Abstract
Presynaptically hedeflenen Klostridial nörotoksin (CNT) Terapötik ve mekanik çalışmalar işleyen sinaps üreten ve zehirlenmesine fizyolojik yanıtlar uğrar ölçeklenebilir, hücre bazlı modele ihtiyaç tarafından sınırlı kalmıştır. İşte biz verimli sinaptik aktif ağ nöronların tanımlanan soy içine fare embriyonik kök hücreler (EKH) ayırt etmek için basit ve sağlam bir yöntem tarif. 8 gün farklılaşma protokolü takiben, fare embriyonik kök hücre kaynaklı nöronlar (ESNs) hızla, ifade ve neurotypic proteinleri bölümlendirirse nöronal morfolojileri oluşturan ve içsel elektrik tepkiler geliştirmek. Inhibitör dengesini: farklılaşma sonra 18 gün (DIV 18) tarafından, ESNs aktif glutamaterjik ve γ-amino butirik asit (GABA) kolinerjik sinaps ve eksitatör ile karakterize acil ağ davranışları sergilerler. CNTs ile zehirlenme işlevsel böylece th kopyalayan, sinaptik sinir iletimini antagonize belirlemek içine botulizme veya tetanoz klinik belirtileri sorumlu patofizyoloji, tüm hücre yama kelepçe elektrofizyoloji tetanoz nörotoksin (TeNT) veya botulinum nörotoksin maruz kalan ESNs spontan minyatür uyarıcı post-sinaptik akımları (mEPSCs) (BoNT) ölçmek için kullanılan in vivo serotip / A / G. Tüm durumlarda, ESNs 20 saat içinde sinaptik aktivitenin yakın tam bir kayıp göstermiştir. Değişmeden istirahat membran potansiyelleri ve içsel elektrik tepkiler gösterdiği gibi sarhoş nöronlar, canlı kalmıştır. Bundan başka, bu yaklaşımın hassasiyetini karakterize etmek için, sinaptik etkinliği üzerindeki zehirlenme doza bağlı etkileri, BoNT / A'nın ilave edildikten sonra 20 saat ölçüldü. 0.005 uM, BoNT / A Zehirlenmesi 0.013 pM medyan inhibitör konsantrasyonu (IC50) ile mEPSCs önemli bir azalma ile sonuçlanmıştır. Medyan doz Karşılaştırmalar sinaptik inhibisyon fonksiyonel ölçümler daha hızlı, daha spesifik ve kapanın daha duyarlı olduğunu göstermektedirklivaj deneyleri ya da fare letalite deneyi. Bu veriler, CNTs yüksek düzeyde spesifik ve hassas bir şekilde tespit sinaptik bağlanmış, kök hücre türevli nöronların kullanımını geçerli.
Introduction
Bu yöntem genel amacı, işlevsel olarak klostridial nörotoksin maruz kök hücre türevli nöronların ağ kültürlerinde sinaptik etkinliği değerlendirmektir. Bu işlevsel botulizm klinik belirtileri sorumlu patofizyolojilere çoğaltır ve CNTs, terapötik tarama ve mekanik çalışmalar tespiti için uygun bir model olarak ESNs doğrular bir in vitro elde edilen modelin ilk gösteri.
BoNTs Clostridium türlerinin üyeleri tarafından üretilen oldukça ölümcül bakteri nörotoksinler vardır. Son zamanlarda önerilen, BoNT / H de dahil olmak üzere, sekiz antijenik olarak farklı BoNT serotip (/ A / H) 1,2 tarif edilmiştir. Tüm serotipler 150 kDa peptid olarak ifade edilmiştir çeviri sonrası bir disülfid bağı ile bağlı 3 100 kDa'lık bir ağır zincir (HC) oluşan bir iki zincirli ve 50 kDa'lık bir hafif zincir (LC) üretilmesi için çentikli. HC presinaptik alıcıları ve ent bağlanma aracılıksinaptik endositoz yoluyla nörona toksin gelmelidir. Endosome işlem sırasında, HC presinaptik sitozolüne LC translokasyonu kolaylaştırılması, kese zarında bir gözenek oluşturmak için yapısal yeniden örgütlenmesini uğrar. LC daha sonra, spesifik hedef ve presinaptik bölmeye böler eriyen n -ethylmaleimide duyarlı füzyon bağlama proteini reseptörü (tuzak) proteinleri, SNAP-25 (BoNT / A / C / E) VAMP2 (BoNT / B / D, / F / G) veya sintaksin (BoNT / C), 1. Bu tuzak proteinlerinin herhangi birinin bölünmesi ve böylece nörotransmitter salımını bloke sinaptik ekzositozu makine aksamını önler. Verimli nöronal hedefleme ve presinaptik lokalizasyon Bu kombinasyon en güçlü zehirler 0.1 gibi düşük tahmini insan öldürücü dozlarda bilinen BoNTs vermektedir - 1 ng / 1 kg.
Biyokimyasal testler yüksek hassasiyet ile CNT LC'lerin varlığını veya aktivitesini tespit etmek için de kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yöntemler, i başarısız, bağlama girmek için toksinin yeteneğini nterrogate, etkinleştirmek ve nöronlar içinde fonksiyon ve bu nedenle aktif toksin varlığı dolaylı ve muhtemelen yanıltıcı önlemler vardır. Bunun aksine, bu tür bir fare letalite deneyinde (MLA) ve zehirlenme fonksiyonel tahliller, kapsamlı Toksin aktivitesi daha fazla ve özel değerlendirmeler, başarılı bir şekilde alımı ve aktivasyon tüm aşamalarını müzakere CNTs yeteneğinin değerlendirilmesi. MLA BoNT algılama altın standardı olduğu gibi, herhangi bir son nokta olarak ölüm kullanan bir in vivo yöntem, ve bu nedenle, bir araştırma platformu olarak sınırlı bir kullanıma sahiptir. Mekanik çalışmalar ve tedavi tarama için uygun CNT zehirlenme hücre tabanlı modelleri geliştirmek için girişimleri de önemli kısıtlamalar uğramış. Primer nöron kültürleri fizyolojik uygunluğu yüksek bir derecesi birlikte, bunların kullanımı, yüksek kaynak maliyeti, nispeten düşük bir verim, çoklu nöronal alt varlığı da dahil olmak üzere bir dizi faktöre göre karmaşıktırtürleri ve hayvan kullanımı ile ilgili kapsamlı yasal ve idari gözetim. Birincil nöronlar için bir alternatif olarak, bu gibi nöroblastom ve adrenal kromafin hücreleri (kimyasal uyarımı ile nöron-benzeri özelliklerini kabul etmek indüklenebilir), nörojenik hücre çizgileri zehirlenme, in vitro modellerde olduğu gibi kullanılmıştır. Bu hücreler indüksiyon öncesi sürekli olarak kültür olduğu için, yüksek ölçeklenebilir ve orta hacimli yaklaşımlar için bu nedenle son derece uygundur. Kaynaklı fenotipleri, genellikle heterojen CNTs zayıf bir hassasiyete sahiptirler ve işleyen sinaps 4 içine monte öncesi ve post-sinaptik bölmeler oluşturmak için yetersizlik gibi kritik nöronal davranışlar sergileyen başarısız beri Ancak, alaka sorgulanabilir. Fizyolojik sağlam presinaptik bölümlerinde yokluğunda, toksin tam aralığı: nöron etkileşimleri taklit edilemeyen ve zehirlenme dolayısıyla fonksiyonel ölçümler 5 mümkün değildir. Hayırt şaşırtıcı, mekanik çalışmalar veya bağlı nörojenik hücre hatları kullanan BoNTs için ilaç taraması in vivo ve birincil nöron çalışmaları 6 ile tutarsız bulgular sonuçlandı yapmak için çalışır.
Bu hücre kaynaklı merkezi sinir sistemi (CNS) nöronları kültürlenmiş hücre çizgileri 7-10 esnekliğiyle primer nöron alaka birleştiren BoNT araştırma için yeni nesil bir hücre bazlı bir platform ve kök olduğu önerilmiştir. Özellikle, fare kök hücre-türevli nöronlar (ESNs), BoNT / A / G fizyolojik dozlarda yüksek ölçüde duyarlı olduğu ve ayırıcı persistences, etkinlik geliştirilmiş zehirlenmesi ve bir serotip içeren zehirlenme in vivo yanıtları çok çoğaltmak için tespit edilmiştir -özel tesirleri 5,8,11. Bu davranışlar BoNT alınması, işlenmesi, ticareti ve aktivitesinin in vivo mekanizmalarına ESNs muhafaza düşündürmektedir. Sinaptik faaliyete Bununla birlikte, önleyiciY botulizm imza görülür ve bu nedenle CNTs ile zehirlenmeyi takip sinaptik etkinlik kaybı gösteren ESNs CNT çalışmaları için in vitro türetilmiş hücre bazlı modelinde uygun olduğu sonucuna önce gereklidir.
Sinaptik etkinliği üzerindeki CNTs ile zehirlenme etkisini ölçmek için, tam hücre patch-clamp elektrofizyoloji araç ile tedavi edilen ya da CNT ile muamele DIV 21 ± ESNs monosinaptik akımları ölçmek için kullanıldı. Biz, BoNT / A / G ya da çadır ESNs bu zehirlenmesi her durumda, 20 saat içinde sinaptik etkinlik>% 95 kaybına neden bulundu. BoNT / A'nın 0.005 pM altında tespit sınırı ve 0.013 uM bir IC50 değeri ile birlikte, sinaptik etkinliği üzerindeki doza bağımlı bir etki ortaya ile daha ileri düzeyde karakterizasyonu, zehirlenmeden sonraki 20 saat gerçekleştirilmiştir. Bu bulgular zehirlenme elektrofizyolojik algılama hassasiyeti ve zaman çerçevesi oldukça karşılaştırılabilir immünoblot-tabanlı Ana üzerinden geliştirilmiş olduğunu göstermektedirsinaptik aktif nöron kültürlerinde zehirlenme fonksiyon ölçümleri daha duyarlı ve hızlı yöntemler kolaylaştırabilir gösteren SNAP-25 parçalanmasının ve in vivo fare letalite deneylerde lize, BoNT hücresel yanıtı ortaya çıkarmaktır.
Protocol
EKH 1. Adaptasyon Hücre-serbest Süspansiyon Kültürü Besleyici için
- 37 ° C'de çözülme EKH buz şerit kalana kadar.
- 10 6, önceden ısıtılmış ESC ortamı 10 ml su ihtiva eden bir sigara doku kültürü ile muamele edilmiş çanak EKH ayrışmış x 2.5 - P1000 pipeti kullanarak, yavaşça 1 aktarın. 37 ° C'de 20 saat% 5 CO2 için nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatörü içinde inkübe edilir.
- 20 saat sonra, yavaşça 10 ml serolojik pipet kullanarak 15 ml konik tüp süspansiyon kültürü aktararak hücreleri yıkayın. 200 x g'de 3 dakika boyunca Pelet ESCs. Spin sırasında, düşük-yapışma çanak geri taze ESC orta 10 ml ekleyin.
- Süpernatant aspire, özen hücre pelet yerinden oynatmamaya önlemek ve 1 ml pelet hücre taze ESC orta ekleyin. P1000 pipet kullanarak bakteriyel çanak hücreleri aktarın ve inkübatör dönmek.
- Agrega çıplak gözle (genellikle 4 görünür hale gelene kadar günlük hücreleri uyun - 8 gün (d); agrega 0.2 olacak- 0,5 mm). Agrega 4 d sonra belirgin değilse, adım 1.3 tekrarlayın. Agregalar görebilir sonra, ayırmak ve Bölüm 2'de tarif edildiği gibi EKH korur.
2. ESC Pasajlanması ve Bakım
- ESC 15 ml steril 10 ml'lik pipet kullanarak konik tüp agrega aktarın ve agrega kompakt pelet yerleşmek için izin (genellikle 3-5 dakika). Süpernatant aspire dikkat ederek hücre pelletini bozmamak ve 5 ml PBS ile agrega yıkayın. Yerçekimi dinlendirme 2.5 dakika boyunca 100 xg'de, alternatif pelet hücreleri tavsiye edilir rağmen yerine zaman kazanmak için.
- PBS aspire ve 500 ul tripsin ekleyin. 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde, 3 dakika süre ile tripsine yığışmalar inkübe edin. Tripsin sulandırmak ve yavaşça agrega kırmak için P1000 pipet ile 10 kez çiğnemek için 500 ul ESC orta ekleyin. Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
- Pelet 1.0 bir son konsantrasyona kadar, 200 x g ve tekrar süspansiyon hücreleri 3 dakika boyunca hücreler ayrışmışESC ortamında x 10 7 hücre / ml olmuştur. Aktarım 150 10 cm'lik bir bakteri tabağına taze ESC ortamı 10 ml ul (1.5 x 10 6 hücre) ve 48 saat doku kültürü kuluçka makinesine geri döner. % 10 DMSO, veya atılır ile takviye edilmiş% 90 ESC ortamda 5 x 10 6 hücre / mL - Aşırı EKH 1 ile dondurulan, ayırt edilebilir.
- Passage her 48 saat toplar. Geçişi için hazır Agregalar 0,5 mm'den çapları, açıkça görünür olacaktır.
NOT: - 1.4 dondurulan, süspansiyon-adapte hücrelerin Çözülme ve kültür adımları 1.2 başına gerçekleştirilir. 72 saat - Agregalar 48 içinde pasaj için hazır olacak.
3. Nöronal Farklılaşma
NOT: - öğleden sonra önce öğle 3.5 ve 3.7 adıma Davranış 3.1 adımları. Farklılaşma prosedürlerinin bir görünümü, Şekil 1A'da gösterilmiştir.
- 2.5 - 2.1 adımda olduğu gibi EKH ayrıştırmaları. Disosiye Devri 350 ul (3.5 x 10 6)25 ml farklılaşma ortamı içeren bir 10 cm'lik düşük bağlanma çanak d EKH. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de, bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde 45 rpm'de - 30 olarak ayarlanmış bir yörüngesel çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Bu farklılaşma ilk günü, in vitro (DIV) içinde adlandırılan gün -8.
NOT: ultra-düşük bağlanma çanak kullanımı yönteminin maliyetini artırır, ancak agrega bazen Petri kapları uymak beri bakteriyel Petri kapları biraz daha büyük verim üretir. Farklı çanak boyutları tercih edilir ise, orta hacimleri ve hücre numaraları buna göre ölçeklendirilebilir. - 48 saat (DIV -6) eklendikten sonra, 50 ml konik bir tüp ayırt hücre agrega aktarmak için 25 ml'lik bir pipet kullanın. Hemen Petri kabı farklılaştırma ortamının taze 25 ml ekleyin.
- 2 mm derinliğinde - 1 görünür pelet üretiminde, 5 dakika - agrega üzerinde 2 yerleşmek için izin verin. Süspansiyon kalan tek hücreler veya küçük agrega geçiyoruz. Dikkatle orta aspire ve ce transferill geri P1000 kullanılarak petri pelet. Bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde, döner bir karıştırıcı üzerine yerleştirin.
- DIV -4 tekrar adım 3.2. 4 mm derinliğinde - pelet 2 olacaktır. Petri 6 uM all-trans retinoik asit (RA) ile takviye edilmiş 30 ml farklılaşma orta değiştirin. Ek bir 48 saat boyunca doku kültür inkübatörü içinde, döner bir karıştırıcı geri dönün.
- DIV -2 tekrar adım 3.3 at. Bu noktada derin 8 mm - pelet 4 olacak.
- DIV -1 anda, Bölüm 4 gibi kaplama yüzeyler hazırlamak.
- Bir doku kültürü kaputu 10 dakika ve yeri - DIV 0 durumunda, 5 37 ° C'de numune alınır ve önceden dondurulmuş NPC tripsinizasyon ortamın 5 ml eritin. Transfer, bir 50 ml konik bir tüp agrega farklılaştırılması, 25 ml'lik bir pipet kullanılarak. Agrega yerleşmek ve dikkatle aspire orta izin ver. Yıkama agrega yıkamalar arasında yerleşmeye izin 10 mi, PBS ile iki kez pelet.
- İkinci PBS Yıkama işleminden sonra, pelet NPC tripsinizasyon ortamın 5 ml ilave edilir ve 37 ° C'de inkübe6, 5 dakika bekletilmiştir. Yavaşça 2.5 dakika sonra tüp fiske.
- Tripsin inaktive ve alt üst edilerek karıştırmak için,% 0.1 soya fasulyesi tripsin inhibitörü (STI) 5 ml. Nispeten homojen hücre süspansiyonu elde edilene kadar 10 ml serolojik pipet ile 15 kez - Yavaşça 10 çiğnemek.
- Yavaş yavaş 50 ml konik tüp üst yerleştirilen 40 mikron ya da 70 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu aktarın. Tüm süspansiyon filtre edildikten sonra, filtre içinden kalan hücrelerin yıkanması ve 200 x g hızında 6 dakika boyunca ayrışmış hücre süspansiyonu topak haline N2 ortamı içinde 1 ml.
- Pelet bozmadan orta aspire. 200 x g'de 5 dakika boyunca hücreler peletleme ve P1000 ile yıkamalar arasında öğütülerek, 10 mi N2 ortamı hücreler iki kez yıkanır. İkinci yıkama öncesinde, Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
- / Cm2 200.000 hücre - 150.000 hücre yoğunluğunda mi ve plaka ESNs başına 1 x 10 7 hücre N2 ortamında yeniden süspanse hücreleri.
- Yeni plat Transferinemlendirilmiş bir 37 ° C 'de doku kültürü kuluçka% 5 CO2 ile baskı ESNs ve Bölüm 5'te olduğu gibi muhafaza.
DIV 0 Kaplama Sinir Öncülerinin Kültür Yüzeyler hazırlanması 4.
- Kaplama en az 1 gün önce doku kültürü ile tedavi yemekler hazırlayın. (PEI, steril H2O içinde 25 ug / ml) yeterli polietilenimin ekleme veya poli-D-lisin (PDL, 100 ug / ml steril H2O içinde) O / N plastik tabaklar doku kültürü ile muamele edilmiş kapak ve kuluçkalanması 37 ° C.
- Kaplama sabah, iki kez damıtılmış H2O ile iki kez bulaşık yıkamak ve bir kez PBS ile yıkanmıştır. Son yıkamadan sonra, çanak karşılamak için yeterli N2 orta ekleyin (örneğin, bir 12-yuvalı tabak oyuk başına 1 ml ya da 6 cm'lik tabağı başına 4 ml) eklenmiştir.
- En az bir gün önce nöron kaplama 18 mm cam lamelleri hazırlayın. Plazmanın temizleme 4 dakika temizleyin lamelleri.
- Derhal bir alt, bir etanol ile yıkanmış parafilm temizlenmiş lamelleri aktarmakBüyük steril çanak ve adım 4.1 gibi hazırlanmış PEI veya PDL çözeltisi 400 ul ekleyin. Bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de O / N inkübe edin.
- Sabah, yıkama suyu ile üç kez lamelleri 1 PBS içinde 5 ug / ml laminin eklemek - 37 ° C de 3 saat süredir. Önceki nöronlar dissociating için, laminin aspire ve hemen yukarı bakacak tedavi tarafı tutmak için emin olmak NPC orta 1 ml içeren bir 12-iyi bir çanak bir kuyusuna lamel aktarın.
- Mağaza yemekleri ve 37 ° C'de lamelleri NPC plaka hazır olana kadar.
Nöronlar 5. Bakım
- Ve DIV 1, aspirat ortamı en N2 kültür ortamı ile değiştirin.
- Ve DIV 2 ve 4, aspirat ortamı içinde B27 kültür ortamı ile değiştirin.
- DIV 8, aspirat orta ve B27 kültür ortamı ihtiva eden mitotik inhibitörler ile değiştirin ve nöronal-olmayan hücreleri kirlenmesine neden ortadan kaldırmak için.
- DIV 12 at, B27 kültür ortamı ile değiştirin.
- DIV çıkarmayınHazır olana kadar% 5 CO2 den 12 + ESNs kullanımı.
Minyatür Uyarıcı Post-sinaptik Akımları miktarının için Sinaptik İletim (MIST) Tahlil 6. Ölçülen engellenmesi
DİKKAT: - 1 ng / kg Klostridial nörotoksinler 0.1 gibi düşük bir tahmini insan LD 50 değerleri ile bilinen en zehirli maddelerdir. Bu toksinler kullanarak ve uygun önlemleri kullanmadan önce gerekli onayları almak.
- Dikkatlice 37 ° C için arzu edilen nihai ESN kültür ortamında konsantrasyonu ve sıcak 100x, BoNT / A seyreltin. 21 + ESN kültürleri div kültür çanak girdap ve inkübatör dönmek için toksinin uygun hacmi ekleyin.
- Hücreler zehirlenmeden sonraki en fazla 4 saat analiz edilecek olursa, bu direkt olarak bir inkübatör içinde veya sürekli bir CO2 odası içinde,% 5 CO2 sökmeden çanağı ve girdap toksini ekleyin.
- Uygun zaman noktasında aspirasyonte ESN kültür ortamı ve hücre dışı kayıt tamponu (ERB) ile iki kez yıkanır. ERB ekleyin 4 ml, sırasıyla, aksiyon potansiyelleri engelleme ve GABA A reseptör aktivitesini antagonize, 5.0 uM tetrodotoxin ve 10 mcM bicuculline ile desteklenmiş.
- Elektrofizyoloji teçhizat çanak aktarın. Ne perfüzyon veya sıcaklık kontrol MIST deneyi için gereklidir.
- Direnç 5-10 mΩ ile kayıt pipet üretmek ve hücre içi kayıt tamponu ile doldurmak için bir mikropipet çektirmenin kullanarak borosilikat cam çekin. Yavaşça önce kayıt reaktif silikonlama doldurulan kayıt pipet batırın.
- Kayıt pipet ERB içine indirilmiş olduğu gibi, bir hava dolu şırınga kullanarak, pozitif basınç sağlar. Nazikçe kaydedilecek nöronun soma kayıt pipet indikten sonra, pozitif basınç kaldırmak ve bir gigaseal oluştururlar. MV -70 tutma gerilimi azaltın. Dikkatle tam hücreli konfigürasyonuna girmeye negatif basınç uygulayın.
- Izlemek ve membran potansiyeli istirahat kaydetmek için akım-kelepçe geçin. Sıvı değme potansiyelleri için düzeltme olmadan, istirahat membran potansiyeli -82 kadar -67 arasında mV olacaktır.
- Minyatür uyarıcı sinaptik akımları (mEPSCs) tespit etmek için 5 dakika - 4 için bir sürekli -70 mV voltaj-kelepçe kayıtları yapın.
- Aşağıdaki ayarlarla başak algılama yazılımını kullanarak mEPSC tespiti için kaydedilen verilerin 4 dakika analiz: Eşik, 5; Dönem yerel maksimum aramak için, 10.000 mikro saniye; Başlangıçta bir tepe önce saat, 5000 mikro-saniye; Dönem sönme süresi aramak için, 20.000 mikro saniye; Zirve Kesir, 0,37, bir çürüme zaman bulmak için; Dönem bir temel ortalama için, 1,000 mikro saniye; Alan eşiği, 20; Ortalama zirve, 1 puan sayısı; Zirve yönü, negatif.
- Toplayın ve tespit edilen olaylar hakkında bilgi kaydetmek. Hz mEPSC sıklığını belirlemek için 240 ile 4 dakika içinde tespit olayların sayısını bölün.
- 12 cont - 8 mEPSC frekansları toplayınRols 8 - Her bir maruz kalma durumu 12 BoNT ile tedavi edilen örnekleri. Yaşa ve çok uyumlu kontrollere karşı frekans analiz. Tek yönlü ANOVA testi ve Dunnett post-hoc testi ile sinaptik aktivitenin% inhibisyon istatistiksel olarak anlamlı belirler.
Representative Results
(Şekil 1A 'da detaylı olarak verilmiştir) fare EKH son derece saf bir kök hücre türevli nöronların büyük miktarlarda ekonomik üretimi 8,11 sağlayan bir farklılaşma protokolü geliştirilmiştir. Bu yöntem, yeniden üretilebilir tanımlanan soy 12-14 nöronlara özel üretilen ve ticari olarak temin edilebilen ESC hatları ayırt etmek için yıllık bir süre içinde kullanılmıştır. Bu protokolün kritik unsurları hücre serbest süspansiyon kültürü besleyici için EKH (1) adaptasyon arasında; Süspansiyon kültürlerinin (2) uygun bir teknik; Döner şartlar altında (3) farklılaşması. Süspansiyon kültürü Geçiş süresini önemli ölçüde ve ESC bakım maliyetini azaltır, ve öncesinde farklılaşma besleyici hücreleri çıkarmak için gereğini ortadan kaldırır. Süspansiyon hale getirilmesinden, Oct3 / 4 ekspresyonu (Şekil 1B-D Pluripotency markerlerin ifadesi değiştirmediğini süspansiyon uyum gösteren, en az 30 pasajlar ile tutarlıdır 7 hücre aştığında ESCs nöronal farklılaşması için uygundur. Bu genellikle süspansiyon adaptasyon sonra on pasajlar veya daha önce süspansiyon-adapte olan EKH eridikten sonra beş pasajlar içinde oluşur. Agrega ayırt mekanik dönüşü de artmış nöronal verim kritik olduğu bulunmuştur. bir döner sallayıcı eklenmesi toplam viyabilitesini artırmaya ve DIV 0 (Şekil 1E) nöral projenitör hücreleri (NPC) verimle ~% 300 artış meydana süper agregat oluşumunu ortadan kaldırmıştır.
Tipik bir farklılaşma DIV de 3,5 x 10 6 EKH ile başlar -8 ve hayatta kalmak ve nöronlar olacak kabaca% 60 olan DIV 0 115 x 10 6 NPC, üretir. Geri kalan% 40 nöronal-olmayan hücreleri içerir ve büyük ölçüde DIV 0 ile serumdan yoksun kalma ile elimine edilir - glia devam eden az sayıda mitotik inh eklenmesiyle uzaklaştırılabilir 1.DIV gelen ibitors 2-4 veya DIV 8 - 12. Kaplama yoğunluğu DIV 0 kritik olduğu; Çok seyrek kaplama nöronlar 2 hafta ötesinde hayatta olmaz. Kaplama gün içinde, farklılaşmış nöronlar nöronal morfolojileri sergilerler ve bu somatodendritik işaretleyici map2 ve aksonal işaretleyici Tau (Şekil 2A) gibi neurotypic proteinleri, bölümlere. DIV 14 sinapsin-1 + puncta sinaps oluşumu düşündüren aksodentritik arayüzleri, tespit edilebilir. Bu 7 8,11 Div önce sinaptik işaretleyici proteinlerin ekspresyonu ile tutarlıdır. Nöronal morfolojileri DIV 21 yoluyla olgun olduğu zaman, kültür ayrıntılı aksodentritik milleri ve büyük sinaptik puncta (Şekil 2A) sergilemeye devam eder. Uygun muhafaza durumunda ESNs kaplama sonrası, en az 4 hafta süreyle uygulanabilir ve aktif kalır.
RNA sıralama kullanarak Boyuna ifade profil nöronal belirtim bir morfolojik ve proteomik kanıt doğrulanmıştır11,15 olgunlaşma d. Gelişim ilerlemesinin Örnek belirteçleri Oct3 / 4, Nestin, DCX, neuN ve KCC2 (Şekil 2B) olmak üzere safha spesifik ekspresyon profillerini sergilemiştir. DIV 0 olarak, ESNs map2 ve Tau dahil nöron-spesifik yapısal proteinlerin, bol kopyalarını ifade etti. Önceki bulgularla tutarlı olarak, sadece iki nöronal alt tipleri için belirteçler gözlendi: VGlut2-ifade Beyin / orta beyin glutamaterjik nöronlar ve GABA'erjik internöron 8. Buna karşılık, glutamaterjik ve GABA'erjik belirteçleri geniş bir dizi nörotransmitter salınımı için gerekli ön-sinaptik Snare proteinler içeren DIV 0 ve DIV 7 arasındaki ifadesinde keskin artışlar, sergilenen; post-sinaptik tepkileri için gerekli nörotransmiter reseptörleri; ve iskeleler proteinleri post-sinaptik zar reseptörleri için, bu halata için gerekli zamandır. Nöronlar DIV DIV 14 ve spontan minyatür uyarıcı post-sinaptik akımlar tarafından olgun içsel elektrik özelliklerini sergilemek16 16.
Sinaptik İletim (MIST) tahlilinde ölçülen engellenmesi sinaptik etkinliği üzerindeki zehirlenme etkisini değerlendirmek için kullanıldı. Sarhoş ve araç ile tedavi edilmiş DIV 24 arası + ESNs mEPSC frekansları karşılaştırarak, MIST sinaptik etkinliği (Şekil 3A) fonksiyonel inhibisyonuna dayalı zehirlenme niceliksel ve belirli bir ölçüm sağlar. MIST her toksin banyosu eklemeden sonra 20 saat sonra ESNs sinaptik etkinliği üzerindeki, BoNT / A / G ya TeNT etkilerini ölçmek için kullanıldı. Toksinler için eşdeğer bir konsantrasyonda ilave edildi, 10 misli, daha önce SNARE proteini bölünme 11 bağışıklık-beneklenme analizi ile tespit edildiği üzere, EC50 değeri. Bütün toksinler, araçla tedavi edilen kontrol az% 5 mEPSC frekansları azaltmıştır. Sinaptik oranlarındaki azalmalar sarhoş ESNs yamalı olma yeteneğine sahip olması nedeniyle, ölüm veya değiştirilmiş iç yanıtları hücre atfedilebilecek değildi tekrarlanan aksiyon potansiyelleri ateşve mevcut enjeksiyonuna bağlı olarak membran potansiyeline (Şekil 3B, C), dinlenme halinde herhangi bir anlamlı bir değişiklik sergilemiştir.
CNT, saptama ve ortalama inhibe edici konsantrasyon limiti (IC 50) tespit etmek için mevcut yöntemlere MIST duyarlılığını karşılaştırmak ESNs için, BoNT / A'nın ilave edildikten sonra 20 saat belirlenmiştir. Az 0.005 pM, BoNT / A'nın intoksikasyon bir IC50 0.013 pM değeri ile 12:05 (Şekil 4A) yukarıdaki sinaptik aktivitenin tamamen susması ile mEPSC sıklığında istatistiksel olarak önemli bir azalma üretti. Bu IC50 değeri yaklaşık olarak 0.5 fare öldürücü birim / ml, bu MIST gösteren hassas iki kat ve 2- BoNT / A'nın mevcudiyetini tespit hızlı MLA 4'ten kat karşılık gelir. SNAP-25 parçalanmasının immünoblot ölçümleri MIST yaklaşık duyarlı 30 misli olduğunu gösteren, 12:38 ve 12:05 arasında minimum bulgulanabilir dozun bir EC50 değeri ürettiklivaj tuzak protein (Şekil 4B) immunoblot tabanlı algılama daha.
Şekil 1. Süspansiyon adapte ESNs mitotikal stabil kalır ve pluripotensin belirteçler. ESC bakım ve farklılaşma (A) şematik. retinoik asit (RA), ya da lösemi önleyici faktör (LİF) varlığı ya da yokluğu + veya ile işaretlenmiştir -. Birincil nöron kültürlerinde için in vitro (DIV) ve klasik gelişim aşamaları (DS) gün arasında bir karşılaştırma 17 sağlanır. R1, D3 ve C57BL / 6J ES hücre hatları için (B), çoğalma oranları süspansiyon kültürü geçişten sonra beş yolu ile kararlı hale getirir. (C) veri süspansiyon kültüründe 25 pasajlar üzerinde ölçülen R1, D3 ve C57BL / 6J ES hücre hatlarında Oct3 / 4 ifadede hiçbir maddi değişiklik göstermektedir sitometri (AkışN = her biri için 6). (D) pasajlar 5 ve 30 (siyah çizgi) arasında ölçülen bir süspansiyon-adapte R1 ESC hattı için rutin Pasajlanması sırasında Gerçek hücre verimleri. Hiçbir hücre Pasajlanması sırasında atılır eğer Teorik kümülatif getirileri de (kırmızı çizgi) sunulmuştur. (E) statik (sol) veya döner koşullar (sağda) altında üretilen DIV 0 agrega Parlak alan görüntüleri. Döner koşullar, yığılma olmaksızın küresel topaklar üretilir ve (p <0.001, Student t-testi kullanılarak belirlenen) NPC 3 kat artış üretmektedir 11. * Bir P <0.05 gösterir. Bu rakam Hubbard ve ark. 11 modifiye edilmiş bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Şekil 2. Morfolojik, prnöronal tarifnamede ve olgunlaşma oteomic ve transkriptomik kanıt DIV 7 (A) İmmünositokimya -. DIV 49 nöronal arborization ve aksodentritik arayüzleri sinaptik puncta görünümünü göstermektedir. Aksonlar Tau (yeşil) ile etiketli, dendritler map2 (kırmızı) ile etiketli, pre-sinaptik bölme sinapsin (beyaz) ile etiketli ve çekirdekleri DAPI (mavi) ile boyandı. (B) gelişimsel aşama spesifik ifade gösteren ve nöronal alt tiplerinin belirterek temsili genlerin Boyuna ifade profilleme. Tüm gen transkriptleri hücre başına transkript yaklaşık sayısı olarak ifade edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. ESNs altında. BoNT / AG ve TeNT maruz kaldığında sinaptik aktivite engellenmesini gitmek (A) ESNs Temsilcisi izleri ve banyo ilavesinden sonra 20 saat toplanan ~ 10 x AK BoNT / A 50 değerleri - / G, TeNT veya araç. Her bir nörotoksin kontrollere kıyasla fazla% 95 oranında sinaptik etkinliği azalır. > N (B) sarhoş nöronları (BoNT / A'nın için gösterilmiştir, ancak, tüm alkollü kültürlerde görüldüğü gibi) ve (C) -C (, potansiyel negatif bir dinlenme membran herhangi bir değişiklik sergilemiştir akım uygulaması depolarize yanıt olarak tekrar AP yangın mümkün kalmıştır Her tedavi için 18). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
BoNT / içinde MIST duyarlılığı Şekil 4. Belirlenmesi A-tedaviESNs. (A), BoNT / A'nın banyosu eklemeden sonra sinaptik etkinlik 20 saat sis ölçümleri. Örnek voltaj-kelepçe iz bölümleri BoNT / A maruz kalma (sol taraf) aşağıdaki mEPSC sıklığında bir azalma sergiledi. MEPSC frekans kantitasyonu (çubuk grafik, sağ tarafta, n, kontroller için = 20, n = 11 - Her bir doz için 22) mEPSC sıklığında bir doza bağımlı azalma teyit etmektedir. medyan inhibitör konsantrasyonu, bir dört parametreli değişken eğimli (> 0.91 R2) kullanılarak non-lineer regresyon uygun bir en küçük kareler ile belirlenmiştir. ESNs içinde MIST tarafından tespit sınırı Not en az 0.005 pM'dir. (B), BoNT / SNAP-25 parçalanması içinde ESNs sonuçların bir zehirlenme jel mobilite vardiya ile görselleştirildiği gibi (sağ SNAP-25 parçalanmasının bir çubuk gösteren miktar ile sol tarafında temsili bir Western blot, n = 4) . Bir son nokta olarak SNARE protein parçalanmasını (SNAP-25) kullanılarak azalmış duyarlılık Not (AK 12:36 50) vs 50). * Bir P <0.05 gösterir; *** Bir P <0.001 gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
CNT tespiti, serotip tayini ve kantitatif için geçerli altın standart MLA olduğunu. MLA ev sahibi tüm aralığı sorgulayan: substratın in vivo cereyan ettiğine zehirlenmesi için gerekli olan toksin etkileşimleri (örneğin, toksin, bir hücre yüzey reseptörüne sitoplazmasına toksin-reseptör kompleksi, LC translokasyon içselleşmesini bağlayıcı +, LC-sebepli bölünme, ve sinaptik sinir iletiminin engellenmesi) 18. MLA zehirlenme fizyolojik ilgili bir model sunuyor olsa Ancak, kirletici tarafından eleştirilmiştir olabilir, yoğun kaynak olduğunu ve bir bitiş noktası olarak ölüm ile farelerin çok sayıda içerir. Seçenek olarak ise, BoNT saptanması ve nicelenmesi için hücreye dayalı tahliller, aynı zamanda, hayvan kullanımı ya da sinaps oluşturmaktadır ve tipik olarak nörotoksin 8 sensitivite gösteren başarısız nöroblastoma hücre çizgileri için gerekli primer nöron kültürlerinden, sınırlı olmuştur. Inci zehirlenme Bugüne kadar, çoğu ölçümlerese hücre tabanlı platformlar SNAP-25, VAMP1 / 2 veya sintaksin-1 11 proteolitik bölünme tespiti yararlanmıştır. SNARE protein bölünme doğru zehirlenmeden 19,20 den sarhoşluk veya kurtarma temsil olmayabilir, bu nedenle doğrusal olmayan in vivo sinaptik inhibisyonu ile ilişkili olduğu gösterilmiştir edilmiş ve çünkü bu problemlidir.
CNT tespiti için ideal hücre tabanlı model sistem (i) nöron temelli olacaktır; (Ii) sinaptik neurotypic elektrik cevapları ile birleştiğinde; (Iii) tüm CNT serotipleri veya alt tipler aşırı duyarlı olduğu; ve (iv) MLA üzerinde, düşük maliyetle ve hayvan kullanımını gerektirmeden eşdeğer veya geliştirilmiş olan teklif ölçeklenebilirlik, verimlilik ve tahlil süreleri. Bu gereksinimleri karşılamak için, biz piyasadan temin fare ESC hatlarından yüksek oranda zenginleştirilmiş, ağ glutamaterjik kültürleri ve GABAerjik nöronların büyük miktarlarda üretmek için bir yöntem geliştirdi. Daha sonra ölçmek için MIST deneyi geliştirilmiştiryanıt sinaptik inhibisyon TeNT ve BoNT / A / G ile zehirlenmesi için. MIST tahlil bir sinaptik aktif nöron popülasyon (örn, birincil nöronlar ya da beyin kesitleri) ile yapılabilir olmakla birlikte, şu anda ESNs yeniden üretilebilir acil ağ davranışları geliştirir ve bu nedenle MIST deneyi için uygun olan, in vitro türetilmiş nöron modeli vardır.
ESC kültür ve farklılaşma birkaç yenilikler CNT çalışmaları için tanımlanan soy nöronların yeterli miktarda gerekli üretmek. İlk olarak, seçilmesi ve süspansiyon adaptasyon hayatta EKH kültürlenmesiyle biz besleyici hücreler ve farklılaşma başlangıcında EKH besleyici hücrelerinin saflaştırılması için ihtiyaç ile kirlenme riskini ortadan kaldırmıştır. Süspansiyon-adaptasyon altında yatan moleküler mekanizmalar bilinmemektedir rağmen, süspansiyon-adapte EKH mitotik olarak aktif kalır, Oct3 / 4 ifadesini korumak ve nörojenik olmaya devam ediyor. Bu yöntem kullanılarak, ~ 1.5 x 10 7 DAVM'ler genellikle her geçit kurtarıldı. İkincisi, NPC üretimi görünüşte agrega iç besin erişilebilirlik artan farklılaşma sırasında yığılmayı önlemek için mekanik ajitasyon katarak ~ 300% arttı. Sürecinde, biz ESC kültür ve nöronal farklılaşma için kullanılan serum nörojenik EKH korumada en önemli bileşeni olduğunu bulundu. En iyi başarı için, biz süspansiyon serumu her bir lot için ES hücreleri uyarlama ve son kullanma tarihine kadar ESC kültür ve nöronal farklılaşma desteklemek için -20 ° C'de serum yığma öneririz.
En sinaptik aktif kültürleri gibi, DIV 14 + ESNs 2 konsantrasyonu, 24 saat içinde nörotoksisite neden olabilir pH ani değişiklikler ve atmosferik CO hatta kısa bir süre maruz karşı oldukça hassastır. O / N ya da daha fazla, nöronlar, doğrudan tedavi edilmelidir kalıcı inkubasyon ardından kültürlerin tedavi gerektiren deneyler için iinkübatör veya deney öncesinde sabit CO 2 odasına transfer n.
Çeşitli teknikler ICC, transkripsiyon profil ve tam hücre patch-clamp elektrofizyoloji içeren nöron ve nöronal olgunlaşma, doğruladı. Gen ifadesi ve nöron morfolojisi zamansal değişimler nöron gelişim aşamalarında hızlı ilerlemesi ile tutarlı ve DIV 16 tarafından, ESNs uyarıcı ve acil ağı ile inhibitör minyatür post-sinaptik akımlar 16 davranışları sergiledi. Sinaptik aktivite kanıtlar ESNs botulizm ve tetanoz klinik belirtileri sorumlu patofizyolojilere çoğaltmak düşündürmektedir. Bu, BoNT / A / G ya da araç ile muamele edilmiş ya da muamele edilmemiş nöronlara göre>% 95 TeNT bozulmuş mEPSC frekansları ile bu zehirlenmesi göstermek için MIST kullanılarak teyit edildi.
BoNT / A MIST duyarlılığı ölçümleri medyan inhibitör belirtilenkonsantrasyonu 0.013 (0.5 fare öldürücü birimler / ml eşdeğer) pM'lik ve sınırı-of-algılama 0.005 pM'lik altındaki (IC 50), banyo ilavesinden sonra 20 saat sonra ölçülen. 4 kat daha hızlı MLA az ve bölünmüş SNAP-25 bağışıklık-beneklenme tabanlı algılama daha duyarlı 30 kat - Bu değerlere göre, sis 2 yaklaşık olarak iki kat daha duyarlıdır ve.
Toplu olarak bu veriler, kök hücre türevli nöronların ağ popülasyonları zehirlenme fizyolojik olarak uygun, hücre bazlı bir model sunan ileri sürmektedir. Daha hızlı, duyarlı ve spesifik tedbir sağlarken süspansiyon-adapte EKH ağdaki ESN kültürleri elde etmek geliştirilmiş yöntemler ile birlikte, MIST kullanımı, hayvan testleri ve ilgili dezavantajları, masraf ve MLA etik kaygılar ihtiyacını azaltmak gerekir zehirlenme. Tam hücre patch-klempi elektrofizyoloji aktif nörotoksinlerin varlığını belirlemek için bir düşük verimli bir yöntem olmasına karşın, bir çözünürlük ve SPE sunarMoleküler yöntemler kullanılarak elde edilemezliği ed. Bu bulgular da aktivite bağımlı yöntemlerin uygulanması sinaptik aktivite değerlendirmek ve ağ davranış nörotoksinlerden hızlı ve spesifik algılamayı etkinleştirmek olabilir kanıtlar sunmaktadır. Böyle yüksek verim yaklaşımları CNTs dahil nöromodülatör ajanlar, geniş bir dizi için uygun mekanik çalışmalar, terapötik tarama veya tanı deneyleri yapacak.
Acknowledgments
Ortak Bilim ve Teknoloji Ofisi, Tıp, S & T Bölümü (hibe numaraları CBM.THRTOX.01.10 - Bu çalışma Sağlık Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (IAA numarası AOD12058-0001-0000) ve Savunma Tehdit Azaltma Ajansı Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse edildi .RC.023 ve CBM.THRTOX.01.RC.014). PB Savunma Tehdit Azaltma Dairesi-Ulusal Araştırma Konseyi Araştırma Associateship Ödülü düzenlenen ve KH Ulusal Araştırma Konseyi Araştırma Associateship Ödülü'nü tutarken Bu araştırma yapıldı. Biz Angela Adkins ve teknik yardım için Kaylie Tuznik (USAMRICD) thank; ve editoryal yardım için Cindy Kronman (USAMRICD). Bu makalede ifade edilen görüşler yazarlarına aittir ve Ordu Bölümü, Savunma Bakanlığı, ya da ABD hükümetinin resmi politikasını yansıtmamaktadır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1. ESC and ESN | |||
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC culture medium Formulation and notes: 500 mL |
| 100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 6 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 6 mL |
| ES qualified FBS | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 90 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 3 mL |
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 1.1 mL |
| 107 Units/mL LIF | Millipore | ESG1107 | 60 μL |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC differentiation medium Formulation and notes: 436.6 mL |
| 100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL |
| ESC-qualified serum | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 50 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 0.9 mL |
| Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Media: NPC trypsinization medium Formulation and notes: 100 mL |
| 0.5 M EDTA (18.3%) | Sigma-Aldrich | 3690 | Media: freeze in 5 mL aliquote Formulation and notes: 0.266 mL |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | 50 mg |
| Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Media: Surface coating solutions Formulation and notes: 2.5 µg/mL in H20 |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigma-Aldrich | P7280 | Media: use within 1 wk Formulation and notes: 100 µg/mL in H20 |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 5 µg/mL in H20 |
| DMEM/F12 + GlutaMAX | Life Technologies | 10565-018 | Media: NPC culture medium Formulation and notes: 492.5 mL |
| 100x N2 vitamins | Life Technologies | 17502-048 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888-022 | Media: ESN culture medium Formulation and notes: 482.5 mL |
| 50x B27 vitamins | Life Technologies | 17504-044 | Media: store at 4 °C for up 1 month Formulation and notes: 10 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| 5-fluoro-2'-deoxyuridine (5FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | Media: 2000x Mitotic inhibitors aliquot and store at -20 °C Formulation and notes: dd 150 mg 5FDU and 350 mg uridine to 10 mL Neurobasal A. Sterile filter, aliquot and freeze. Use 2000x in ESN culture medium. |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| TrypLE Express Trypsin | Life Technologies | 12605-010 | Media: Miscellaneous Formulation and notes: store at RT |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | store at RT |
| soybean trypsin inhibitor (STI) | Sigma-Aldrich | T6414 | store at -20 °C |
| ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | store at RT |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Prepare 100 mM stock by dissolving 100 mg ascorbic acid in 5.7 mL of 50:50 DMSO/ethanol mix. |
| retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | Resuspend 15 mg RA in 9 mL 50:50 DMSO/ethanol. Supplement with 1 mL of 100 mM ascorbic acid stock. Aliquot and stored at -80 °C. Stable for 6 mos. |
| Table 2. MIST | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: Extracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 58.44 MW: 140 |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60135 | Media: (ERB; pH = 7.3, 315 mO) Final Concentration (mM): 74.56 MW: 3.5 |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 119.98 MW: 1.25 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Final Concentration (mM): 110.98 MW: 2 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | Final Concentration (mM): 180.16 MW: 10 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
| K-gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Media: Intracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 234.5 MW: 140 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: (IRB; pH = 7.3, 320 mO) Final Concentration (mM): 58.44 MW: 5 |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 507.18 MW: 2 |
| Li-GTP | Sigma-Aldrich | G5884 | Final Concentration (mM): 523.18 MW: 0.5 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 110.98 MW: 0.1 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | 380.35 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
| bicuculline | Tocris | 131 | Media: Miscellaneous Final Concentration (mM): 0.01 MW: 417.85 |
| CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Final Concentration (mM): 0.01 MW: 276.12 |
| Tetrodotoxin | Sigma-Aldrich | A8001 | Final Concentration (mM): 0.005 MW: 645.74 |
| BoNT/A-/G | Metabiologics | N/A | Media: Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
| Tetanus toxin | Sigma-Aldrich | T3194 | Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL-2 | Final Concentration (mM): N/A MW: N/A |
| Table 3. Equipment and Software | |||
| MiniAnalysis (version 6.0.7) | Synaptosoft, Inc. | N/A | Event detection software |
| Igor Pro (version 6.22A) | WaveMetrics | N/A | Software for visualization of recordings |
| Patchmaster | Heka | N/A | Data acquisition software |
| Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | N/A | |
| micromanipulator | Sutter Instrument | MPC-365 | |
| patch-clamp amplifier | Heka | ECB10USB | |
| micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| borosilicate capillary tubes | Sutter Instrument | B150-86-10 | Corning 7740 |
| 18 mm glass coverslips | Fisher | 12-545-84 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| cell strainer (40 µm) | Fisher | 08-771-1 | |
| Stovall Belly Dancer Shaker | Fisher | 15-453-211 | |
| low adhesion dishes | Fisher | 05-539-101 | Corning 3262 |
| bacterial dishes | VWR | 25384-302 | 100 x 15 mm |
References
- Simpson, L. L. Identification of the major steps in botulinum toxin action. Annual Review Of Pharmacology And Toxicology. 44, 167-193 (2004).
- Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene. The Journal Of Infectious Diseases. , (2013).
- Singh, B. R. Botulinum neurotoxin structure, engineering, and novel cellular trafficking and targeting. Neurotoxicity Research. 9, 73-92 (2006).
- Larsen, J. C. U. S. Army botulinum neurotoxin (BoNT) medical therapeutics research program: past accomplishments and future directions. Drug Development Research. 70, 266-278 (2009).
- McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research. Biochem Bioph Res Co. 405, 85-90 (2011).
- Eubanks, L. M., et al. An in vitro and in vivo disconnect uncovered through high-throughput identification of botulinum neurotoxin A antagonists. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2602-2607 (2007).
- Pellett, S., et al. Sensitive and quantitative detection of botulinum neurotoxin in neurons derived from mouse embryonic stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 404, 388-392 (2011).
- Mesngon, M., McNutt, P. Alpha-Latrotoxin Rescues SNAP-25 from BoNT/A-Mediated Proteolysis in Embryonic Stem Cell-Derived Neurons. Toxins. 3, 489-503 (2011).
- Kiris, E., et al. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).
- Whitemarsh, R. C., et al. Novel application of human neurons derived from induced pluripotent stem cells for highly sensitive botulinum neurotoxin detection. Toxicological Sciences. 126, 426-435 (2012).
- Hubbard, K. S., et al. High yield derivation of enriched glutamatergic neurons from suspension-cultured mouse ESCs for neurotoxicology research. BMC Neurosci. 13, 127 (2012).
- Brook, F. A., Gardner, R. L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 5709-5712 (1997).
- Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 8424-8428 (1993).
- Hubbard, K., Gut, I. M., Lyman, M. E., McNutt, P. M. Longitudinal RNA sequencing of the deep transcriptome during neurogenesis of cortical glutamatergic neurons from murine ESCs. F1000Research. 2 (35), (2013).
- Gut, I. M., et al. Novel application of stem cell-derived neurons to evaluate the time- and dose-dependent progression of excitotoxic injury. PLoS One. 8, e64423 (2013).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 8, 1454-1468 (1988).
- Capek, P., Dickerson, T. J. Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection. Toxins. 2, 24-53 (2010).
- Raciborska, D. A., Trimble, W. S., Charlton, M. P. Presynaptic protein interactions in vivo: evidence from botulinum A, C, D and E action at frog neuromuscular junction. The European Journal Of Neuroscience. 10, 2617-2628 (1998).
- Baskaran, P., Thyagarajan, B. Acute and chronic effects of botulinum neurotoxin a on the mammalian neuromuscular junction. Muscle & Nerve. 50, 206-215 (2014).
