, einschließlich der CNTs zu machen.
Acknowledgments
Gemeinsame Wissenschaft und Bürotechnik, Medizinische S & T-Abteilung (Zuschuss Zahlen CBM.THRTOX.01.10 - Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Nationalen Institut für Allergien und Infektionskrankheiten (IAA Anzahl AOD12058-0001-0000) und der Defense Threat Reduction Agency finanziert .RC.023 und CBM.THRTOX.01.RC.014). Diese Studie wurde durchgeführt, während PB hielt eine Defense Threat Reduction Agency-National Research Council Forschung Associateship Preis und KH hielt eine Forschungs Associateship Auszeichnung National Research Council. Wir danken Angela Adkins und Kaylie Tuznik (USAMRICD) für technische Hilfe; und Cindy Kronman (USAMRICD) für die redaktionelle Unterstützung. Die in diesem Artikel gibt die Meinung der Autoren und nicht die offizielle Politik der der US-Armee, Department of Defense, der US-Regierung oder zu reflektieren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1. ESC and ESN | |||
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC culture medium Formulation and notes: 500 mL |
| 100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 6 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 6 mL |
| ES qualified FBS | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 90 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 3 mL |
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 1.1 mL |
| 107 Units/mL LIF | Millipore | ESG1107 | 60 μL |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC differentiation medium Formulation and notes: 436.6 mL |
| 100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL |
| ESC-qualified serum | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 50 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 0.9 mL |
| Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Media: NPC trypsinization medium Formulation and notes: 100 mL |
| 0.5 M EDTA (18.3%) | Sigma-Aldrich | 3690 | Media: freeze in 5 mL aliquote Formulation and notes: 0.266 mL |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | 50 mg |
| Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Media: Surface coating solutions Formulation and notes: 2.5 µg/mL in H20 |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigma-Aldrich | P7280 | Media: use within 1 wk Formulation and notes: 100 µg/mL in H20 |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 5 µg/mL in H20 |
| DMEM/F12 + GlutaMAX | Life Technologies | 10565-018 | Media: NPC culture medium Formulation and notes: 492.5 mL |
| 100x N2 vitamins | Life Technologies | 17502-048 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888-022 | Media: ESN culture medium Formulation and notes: 482.5 mL |
| 50x B27 vitamins | Life Technologies | 17504-044 | Media: store at 4 °C for up 1 month Formulation and notes: 10 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| 5-fluoro-2'-deoxyuridine (5FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | Media: 2000x Mitotic inhibitors aliquot and store at -20 °C Formulation and notes: dd 150 mg 5FDU and 350 mg uridine to 10 mL Neurobasal A. Sterile filter, aliquot and freeze. Use 2000x in ESN culture medium. |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| TrypLE Express Trypsin | Life Technologies | 12605-010 | Media: Miscellaneous Formulation and notes: store at RT |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | store at RT |
| soybean trypsin inhibitor (STI) | Sigma-Aldrich | T6414 | store at -20 °C |
| ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | store at RT |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Prepare 100 mM stock by dissolving 100 mg ascorbic acid in 5.7 mL of 50:50 DMSO/ethanol mix. |
| retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | Resuspend 15 mg RA in 9 mL 50:50 DMSO/ethanol. Supplement with 1 mL of 100 mM ascorbic acid stock. Aliquot and stored at -80 °C. Stable for 6 mos. |
| Table 2. MIST | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: Extracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 58.44 MW: 140 |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60135 | Media: (ERB; pH = 7.3, 315 mO) Final Concentration (mM): 74.56 MW: 3.5 |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 119.98 MW: 1.25 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Final Concentration (mM): 110.98 MW: 2 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | Final Concentration (mM): 180.16 MW: 10 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
| K-gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Media: Intracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 234.5 MW: 140 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: (IRB; pH = 7.3, 320 mO) Final Concentration (mM): 58.44 MW: 5 |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 507.18 MW: 2 |
| Li-GTP | Sigma-Aldrich | G5884 | Final Concentration (mM): 523.18 MW: 0.5 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 110.98 MW: 0.1 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | 380.35 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
| bicuculline | Tocris | 131 | Media: Miscellaneous Final Concentration (mM): 0.01 MW: 417.85 |
| CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Final Concentration (mM): 0.01 MW: 276.12 |
| Tetrodotoxin | Sigma-Aldrich | A8001 | Final Concentration (mM): 0.005 MW: 645.74 |
| BoNT/A-/G | Metabiologics | N/A | Media: Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
| Tetanus toxin | Sigma-Aldrich | T3194 | Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL-2 | Final Concentration (mM): N/A MW: N/A |
| Table 3. Equipment and Software | |||
| MiniAnalysis (version 6.0.7) | Synaptosoft, Inc. | N/A | Event detection software |
| Igor Pro (version 6.22A) | WaveMetrics | N/A | Software for visualization of recordings |
| Patchmaster | Heka | N/A | Data acquisition software |
| Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | N/A | |
| micromanipulator | Sutter Instrument | MPC-365 | |
| patch-clamp amplifier | Heka | ECB10USB | |
| micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| borosilicate capillary tubes | Sutter Instrument | B150-86-10 | Corning 7740 |
| 18 mm glass coverslips | Fisher | 12-545-84 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| cell strainer (40 µm) | Fisher | 08-771-1 | |
| Stovall Belly Dancer Shaker | Fisher | 15-453-211 | |
| low adhesion dishes | Fisher | 05-539-101 | Corning 3262 |
| bacterial dishes | VWR | 25384-302 | 100 x 15 mm |
References
- Simpson, L. L. Identification of the major steps in botulinum toxin action. Annual Review Of Pharmacology And Toxicology. 44, 167-193 (2004).
- Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene. The Journal Of Infectious Diseases. , (2013).
- Singh, B. R. Botulinum neurotoxin structure, engineering, and novel cellular trafficking and targeting. Neurotoxicity Research. 9, 73-92 (2006).
- Larsen, J. C. U. S. Army botulinum neurotoxin (BoNT) medical therapeutics research program: past accomplishments and future directions. Drug Development Research. 70, 266-278 (2009).
- McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research. Biochem Bioph Res Co. 405, 85-90 (2011).
- Eubanks, L. M., et al. An in vitro and in vivo disconnect uncovered through high-throughput identification of botulinum neurotoxin A antagonists. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2602-2607 (2007).
- Pellett, S., et al. Sensitive and quantitative detection of botulinum neurotoxin in neurons derived from mouse embryonic stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 404, 388-392 (2011).
- Mesngon, M., McNutt, P. Alpha-Latrotoxin Rescues SNAP-25 from BoNT/A-Mediated Proteolysis in Embryonic Stem Cell-Derived Neurons. Toxins. 3, 489-503 (2011).
- Kiris, E., et al. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).
- Whitemarsh, R. C., et al. Novel application of human neurons derived from induced pluripotent stem cells for highly sensitive botulinum neurotoxin detection. Toxicological Sciences. 126, 426-435 (2012).
- Hubbard, K. S., et al. High yield derivation of enriched glutamatergic neurons from suspension-cultured mouse ESCs for neurotoxicology research. BMC Neurosci. 13, 127 (2012).
- Brook, F. A., Gardner, R. L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 5709-5712 (1997).
- Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 8424-8428 (1993).
- Hubbard, K., Gut, I. M., Lyman, M. E., McNutt, P. M. Longitudinal RNA sequencing of the deep transcriptome during neurogenesis of cortical glutamatergic neurons from murine ESCs. F1000Research. 2 (35), (2013).
- Gut, I. M., et al. Novel application of stem cell-derived neurons to evaluate the time- and dose-dependent progression of excitotoxic injury. PLoS One. 8, e64423 (2013).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 8, 1454-1468 (1988).
- Capek, P., Dickerson, T. J. Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection. Toxins. 2, 24-53 (2010).
- Raciborska, D. A., Trimble, W. S., Charlton, M. P. Presynaptic protein interactions in vivo: evidence from botulinum A, C, D and E action at frog neuromuscular junction. The European Journal Of Neuroscience. 10, 2617-2628 (1998).
- Baskaran, P., Thyagarajan, B. Acute and chronic effects of botulinum neurotoxin a on the mammalian neuromuscular junction. Muscle & Nerve. 50, 206-215 (2014).
