Introduction
In de laatste twee decennia is de mogelijkheid om overexpressie en te zuiveren membraan transporteiwitten is dramatisch toegenomen: ionkanalen, primaire en secundaire transporteurs worden nu routinematig gezuiverd van heterologe expressie systemen, alsmede natuurlijke bronnen. Nieuwe benaderingen te controleren meningsuiting, te verbeteren en de winning faciliteren en versterken de stabiliteit van deze eiwitten worden constant ontwikkeld 1-5. Deze technologische doorbraken zijn geweest bij het activeren van de explosie van atoom-niveau structurele informatie over membraaneiwitten die op zijn beurt verbeterde ons begrip van de structurele basis van hun functie is. Daarentegen ons vermogen sonderen de functionele eigenschappen van de gezuiverde eiwitten geen verhoging in hetzelfde tempo, zodat in sommige gevallen hoge resolutie structuurinformatie gepaard met kwalitatieve functionele gegevens, waardoor ons vermogen om kwantitatief te testen structuur gebaseerde voorspellingen beperkt. Vandaar dat de development van kwantitatieve en generaliseerbaar functionele assays is een belangrijke stap naar de ontrafeling van de mechanistische onderbouwing van membraaneiwit functie.
Hier beschrijven we een efflux assay die kan worden gebruikt om kwantitatief belangrijkste functionele eigenschappen van gezuiverd en gereconstitueerd Cl - kanalen en transporters. De beginselen van de test kan worden gegeneraliseerd naar diverse transportsystemen, alsmede niet-ion transport eiwitten. Liposomen worden gereconstitueerd met gezuiverde Cl - kanaal / transporters in de aanwezigheid van een grote Cl - helling (figuur 1A, B). Cl - efflux wordt geïnitieerd door de toevoeging van een ionofoor om voor tegenion flux, in ons geval de K + ionofoor valinomycine, dat voldoet aan de Cl spanning shunt - gradiënt en het beginvolume membraanpotentiaal de evenwichtspotentiaal van K + 6,7. Zonder thij ionofoor geen significant netto Cl - efflux optreedt, zoals wordt voorkomen door het genereren van een transmembraanpotentiaal. De data wordt kwantitatief beschreven door twee meetbare parameters (figuur 1C): τ de tijdconstante van Cl - efflux en f0, de fractie van liposomen actief eiwit bevatten. Van τ en f 0 de unitaire Cl - transportsnelheid, kan de fractie van actief eiwit en de molecuulmassa van het actieve complex afgeleid 8. De techniek wordt hier geïllustreerd aan de hand proteoliposomen gereconstitueerd met CLC-EC1, een goed gekarakteriseerde CLC-type H + / Cl - wisselaar van bekende structuur en functie. Deze test wordt gemakkelijk gegeneraliseerd om kanalen of transporters met verschillende ionische selectiviteit of waarvan de activiteit afhankelijk van de aanwezigheid van spanning en / of liganden. Bovendien kan deze bepaling worden vastgesteld of kleine moleculen rechtstreeks de gereconstitueerde eiwit,om de effecten van deze verbindingen en hoe membraansamenstelling of lipidemodificerend reagentia invloed op de functie van de gereconstitueerde kanalen en transporters kwantificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. lipidepreparaat
- Aliquot de gewenste hoeveelheid lipiden in een heldere glazen buis. Gebruik E. coli polair lipide-extract, maar de meeste lipidesamenstellingen worden gebruikt. Indien lipiden in poedervorm, resuspendeer ze in chloroform tot een concentratie van 20 mg / ml. Droog de lipiden bij KT onder N2-gas totdat al het oplosmiddel verdampt.
- Resuspendeer de lipiden in pentaan en drogen weer een gestage stroom van gas N2 overgebleven sporen van chloroform te verwijderen. Droog totdat al het oplosmiddel verdampt. Tijdens het drogen voorzichtig zwenken de buis zodanig dat het lipide is verdeeld in een gelijkmatige film die het onderste derde van de buis in plaats van de vorming van een dichte massa onderin.
- Voeg de reconstitutie buffer die detergens (300 mM KCI, 50 mM citroenzuur, 25 mM K 2 HPO 4, pH 4,5, 35 mM CHAPS) de lipiden ontbinden. Gebruik andere milde wasmiddelen voor deze stap over als het eiwit is slecht tolerant CHAPS.
- Resuspend de lipiden aan duidelijkheid met behulp van een waterbad sonicator. Dompel de buis in het midden van het water sonificator bad op maximaal vermogen in het kort (30 sec-1 min) pulsen met kort (30 sec-1 min) pauzeert. De oplossing moet helder worden.
Opmerking: De uiteindelijke mate duidelijk mogelijk afhankelijk van de specifieke lipide samenstelling gebruikt. Sommige batch-to-batch variatie in deze stap, zelfs onder nominaal identieke lipiden, is eveneens mogelijk. Residuele waas door lichtverstrooiing door grote deeltjes in de suspensie, die kan worden verwijderd door centrifugatie. - Incubeer de geresuspendeerde lipiden bij kamertemperatuur gedurende 20-60 min.
2. proteoliposome Vorming
OPMERKING: Verschillende strategieën kunnen worden toegepast om het detergens gesolubiliseerde proteïne te voegen in liposomen. Voor CLC-EC1 dialyse werkt goed en is daarom de methode van keuze 6,9,10.
- Voeg de gezuiverde eiwit aan het gewenste eiwit tot lipide (P / L) verhouding (uitgedrukt in pg o F-eiwit / mg Lipid). De keuze van de P / L-verhouding afhankelijk van het doel van het experiment.
- Als het doel is om de activiteit van het eiwit van belang kan reconstitueren hoge P / L's om het signaal te maximaliseren, omdat elk liposoom bevat meerdere kopieën van het eiwit. Om de activiteit en / of unitaire transportsnelheid van het eiwit te kwantificeren, gereconstitueerde een Poisson verdunning regime lage P / L's, zodat elk vesikel gemiddeld 1 proteïne. Zie stap 7 en discussie voor een meer diepgaande analyse van toen aan elke regeling te gebruiken.
- Om de optimale P / L-waarden voor de verschillende regimes te bepalen voor een volledige titratie van de activiteit als functie van eiwitconcentratie 8,11-13. Voor elk eiwit waarvoor het molecuulgewicht (MW, uitgedrukt in kDa) van de actieve eenheid is bekend de volgende P / L-waarden worden gebruikt als initiële guesstimates:
pg "/>
- Laad het proteïne en lipide mengsel in een vooraf bevochtigde dialyse buis of een cassette. Plaats de dialyse inrichting in een bekerglas met 500-1,000x het volume van de lipide reconstitutie buffer (dat wil zeggen 1 liter buffer gedurende 1 ml lipide resuspensie) onder voorzichtig roeren.
- Wijzig buffer 3-4 keer om> 3 uur. Bij elke oplossing verandering, was de cassette / buizen en de beker met gedestilleerd water en vul de beker met verse reconstitutie buffer. Omvatten 1-2 O / N-intervallen voor de oplossing verandering. Het exacte aantal en de duur van de oplossing verandert afhankelijk van de precieze lipide en detergenten gebruikt.
- Na de laatste stap is voltooid, verwijdert de liposomen van de dialyse vat, aliquot ze in buizen en flash invriezen in vloeibare N2 of bevriezen bij -80 ° C.
3. Opname Set-up
<p class = "jove_content"> NB: De opname opstelling (figuur 2A) bestaat uit twee kamers (platte bodem cilinders, ~ 3-4 ml volume), een Cl - (zie hieronder) elektrode, een pH-meter met een analoge of digitale elektrisch vermogen, een digitizer, en een computer met een passende acquisitie software.- Sluit de Cl - elektrode om de pH meter, de uitgang van de pH-meter om de digitizer die is aangesloten op de computer. Plaats de referentie-elektrode in één kamer en de hercodering draad in de andere (figuur 2B).
OPMERKING: De polariteit van de draden is correct als AV Cal (zie Stap 6.4 en 7.2) is positief. - Plaats de kamers op een roer plaat met een roerstaafje in de opname kamer (Figuur 1B). Zorg ervoor dat het roerstaafje niet de elektrode aanraken.
- Sluit de camera's met behulp van een agar brug (Figuur 2B) (100 mM KCl en 2% agarose). Bewaar de Agar bruggen in 100 mM KCl.
4. Voorbereiding van de Cl - elektrode
- Neem een oude en -possibly- niet-functionerende pH-elektrode. Breek het glas coating volledig onthullen de zilveren draden.
- Verwijder de bekleding voorzichtig uit de zilveren draden met behulp van een scalpel. Maak de draden met overvloedige hoeveelheden H 2 O en EtOH.
- Plaats in een verzadigde oplossing van FeCl3 (of bleekmiddel) tot draden bedekt met een uniforme donkere laag AgCl.
5. Bereiding van Unilamellaire Vesicles
- De nacht vóór de experimenten, zwellen 1 g Sephadex G-50 kralen in 15 ml externe buffer (1 mM KCl, 150 mM K 2 SO 4, 25 mM citroenzuur, pH 4,5) onder zacht schudden (niet roeren) voor ten minste 3 uur bij kamertemperatuur vóór gebruik. Elk experiment vereist ~ 3 ml van gezwollen korrels. Houd de gezwollen korrels bij 4 ° C gedurende enkele dagen hooguit.
- Terwijl de liposomen ontdooien bij kamertemperatuur, giet in elke kolom ~ 3 ml gezwollen G-50 kralen. Laat ze drogen door de zwaartekracht stroom bij RT; Dit duurt meestal 1-2 min.
- Bereid unilamellaire blaasjes door het extruderen van de proteoliposomen 11 keer door een mini-extruder met een 0,4 m Teflon cutoff.
- Plaats de kolom in een plastic ronde bodem buis. Spin de kolommen om overtollige oplossing te verwijderen. Centrifugeer gedurende 20-30 seconden bij 1400 xg in een klinische centrifuge.
- Gooi doorstroom plaats kolom in een 13 x 100 mm glazen buis en voeg 100 ul van de geëxtrudeerde blaasjes aan de kolom. Spin kolom gedurende 1 min bij 500 xg in een klinische centrifuge.
- Verzamel ~ 200 ul doorstroom die worden toegevoegd aan de opname kamer in stap 6.5.
6. Efflux Meting
- Plaats 2 ml van 100 mM KCl in de referentie (grond) kamer en 1,8 ml van de externe buffer (1 mM KCl, 150 mM K 2 SO 4, 25 mM citroenzuur, pH 4,5) om de opname kamer. De lichte osmotische onbalans tussen de interneen externe oplossingen geen invloed
- Start de acquisitie programma. Laat de basislijn in evenwicht, dit kan een paar minuten duren.
- Zodra het signaal een stabiele basislijn (de liposomen zijn klaar en de kolommen drogen) bereikt, start de opname (figuur 3A).
- Voeg 15 ul van 10 mM KCl oplossing voor het systeem (figuur 2A) te kalibreren.
- Liposomen voegen. Een kleine sprong kan zichtbaar door de onvolledige verwijdering van externe Cl - van proteoliposomen (figuur 3A). Wacht maar tot de basislijn stabiliseert.
- Voeg Valinomycin (1 ui 1 mg / ml in EtOH) om efflux (figuur 3A) te leiden.
- Laat de uitstroom lopen het tijdsverloop tot het plateaus (Figuur 3A).
- Voeg 40 ul van 1,5 M β-octylglucoside (β-OG) bereid in de externe buffer om alle liposomen (Figuur 3A) oplossen. Stop de opname.
7. Data ANALYSE
- Het trace bestand exporteren uit in een ASCII of tekstformaat en importeren om de analyse programma naar keuze.
- Meet de spanning op de volgende plaatsen (Figuur 3A):
Aan het begin van de opname (0 V);
Na toevoeging van het kalibreren puls (V cal);
Na toevoeging van de liposomen (V lipo);
Aan het einde van de efflux (V fin);
Na toevoeging van detergens (V tot);
Baseline de spanningen zodat V 0 = 0. - Gebruik de Nernst-Plank vergelijking om de experimentele waarde van te bepalen
door meting 
Wanneer Vol Cal is het volume van de kalibratiepuls in pl, 1800 wordt de volumekamer aan het begin van het experiment uitgedrukt1; l, [Cl] cal / in de Cl - concentraties van de kalibratiepuls en van de externe buffer in mm en AV cal is de sprong in mV gemeten na de kalibratiepuls.
LET OP: Deze empirische bepaling van α dient drie doelen: het zorgt ervoor dat het systeem goed reageert, biedt een maat voor de consistentie van de reactie van het instrument tussen de experimenten, alsmede om te controleren dat er geen fouten zijn gemaakt in de oplossing maken. - Bereken de Cl concentraties na elke stap als volgt:
De factor 3/400 komt van de verdunning van de 15 pl kalibratiepuls in de 2000 pl eindvolume. - Calculaten de veranderingen in [Cl] bij elke stap, ΔCl lipo / fin / tot.
- Zet V (t) in Cl (t) met
Direct bepalen [Cl] waarden kritische punten en te vergelijken met de berekende waarden als een interne controle. - Normaliseren van de sporen, zodat de Cl rel lipo = 0 en Cl rel tot = 1
- Breng de efflux tijdsverloop aan de volgende vergelijking:
Waarbij L de snelheid van Cl - lek experimenteel wordt bepaald door Cl - efflux van eiwitvrije liposomen bereid onder dezelfde omstandigheden en τ de tijdconstante van het proces. - Bereken v, de beginsnelheid:
Wanneer ΔCl vin wordt uitgedrukt in mM en V het volume van de kamer in ul. - Bereken het transport tarief / geleiding
Waarbij p de P / L, MW is het molecuulgewicht van het actieve complex uitgedrukt in kDa
door meting 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We beschrijven een gedetailleerd en robuust protocol om Cl te meten - transport gemedieerd door gezuiverd CLC-EC1, een prokaryotische CLC-type H + / Cl - wisselaar, gereconstitueerd in liposomen. Een schematische voorstelling van het experiment wordt getoond in figuur 3 proteoliposomen gereconstitueerd met gezuiverd CLC-EC1 en met hoge interne Cl -. Ondergedompeld in een bad oplossing die lage Cl -. Onder deze omstandigheden net Cl - efflux wordt voorkomen door de opbouw van positieve lading in het liposoom (figuur 3A). Toevoeging van Valinomycin laat K + om over het membraan waardoor de elektrische potentiaal rangeren en het initiëren van Cl bewegen - efflux (Figuur 3B). De flux tijdsverloop wordt bewaakt door middel van een Cl - selectieve elektrode en het totale bedrag van de Cl - in de blaasjes wordt rechtstreeks gemeten door het oplosbaar maken ze met behulp van detergent. Uit dezebulk experimenten is het mogelijk om eigenschappen van de enkelvoudige opgeloste eiwitten, zoals omloopsnelheid stoichiometrie van het actieve complex en fractie van actief eiwit te bepalen. Met behulp van vergelijkingen 7-9 om de uitstroom tijdsverloop passen en schat de unitaire vervoer tarief van CLC-EC1 vinden we dat τ (0,2 ug / mg) = 41 sec en f 0 (0,2 ug / mg) = 0,31, wat aangeeft dat ~ 1 / 3 van de liposomen bevat 0 actieve eiwitten. Uit deze waarden berekenen we dat de unitaire vervoer tarief is γ ~ 2500 Cl - sec -1, in goede overeenstemming met gepubliceerde waarden 8,14.
Figuur 1: De Cl - efflux assay (A - B) Schematische weergave van de Cl - -efflux assay voor eiwit bevattende liposomen (A) of CLC-EC1.gereconstitueerde blaasjes (B). (C) Gesimuleerde tijdsverloop van-ionofoor geïnitieerd Cl - efflux uit proteoliposomen (zwart) of proteïnevrij liposomen (grijze stippellijn). Efflux wordt geïnitieerd door toevoeging van ionofoor (*) en beëindigd door de toevoeging van detergens liposomen te (^). Rode stippellijn is een exponentiële fit om te bepalen de tijdconstante, τ, van Cl -. Efflux van liposomen die ten minste 1 actief kopie van CLC-EC1 en f 0 is de fractie van liposomen met 0 actieve eiwitten Klik hier om een foto grotere versie van deze figuur.
Figuur 2: Opname opgezet (A) De opname opgezet.. (B) Close-up van de kamers. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52369/52369fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Voorbeeld trace en analyse (A) Typische V (t) sporen van efflux experimenten uit proteoliposomen gereconstitueerd met WT CLC-EC1 bij 0,2 ug / mg P / l.. Pijlen geven de tijd van toevoeging van het KCl kalibratiepuls, liposomen, valinomycine en β-OG. Onderbroken lijnen geven de AV waarden in verschillende stadia. (B) De V (t) spoor wordt omgezet Cl (t) met vergelijking 5, genormaliseerd met vergelijking 6 en efflux tijdsverloop geschikt voor Vergelijking 7 (rood gestreepte lijn). (C) De genormaliseerde uitlooptijd vakken van proteoliposomen gereconstitueerd met WT CLC-EC1 bij 0,2 ug / mg P / L (zwart) of 5 pg / mg P / L (grijs). Stippellijns zijn het beste past van de efflux tijdsverloop van Vergelijking 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transport gemedieerd door gezuiverd anion-selectieve kanalen of transporteurs gereconstitueerd in liposomen - We hebben een gedetailleerd protocol om Cl te meten beschreven. Het voorbeeld gebruikt was de prokaryotische H + / Cl - wisselaar CLC-EC1. Echter, kan de methode gemakkelijk worden aangepast om kanalen afgesloten door liganden 12,13,15, 11,12 spanning of sportieve andere anionogene selectiviteit 15,16 door vervanging van de Ag bestuderen: AgCl elektrode met een geschikt voor de ionen in kwestie. Elektroden selectief anders dan Cl- ionen - zoals H +, I - en F -, zijn commercieel verkrijgbaar.
Een bespreking van enkele cruciale stappen en veronderstellingen volgen.
Grenzen van de Poisson verdunning veronderstelling
De afleiding van de unitaire tarief (Vergelijking 7-9) is alleen geldig in een Poisson verdunning regime, toen de meeste liposomen contain slechts één werkzame proteïne zodat de waarschijnlijkheid van meerdere kopieën van een bepaald vesicle is laag en de macroscopische efflux tijdconstante van het blaasje bevolking goed benaderd door die van liposomen die een enkel eiwit. Uit een vergelijking van de Cl - efflux tijdverloop bemiddeld door liposomen gereconstitueerd met CLC-EC1 bij lage (zwart, 0,2 ug / mg) en hoge P / L (grijs, 5 ug / mg) (Figuur 3C) laat zien dat in de laatste geval de efflux kinetiek worden sneller en f0 afneemt, wat aangeeft dat een kleiner deel van de totale liposomen bevat 0 eiwitten. De totale hoeveelheid Cl - in beide vesicle monsters vergelijkbaar was -0,7 en -0,55 umol wat aangeeft dat de totale interne volume van de vesicles in de twee monsters vergelijkbaar en dat de hoeveelheid eiwit gereconstitueerd laat de omvang van de vesicles. Montage van de hoge P / L efflux tijdsverloop van Vergelijking 7 produceert waarden van τ , (5 pg / mg) = 8,8 sec en f 0 (5 pg / mg) = 0,06, wat aangeeft dat slechts ~ 6% van de vesicles bevatten geen actieve CLC-EC1 dimeren in tegenstelling tot ~ 31% hebben bij P / L = 0,2 ug / mg. Zo is de schatting van de unitaire omloopsnelheid bij hoge P / L is γ ~ 450 Cl - sec -1, bijna 6 keer lager dan de verkregen bij lage P / l en van de gepubliceerde gegevens 8,14. Daarom analyse van uitstroomtijd cursussen van liposomen opgelost bij hoge P / L's zal de unitaire transport snelheid van het opgeloste eiwit onderschatten. Dus om nauwkeurig de unitaire transportsnelheid van een nieuw eiwit is het van belang om nauwkeurig de hoeveelheid eiwit gereconstitueerd te bepalen en te werken bij lage P / L's in een Poisson verdunning regime. Dit is ideaal bereikt door het bepalen van een volledig eiwit titratie analyse om de optimale regime werken identificeren.
Bepaling van de massa van het actieve complex
tent "> De hierboven beschreven analyse veronderstelt dat de stoichiometrie van het actieve complex is bekend en de gereconstitueerde eiwit volledig actief. Voor nieuwe preparaten deze hoeveelheden niet a priori bekend zou worden. In dit geval is het mogelijk om direct te bepalen deze parameters door het meten van de f 0 is op verschillende eiwit lipideverhoudingen
waarbij p de dichtheid eiwit, 
, Ρ is het aantal liposomen per massa lipide, N A getal van Avogadro, M P is de massa van de functionele kanaal complex en φ is de fractie van actieve eiwitten. Door toepassing van de experimenteel bepaalde f 0 is bij verschillende proteïne lipideverhoudingen is poswoordelijk voor p 0 te bepalen, en dus M P en φ.
Een eindige fractie van liposomen ongevoelig incorporatie
De afleiding van de unitaire transportsnelheid ervan uit dat bij hoge P / L allemaal liposomen ten minste één actief transport eiwit. In sommige gevallen werd gevonden niet het geval te zijn: bij hoge P / L is een significante fractie van liposomen blijft ongevoelig reconstitutie van sommige eiwitten 11-13,17. Hoewel de oorzaak van dit verschijnsel niet duidelijk is denkbaar dat grotere eiwitten van blaasjes met kleinere stralen waardoor het aantal beschikbare liposomen vermindering kan worden uitgesloten.
In dit geval moet Vergelijking 10 worden gewijzigd om: 
waarbij θ is de fractie van liposomen ongevoelig Protein oprichting. Belangrijker nog, ρ en φ worden ook beïnvloed door de reconstructie methode, omdat verschillende procedures verschillende terugvorderingen voor lipiden en eiwitten zal hebben tijdens liposoom reconstitutie en vorming. Uitgaande van 100% opbrengst beide leidt tot een verkeerde schatting van γ. Daarom, om een nauwkeurige kwantificering van de unitaire omzet / geleiding te verkrijgen is het belangrijk experimenteel bepalen van de fractie van lipiden en eiwitten verloren tijdens reconstitutie 8,11.
Oriëntatie van de opgeloste eiwitten
Een van de veronderstellingen die aan de analyse is dat alle opgeloste eiwitten zijn functioneel gelijkwaardig. Echter, vele kanalen en vervoerders hebben de voorkeur richtingen van transporten, een fenomeen dat bekend staat als rectificatie. Deze functionele asymmetrie zou kunnen leiden tot een schatting fout in de omloopsnelheid. Bovendien is de oriëntatie van het gereconstitueerde eiwit is a priori + gradiënten, voor kanalen of transporteurs die ligand of spanningsafhankelijke zijn.
Overwegingen op de vorming van strakke liposomen
Eén van de belangrijkste factoren die het gebruik of efflux assay beschreven is de vorming van strak liposomen. Drie belangrijke variabelen te beschouwen hiertoe zijn de keuze wasmiddel voor het eiwit, het detergens-strategie voor de verwijdering en de keuze van de lipide samenstelling van de liposomen oplosbaar. In het protocol hier wordt gepresenteerd, is CLC-EC1 opgelost in Decyl-Maltopyranoside (DM), een wasmiddel met een hoge kritische micel concentratie (CMC) waarde, die dus gemakkelijk wordt verwijderd. Echter verschillende synthetische en natuurlijk voorkomende detergentia gebruikt om eiwitten die vervolgens werden gereconstitueerd in kleine liposomen zonder effect op de dichtheid van de vesicles te zuiveren. Deze wasmiddelen hebben een breed scala van CMC, zo hoog als mM (zoals DM of Digitonine) en zo laag als micromolaire (zoals dodecyl- Maltopyranoside (DDM) of dioctylpropane-bis-maltopyranoside (DMNG)). Het is echter belangrijk op te merken, dat de lipiden gebruikt voor het vormen van de liposomen werd opgelost met CHAPS of ander mild reinigingsmiddelEn daarom hybride micellen verkregen uit het mengsel van eiwitten en lipiden kunnen chemisch-fysische eigenschappen verschillen van die van de ouder wasmiddelen. Het is dus mogelijk dat in sommige gevallen de zeepresten verwijderen dat de liposomen leidt tot meer uitgesproken lekken zouden destabiliseren. Om dit probleem te omzeilen is het raadzaam alternatieve detergent verwijderingsstrategiëen, zoals biobeads 12,13, spinkoloms 15 of gelfiltratie 18 onderzoeken. Tenslotte, de lipide samenstelling van de vesicles is een belangrijke parameter specifieke mengsels lekkende verschillende ionen in bepaalde omstandigheden kunnen zijn. Bijvoorbeeld liposomen gevormd uit E. coli polaire lipide-extract strak CL - bij zure pH, maar wordt geleidelijk lek als de pH verhoogt 19 of liposomen gevormd uit een 3: 1 mengsel van 1-palmitoyl-2-oleoyl fosfatidyl-ethanolamine (POPE) en 1-palmitoyl- 2-oleoyl fosfatidylglycerol (POPG) Vertonen een veel lagere doorlaatbaarheid voor H + dan gevormd uit E. coli polaire lipiden te halen 20. Het is belangrijk op te merken echter op dat de lipide samenstelling van de vesicles eveneens kan hebben op de activiteit van het gereconstitueerde eiwit 13,21,22. Aldus is het belangrijk de eigenschappen van de eiwitvrije vesicles bereid in elke staat precies te bepalen en te beoordelen hoe dit beïnvloedt de eigenschappen van het gereconstitueerde eiwit.
Generalisatie naar niet CLC-type kanalen en transporteurs
De efflux assay, zoals hier beschreven, kan direct worden gebruikt om de individuele moleculen eigenschappen van elke Cl bepalen - selectieve kanaal of transporter, en bijvoorbeeld is gebruikt om karakteriseren de eigenschappen van de Ca2 + -geactiveerde Cl - kanaal TMEM16A 12 . We bespreken nu hoe de efflux assay aan te passen aan de eigenschappen van de vervoerders of chann onderzoekenels die niet Cl - selectief en / of hebben unitaire vervoer tarieven die aanzienlijk verschillen van de ~ 10 3 ion sec -1 van CLC-EC1.
Het eenvoudigste geval is dat het eiwit onder studie anion selectief. In dit geval is het alleen nodig aangepast om het Ag vervangen: AgCl elektrode met een in de handel verkrijgbaar van een geschikte selectiviteit, zoals werd gedaan voor de F - selectieve Flucs en CLCs 16,23,24 of I - permeabele kanalen zoals CFTR 15 . Indien daarentegen het gereconstitueerde eiwit selectief kationen, een uitzondering valinomycine ionofoor moet worden gebruikt om efflux initiëren. Gezien de schaarste van gevalideerde Cl - ionoforen een bruikbaar alternatief is een H + ionofoor, zoals Carbonyl cyanide 4- (trifluormethoxy) fenylhydrazon (FCCP). In dit geval is het belangrijk dat de intravesicular pH constant wordt gehouden, bijvoorbeeld door de buffering capaciteit van de interne oplossing. Een andere mogelijkheid is kation efflux volgen via een gereconstitueerd kanaal of transporter met protonen als tegenion en controle H + vervoer met een pH-meter 25 of ratiometrische pH-gevoelige probe 26. De indirecte aard van deze metingen maakt kwantificering van de transporteigenschappen van het gereconstitueerde eiwit moeilijk. Tenslotte elektroden selectief een aantal kationen bestaan en in de handel verkrijgbaar. Een derde scenario is dat het eiwit onder studie doorlaatbaar is zowel anionen en kationen, bijvoorbeeld een slecht selectief kanaal 13 of een kation / Cl - cotransporter. In dit geval hoeft de gereconstitueerde liposomen niet handhaven van een KCl gradiënt tijdens de oplossing uitwisseling proces (stappen 5,4-5,5), zodat ze hun zoutgehalte verliezen. Daarom wordt in dit geval alle kinetische informatie verloren. De fractie van liposomen die ten minste één werkzame protein, f 0, kan nog steeds worden bepaald door het toevoegen van wasmiddel en het meten van de resterende gevangen Cl - gehalte (stap 6.8). Dit maakt de bepaling van de molecuulmassa van het eiwit door het uitvoeren van een eiwit titratie en volgens vergelijking 10.
Een ander aspect dat aandacht verdient is de mogelijkheid dat unitaire transport snelheid van het opgeloste eiwit is ordes van grootte verschilt van dat van CLC-EC1. Bijvoorbeeld, de meeste transporteurs hebben personeelsverloop van 1-10 sec -1, 2-3 ordes van grootte lager dan CLC-EC1, terwijl de meeste kanalen gedrag ionen bij 10 6 -10 7 sec -1, 3-4,000 vouw sneller dan CLC -ec1. Voor langzaam transporteurs de snelheid van de Cl - lekkage van eiwit-vrije liposomen kunnen beperken, zoals het relatieve gewicht in het uitstroom proces neemt toe naarmate het vervoer afneemt van het eiwit te worden. In onze ervaring varieert de mate van lekkage enigszins tussen preparaten en is meestal in de orde van eenpaar ion sec -1. Daarom, bij het werken met langzame transporteurs is het raadzaam om eiwitvrij liposomen naast bereiden elke reconstitutie de lek overeenkomt met elke partij vesicles nauwkeurig te meten. De uitstroom test is met succes gebruikt om de unitaire tarief van trage transporteurs met een omzet tarieven rond 1-10 ion sec -1, zoals een cyanobacteriën CLC 27 te bepalen. De omgekeerde situatie treedt op wanneer het opgeloste eiwit heeft een hoge geleidbaarheid, bijvoorbeeld een ionkanaal. In dit geval de efflux kinetiek te snel worden opgelost als de mengtijd (~ 1-2 sec) en de intrinsieke responstijd van de registratie-elektrode worden snelheidsbeperkend. In dit geval wordt de kinetische gegevens verloren, maar de massa van het actieve complex kan nog worden bepaald 24. Het is vermeldenswaard dat andere benaderingen, zoals vlakke lipide dubbellaag opnamen of patchklemmen liposomen meer geschikt om gezuiverd ionkanalen als deze te bestuderenchniques direct bieden enkel molecuul van informatie met hoge tijdsresolutie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | 610200 | |
| IEC Centra CL2 Benchtop | Thermo Scientific | ||
| Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter | These can be found on Ebay. | ||
| Non-functional pH probe | Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned. | ||
| DI-710 Data Logger | DATAQ instruments | ||
| WinDAQ acquisition software | DATAQ instruments | ||
| Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml | Pierce (Thermo Scientific) | 29922 | |
| KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass | Kimble Chase | 73500-13100 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids Inc. | 610000 | |
| Computer |
References
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14, 673-681 (2006).
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat Protocols. 3, 784-798 (2008).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
- Almo, S. C., Love, J. D. Better and faster: improvements and optimization for mammalian recombinant protein production. Curr Opin Struct Biol. 26, 39-43 (2014).
- Xiao, S., Shiloach, J., Betenbaugh, M. J. Engineering cells to improve protein expression. Curr Opin Struct Biol. 26, 32-38 (2014).
- Accardi, A., Miller, C. Secondary active transport mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. Nature. 427, 803-807 (2004).
- Nguitragool, W., Miller, C. Uncoupling of a CLC Cl-/H+ exchange transporter by polyatomic anions. J. Mol. Biol. 362, 682-690 (2006).
- Walden, M., et al. Uncoupling and turnover in a Cl-/H+ exchange transporter. J. Gen. Physiol. 129, 317-329 (2007).
- Accardi, A., Kolmakova-Partensky, L., Williams, C., Miller, C. Ionic currents mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. J. Gen. Physiol. 123, 109-119 (2004).
- Basilio, D., Noack, K., Picollo, A., Accardi, A. Conformational changes required for H(+)/Cl(-) exchange mediated by a CLC transporter. Nat Struct Mol Biol. 21, 456-463 (2014).
- Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. Journal of Molecular Biology. 387, 1055-1060 (2009).
- Terashima, H., Picollo, A., Accardi, A. Purified TMEM16A is sufficient to form Ca2+ activated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 19354-19359 (2013).
- Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nature Communications. 4, 2367 (2013).
- Picollo, A., Malvezzi, M., Houtman, J. C., Accardi, A. Basis of substrate binding and conservation of selectivity in the CLC family of channels and transporters. Nat Struct Mol Biol. 16, 1294-1301 (2009).
- Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287, 36639-36649 (2012).
- Stockbridge, R. B., et al. Fluoride resistance and transport by riboswitch-controlled CLC antiporters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15289-15294 (2012).
- Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr Biol. 21, 149-153 (2011).
- Nimigean, C. M., Miller, C. Na+ block and permeation in a K+ channel of known structure. J Gen Physiol. 120, 323-335 (2002).
- Picollo, A., Xu, Y., Johner, N., Bernèche, S., Accardi, A. Synergistic substrate binding determines the stoichiometry of transport of a prokaryotic H(+)/Cl(-) exchanger. Nat Struct Mol Biol. 19, 525-531 (2012).
- Tsai, M. F., Fang, Y., Miller, C. Sided functions of an arginine-agmatine antiporter oriented in liposomes. Biochemistry. 51, 1577-1585 (2012).
- Heginbotham, L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Functional reconstitution of a prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 111, 741-749 (1998).
- Lundbaek, J. A., Collingwood, S. A., Ingólfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S. Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes. J R Soc Interface. 7, 373-395 (2010).
- Lim, H. H., Stockbridge, R. B., Miller, C. Fluoride-dependent interruption of the transport cycle of a CLC Cl(-)/H(+) antiporter. Nat Chem Biol. 9, 712-715 (2013).
- Stockbridge, R. B., Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. A family of fluoride-specific ion channels with dual-topology architecture. Elife. 2, e01084 (2013).
- Nimigean, C., Shane, T., Miller, C. A cyclic nucleotide modulated prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 124, 7 (2004).
- Brohawn, S. G., del Mármol,, J,, MacKinnon, R. Crystal Structure of the Human K2P TRAAK, a Lipid- and Mechano-Sensitive K+ Ion Channel. Science. 335, 436-441 (2012).
- Jayaram, H., Robertson, J. L., Wu, F., Williams, C., Miller, C. Structure of a slow CLC Cl-/H+ antiporter from a cyanobacterium. Biochemistry. 50, 788-794 (2011).
