Introduction
I de sidste to årtier evnen til at overudtrykke og rense membrantransportproteiner steget dramatisk: ionkanaler, primære og sekundære transportører nu rutinemæssigt oprenset fra heterolog ekspression systemer samt naturlige kilder. Nye metoder til at overvåge udtryk, forbedre og lette udvindingen og øge stabiliteten af disse proteiner er konstant udvikles 1-5. Disse teknologiske gennembrud har været medvirkende til at udløse eksplosionen af atomart niveau strukturel information om membranproteiner, som til gengæld forbedret vores forståelse af de strukturelle grundlag for deres funktion. I modsætning til vores evne sonde de funktionelle egenskaber af de oprensede proteiner ikke øges ved den samme hastighed, så at i nogle tilfælde høj opløsning strukturel information er ledsaget af kvalitative funktionelle data, hvilket begrænser vores evne til kvantitativt teststrukturen-baserede forudsigelser. Derfor er UDVIKLINGSt af kvantitative og generalisere funktionelle assays er et vigtigt skridt i retning af opklaringen af de mekanistiske fundament for membranprotein funktion.
Her beskriver vi en efflux assay, der kan anvendes til kvantitativt at bestemme vigtige funktionelle egenskaber af oprenset og rekonstituerede Cl - kanaler og transportører. De principper analysen kan generaliseres til en række forskellige transportsystemer samt til ikke ion-transport proteiner. Liposomer rekonstitueres med oprensede CL - kanal / transportører i nærvær af et stort Cl - gradient (figur 1A, B). Cl - efflux initieres ved tilsætning af en ionofor for at tillade counter-ion flux, i vores tilfælde K + ionofor valinomycin, som shunt spændingen oprettet ved Cl - gradient og indstille den indledende membranpotentialet til ligevægt potentiale K + 6,7. Uden than ionofor ingen signifikant net Cl - udstrømning sker, som det er forhindret ved genereringen af et transmembrant potentiale. Dataene kvantitativt beskrevet af to målbare parametre (figur 1C): τ, den tidskonstant Cl - efflux og f 0, den del af liposomer, der ikke indeholder et aktivt protein. Fra τ og f 0 enhedskarakter Cl - transport rate, kan den del af aktive proteiner og den molekylære masse af det aktive kompleks afledes 8. Teknikken er illustreret her ved hjælp af proteoliposomer rekonstitueret med CLC-EC1, en velkarakteriseret CLC-typen H + / Cl - varmeveksler af kendt struktur og funktion. Denne analyse er let generaliseres til kanaler eller transportører med forskellige ioniske selektivitet eller hvis aktiviteter afhænger af tilstedeværelsen af spænding og / eller ligander. Desuden kan dette assay anvendes til at bestemme, om små molekyler direkte påvirke rekonstituerede protein,at kvantificere virkningerne af disse forbindelser og hvordan membransammensætning eller lipid-modificerende reagenser påvirker funktionen af de rekonstituerede kanaler og transportører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lipid Fremstilling
- Alikvot den ønskede mængde lipider i en klar glasrør. Brug E. coli polar lipidekstrakt, men de fleste lipidsammensætninger kan anvendes. Hvis lipider er i pulverform, resuspender dem i chloroform til en koncentration på 20 mg / ml. Tør lipiderne ved stuetemperatur under N2-gas, indtil alt opløsningsmidlet er fordampet.
- Resuspender lipider i pentan og tør det igen en konstant strøm af gas N2 for at fjerne efterladenskaber spor af chloroform. Tør indtil al opløsningsmiddel er fordampet. Mens tørring forsigtigt dreje røret, så at lipid er fordelt i en ensartet film, der dækker den nederste tredjedel af røret i stedet for en dannelse af en tæt masse i bunden.
- Tilsæt rekonstituering buffer indeholdende detergent (300 mM KCI, 50 mM citronsyre, 25 mM K 2 HPO 4, pH 4,5, 35 mM CHAPS) for at opløse lipiderne. Brug andre milde rengøringsmidler til dette trin, hvis proteinet er dårligt tolerant over CHAPS.
- Resuspend lipiderne til klarhed ved hjælp af et vandbad sonikator. Fordyb røret i midten af vandet sonikatorbad ved maksimal motoreffekt kort (30 sek-1 min) impulser med kort (30 sek-1 min) pauser. Opløsningen skal være klar.
BEMÆRK: Den endelige klarhed opnås, afhænger af den specifikke lipidsammensætning anvendes. Nogle batch-til-batch-variation i dette trin, selv blandt nominelt identiske lipider, er også mulig. Resterende uklarhed skyldes lysspredning af store partikler i suspensionen, som kan fjernes ved centrifugering. - Inkubér resuspenderede lipider ved stuetemperatur i 20-60 min.
2. proteoliposom Formation
BEMÆRK: Adskillige strategier kan anvendes til at indsætte detergent-solubiliserede protein i liposomer. For CLC-EC1 dialyse fungerer godt og er derfor den foretrukne metode 6,9,10.
- Tilføj det oprensede protein til det ønskede protein-til-lipid (P / L) forhold (udtrykt i ug o f protein / mg lipid). Valget af P / L-forholdet afhænger af formålet med eksperimentet.
- Hvis målet er at vurdere aktiviteten af proteinet af interesse, rekonstitueres ved høje P / L's at maksimere signalet, som hvert liposom indeholder multiple kopier af proteinet. For at kvantificere aktiviteten og / eller ensartet transport rate af proteinet rekonstitueres i en Poisson fortynding regime ved lav P / L's, således at hver vesikel indeholder gennemsnitligt 1 protein. Se trin 7 og diskussion for en mere dybtgående analyse af hvornår du skal bruge hver ordning.
- For at bestemme de optimale P / L-værdier for de forskellige regimer, udføre en komplet titrering af aktiviteten som funktion af proteinkoncentration 8,11-13. Men for en hvilken som helst protein, for hvilket den molekylvægt (MW, udtrykt i kDa) af den aktive enhed er kendt følgende P / L-værdier kan anvendes som indledende guesstimates:
pg "/>
- Læg proteinet og lipidblanding i en præ-befugtet dialyserør eller en kassette. Placer dialyse enheden i en bægerglas indeholdende 500-1,000x mængden af lipid rekonstitutionsbuffer (dvs. 1 L buffer for 1 ml lipid resuspension) under forsigtig omrøring.
- Skift buffer 3-4 gange med intervaller> 3 timer. Ved hver løsning forandring, vask kassetten / slanger og bægeret med destilleret vand og fylde bægeret med frisk rekonstituering buffer. Medtag 1-2 O / N-intervaller for løsningen forandring. Det nøjagtige antal og varighed af opløsningen ændringer afhænger af den nøjagtige lipid og rengøringsmidler anvendes.
- Efter det sidste trin er afsluttet, fjernes liposomerne fra dialyse fartøj, udportionerer dem i rør og flash fryse dem i flydende N2 eller fryse ved -80 ° C.
3. Registrering Set-up
<p class = "jove_content"> BEMÆRK: optagelse opsætning (figur 2A) består af to kamre (fladbundede cylindre, ~ 3-4 ml volumen), en Cl - (se nedenfor) elektrode, et pH-meter med en analog eller digital el-effekt, en digitizer, og en computer med en passende erhvervelse software.- Tilslut Cl - elektroden til pH-meter, produktionen af pH-meteret til digitizer, som er forbundet til computeren. Placer referenceelektrode i et kammer og omkodning tråd i den anden (figur 2B).
BEMÆRK: polaritet ledningerne er korrekt, hvis AV Cal (se trin 6.4 og 7.2) er positiv. - Placer kamrene på opsigt plade med en omrører i optagelsen kammer (figur 1B). Sørg for, at omrører ikke rører elektroden.
- Tilslut kamre ved anvendelse af en agar bro (figur 2B) (100 mM KCI og 2% agarose). Opbevar Agar broer i 100 mM KCl.
4. Forberedelse af Cl - Elektrode
- Tag en gammel og -possibly- ikke-fungerende pH-elektrode. Break glasbelægningen fuldstændigt afsløre sølvtråde.
- Fjern forsigtigt belægning fra sølvtråde ved hjælp af en skalpel. Rengør ledningerne med rigeligt H2O og EtOH.
- Anbring i en mættet opløsning af FeCl3 (eller blegemiddel), indtil tråde er dækket med en ensartet mørk frakke AgCl.
5. Fremstilling af unilamellare vesikler
- Natten før forsøgene, svulme 1 g Sephadex G-50 perler i 15 ml ekstern buffer (1 mM KCI, 150 mM K 2 SO 4, 25 mM citronsyre, pH 4,5) med forsigtig omrystning (ikke røre) til mindst 3 timer ved stuetemperatur før brug. Hvert eksperiment kræver ~ 3 ml hævede perler. Hold hævede perler ved 4 ° C for et par dage på de fleste.
- Mens liposomerne optøning ved stuetemperatur, hældes i hver søjle ~ 3 ml hævede G-50-perler. Lad dem tørre ved hjælp af tyngdekraften flow ved stuetemperatur; Dette tager normalt 1-2 min.
- Forbered unilamellare vesikler ved ekstrudering af proteoliposomer 11 gange gennem en Mini-ekstruder ved anvendelse af en 0,4 m Teflon cutoff.
- Kolonnen anbringes i en plast rundbundet rør. Spin kolonnerne for at fjerne overskydende opløsning. Centrifuger i 20-30 sekunder ved 1.400 xg i en klinisk centrifuge.
- Kassér gennemstrømning, sted kolonne i et 13 x 100 mm glasrør, og der tilsættes 100 pi af de ekstruderede vesikler til kolonnen. Spinkolonne i 1 minut ved 500 xg i en klinisk centrifuge.
- Saml ~ 200 pi gennemstrømning, som vil blive føjet til optagelse kammer i trin 6.5.
6. efflux Måling
- Anbringes 2 ml 100 mM KCI i reference (jorden) kammer og 1,8 ml af den eksterne buffer (1 mM KCI, 150 mM K 2 SO 4, 25 mM citronsyre, pH 4,5) til optagelse kammeret. Den lille osmotisk ubalance mellem den interneog eksterne løsninger påvirker ikke
- Start erhvervelsen program. Lad baseline i ligevægt, dette kan tage et par minutter.
- Når signalet når en stabil basislinje (liposomerne er klar og søjlerne tørre), starte optagelsen (figur 3A).
- Der tilsættes 15 pi af en 10 mM KCl-opløsning at kalibrere systemet (figur 2A).
- Tilføj liposomer. En lille hoppe kan være synlige på grund af ufuldstændig fjernelse af ekstern Cl - fra proteoliposomer (figur 3A). Vent til baseline stabiliserer.
- Tilføj Valinomycin (1 pi på 1 mg / ml i EtOH) at indlede udstrømning (figur 3A).
- Lad udstrømningen køre sit tidsforløb indtil det plateauer (figur 3A).
- Tilsæt 40 pi 1,5 M β-octylglucosid (β-OG) fremstillet i den eksterne buffer til at opløse alle liposomer (figur 3A). Afslutte optagelsen.
7. Data ANALYSE
- Eksporter sporingsfilen fra i ASCII- eller tekst format og importere den til analyseprogrammet valg.
- Mål spændingen på følgende punkter (figur 3A):
Ved begyndelsen af optagelsen (V 0);
Efter tilsætning af kalibreringsværktøjet puls (V CAL);
Efter tilsætning af liposomerne (V lipo);
Ved udgangen af efflux (V fin);
Efter tilsætning af detergent (V tot);
Baseline spændingerne så V 0 = 0. - Brug Nernst-Plank ligningen til at bestemme den eksperimentelle værdi af
ved måling 
Hvor Vol Cal er volumenet af kalibreringen puls i pi, 1.800 volumenet kammer ved begyndelsen af forsøget udtrykt i1 l, [Cl] cal / i er Cl - koncentrationerne af kalibreringen puls og i den eksterne buffer i mM og AV cal er springet i mV, målt efter kalibreringen puls.
BEMÆRK: Denne empirisk bestemmelse af α tjener tre formål: det sikrer, at systemet reagerer korrekt, tilbyder et mål for sammenhængen i instrumentets respons mellem eksperimenter samt at kontrollere, at ingen fejl blev foretaget i opløsningen making. - Beregn Cl-koncentrationer efter hvert trin på følgende måde:
Faktoren 3/400 kommer fra fortyndingen af kalibreringen puls 15 pi i 2.000 pi endelige volumen. - Calculspiste ændringerne i [Cl] på hvert trin, ΔCl lipo / SF / tot.
- Konverter V (t) i Cl (t) med
Direkte bestemme [Cl] værdier de kritiske punkter og sammenligne dem med de beregnede værdier som en intern kontrol. - Normalisere spor, således at Cl rel lipo = 0 og Cl rel tot = 1
- Monter efflux tidsforløbet til følgende ligning:
Hvor L er antallet af Cl - lækage, der eksperimentelt bestemt ved at måle Cl - udstrømning fra protein-fri liposomer fremstillet i de samme betingelser og τ er tidskonstanten af processen. - Beregn v, den indledende hastighed:
Når ΔCl fin udtrykkes i millimolær og V er rumfanget af kammeret i pi. - Beregn transport rate / ledningsevne
Hvor p er P / L, MW er molekylvægten af den aktive kompleks udtrykt i kDa
ved måling 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi beskriver en detaljeret og robust protokol til måling Cl - transport medieret af renset CLC-EC1, en prokaryot CLC-typen H + / Cl - veksleren, rekonstitueret i liposomer. En skematisk repræsentation af eksperimentet er vist i figur 3 proteoliposomer rekonstitueres med oprenset CLC-EC1 og med højt indhold af indre Cl -. Nedsænkes i et bad indeholdende lav Cl -. Under disse betingelser netto Cl - er efflux forhindres ved opbygning af positiv ladning i liposomet (figur 3A). Tilsætning af Valinomycin giver K + for at flytte på tværs af membranen således rangering det elektriske potentiale og initiere Cl - udstrømning (figur 3B). Den flux tidsforløb overvåges ved hjælp af en Cl - -selektiv elektrode og den samlede mængde Cl - er indeholdt i vesiklerne er direkte måles ved at opløse dem ved hjælp af vaskemiddel. Fra disseBulk eksperimenter er det muligt at bestemme egenskaberne af de enkelte rekonstituerede proteiner, såsom omsætningshastighed, støkiometri aktivt kompleks og fraktion af aktivt protein. Brug ligninger 7-9 at passe efflux tidsforløb og estimere ensartet transport på CLC-EC1 finder vi, at τ (0,2 ug / mg) = 41 sek og f 0 (0,2 ug / mg) = 0,31, hvilket indikerer, at ~ 1 / 3 af de liposomer indeholder 0 aktive proteiner. Ud fra disse værdier, vi beregne, at enhedskarakter transport sats er γ ~ 2.500 Cl - sek -1, i god overensstemmelse med publicerede værdier 8,14.
Figur 1: Cl - efflux assay (A - B) Skematisk repræsentation af Cl - -efflux assay for protein-fri liposomer (A) eller CLC-EC1.rekonstituerede vesikler (B). (C) Simuleret tidsforløbet af ionophor-initierede Cl - udstrømning fra proteoliposomer (sort) eller protein-fri liposomer (grå stiplet linje). Efflux initieres ved tilsætning af ionophor (*) og afsluttes ved tilsætning af detergent for at opløse liposomer (^). Rød stiplede linje er en eksponentiel egnet til at bestemme tid konstant, τ, Cl -. Efflux fra liposomer, der indeholder mindst 1 aktiv kopi af CLC-EC1 og f 0 er den del af liposomer indeholdende 0 aktive proteiner Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Optagelse oprettet (A) Optagelsen oprettet.. (B) Close-up af kamrene. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52369/52369fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3: Eksempel på spor og analyse (A) Typisk V (t) spor af efflux eksperimenter fra proteoliposomer rekonstitueret med WT CLC-EC1 på 0,2 ug / mg P / L.. Pile angiver tidspunkterne for tilsætning af puls KCl kalibrering, liposomer, valinomycin og β-OG. Stiplede linjer angiver AV-værdier på forskellige stadier. (B) V (t) spor omdannes til Cl (t) under anvendelse af ligning 5, normaliseret ved hjælp af ligning 6 og efflux tidsforløbet er egnet til ligning 7 (rød stiplet linie). (C) Normaliserede efflux tidsforløb fra proteoliposomer rekonstitueret med WT CLC-EC1 på 0,2 ug / mg P / L (sort) eller på 5 ug / mg P / L (grå). Stiplet linies er bedst passer til de efflux tidsforløb til ligning 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet en detaljeret protokol til at måle Cl - transport medieret af oprensede anion-selektive kanaler eller transportører rekonstitueret i liposomer. Eksemplet anvendte var den prokaryote H + / Cl - veksleren CLC-EC1. Imidlertid kan metoden let tilpasses til at studere kanaler gated af ligander 12,13,15, spænding 11,12 eller sportslige forskellige anioniske selektivitet 15,16 ved at erstatte Ag: AgCl elektrode med en egnet for ionen under overvejelse. Elektroder er selektive for andre end Cl ioner - såsom H +, I - og F -, er kommercielt tilgængelige.
En diskussion af nogle af de kritiske trin og forudsætninger følge.
Grænser for fortynding antagelse Poisson
Udledningen af enhedskarakter sats (ligning 7-9) er kun gyldig i en Poisson fortynding regime, hvor de fleste liposomer contain kun ét aktivt protein, således at sandsynligheden for at have flere kopier i en given vesikel er lav, og den makroskopiske efflux tidskonstant vesiklens befolkning er godt tilnærmet ved at af liposomer indeholdende et enkelt protein. Faktisk en sammenligning af Cl - efflux tidsforløb medieret af liposomer rekonstitueres med CLC-EC1 ved lav (sort, 0,2 ug / mg) og høj P / L (grå, 5 ug / mg) (figur 3C) viser, at i sidstnævnte tilfælde efflux kinetik bliver hurtigere og f 0 aftager, hvilket indikerer, at en mindre brøkdel af den samlede liposomer indeholder 0 proteiner. Den samlede mængde Cl - i begge vesikel prøver var sammenlignelige, ~ 0,7 og ~ 0,55 pmol henholdsvis indikerer, at de samlede interne volumen af vesikler i de to prøver var ens, og at mængden af protein rekonstitueret ikke påvirker størrelsen af vesiklerne. Montering af høje P / L efflux tidsforløb til ligning 7 frembringer værdier af τ (5 ug / mg) = 8,8 sek og f 0 (5 ug / mg) = 0,06, hvilket indikerer, at kun ca. 6% af vesiklerne indeholder ingen aktive CLC-EC1 dimerer i modsætning til ~ 31% fundet, når P / L = 0,2 ug / mg. Således estimatet af enhedsstat omsætningshastighed ved høje P / L er γ ~ 450 Cl - sek -1, næsten 6 gange lavere end den opnåede ved lav P / L og offentliggjorte data 8,14. Derfor analyse af efflux tidsforløb fra liposomer som rekonstitueres høj P / L's vil undervurdere enhedskarakter transport rate af den rekonstituerede protein. Således at vurdere det præcise enhedsstat transport på et nyt protein er det af afgørende betydning for nøjagtigt at bestemme mængden af protein rekonstitueret og arbejde ved lav P / L's, i en Poisson fortynding regime. Dette er ideelt opnås ved at bestemme en fuld protein titrering analyse for at identificere den optimale regime til at arbejde på.
Bestemmelse af massen af den aktive kompleks
telt "> Den ovenfor beskrevne analyse forudsætter, at støkiometrien af det aktive kompleks er kendt og det rekonstituerede protein er fuldt aktiv. Men for nye præparater måske ikke være kendt disse mængder på forhånd. I dette tilfælde er det muligt direkte at bestemme disse parametre ved måling af f 0 »s ved forskellige protein til lipidforhold
hvor p er det protein tæthed, 
, Ρ er antallet af liposomer pr massen af lipid, N A er Avogadros tal, M P er massen af den funktionelle kanal kompleks og φ er den fraktion af aktive proteiner. Ved at montere det eksperimentelt bestemte f 0 's ved diverse protein til lipid-forhold er det posligt at bestemme p 0, og derfor M P og φ.
Et endeligt fraktion af liposomer er refraktære over for inkorporering
Udledningen af enhedskarakter transport rate forudsætter, at ved høje P / L's alle liposomer vil indeholde mindst en aktiv transport protein. Men i nogle tilfælde har vist sig ikke at være tilfældet: ved høje P / L's en betydelig del af liposomer forbliver refraktære rekonstitution af nogle proteiner 11-13,17. Mens oprindelsen af dette fænomen er ikke klart, er det tænkeligt, at større proteiner kan blive udelukket fra vesikler med mindre radier dermed reducere antallet af tilgængelige liposomer.
I dette tilfælde har brug for ligning 10 skal ændres til: 
hvor θ er den del af liposomer ildfaste at Protein inkorporering. Vigtigere er ρ og φ også påvirket af rekonstituering metode, da forskellige procedurer vil have forskellige inddrivelser for lipider og proteiner under liposom rekonstituering og dannelse. Under forudsætning af 100% udbytte for begge vil føre til en mis-estimering af γ. Derfor, for at opnå en præcis kvantificering af ensartet omsætning / konduktans er det vigtigt at eksperimentelt bestemme den del af lipid og protein tabt under rekonstitution 8,11.
Orientering af de rekonstituerede proteiner
En af de antagelser, der i analysen er, at alle rekonstituerede proteiner er funktionelt ækvivalente. Dog har mange kanaler og transportører foretrukne retninger af transporter, et fænomen kendt som berigtigelse. Denne funktionelle asymmetri kan føre til et skøn fejl i omsætningshastighed. Endvidere orienteringen af de rekonstituerede proteiner er a priori + gradienter, for kanaler eller transportører, som er ligand- eller spænding afhængige.
Overvejelser om dannelsen af stramme liposomer
En af de vigtigste faktorer, der gør det muligt at anvende of efflux assay beskrevet her er dannelsen af stramme liposomer. Tre vigtige variabler, der skal anses for at herpå er valget af vaskemiddel for at opløse proteinet, den detergent-fjernelse strategi og valget af lipidsammensætning af liposomerne. I den protokol, der præsenteres her, er CLC-EC1 opløst i Decyl-maltopyranosid (DM), et rengøringsmiddel med en høj kritisk micellekoncentration (CMC) værdi, som derfor let kan fjernes. Imidlertid har en række syntetiske og naturligt forekommende rengøringsmidler blevet brugt til at rense proteiner, der efterfølgende rekonstitueret i stramme liposomer med ingen effekt på tætheden af vesiklerne. Disse detergenter har en bred vifte af CMCs, så højt som millimolær (såsom DM eller Digitonin), og så lavt som mikromolær (såsom dodecyl- maltopyranosid (DDM) eller dioctylpropane-bis-maltopyranosid (DMNG)). Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at de anvendte lipider til dannelse af liposomer solubiliseres ved anvendelse af CHAPS, eller en anden mild detergentOg derfor hybride miceller fremstillet af en blanding af protein og lipider kan have kemisk-fysiske egenskaber er forskellige fra dem af de stiftende vaskemidler. Det er derfor muligt, at den resterende rengøringsmiddel fjernelse, der kan destabilisere liposomerne fører til mere udtalte lækager i nogle tilfælde. For at omgå dette problem er det tilrådeligt at undersøge alternative strategier detergentfjernelse såsom Biobeads 12,13, spin-søjler 15 eller gelfiltrering 18. Endelig lipidsammensætningen af vesiklerne er en vigtig parameter som specifikke blandinger kan være utæt forskellige ioner i visse betingelser. For eksempel liposomer dannet fra E. coli polar lipidekstrakt er stramme CL - ved sure pH-værdier, men bliver gradvist mere utætte, når pH stiger 19 eller liposomer dannet fra en 3: 1 blanding af 1-palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidyl-ethanolamin (POPE) og 1-palmitoyl- 2-oleoyl phosphatidylglycerol (POPG) Vise en meget lavere permeabilitet for H + end dem, der dannes fra E. coli polar lipidekstrakt 20. Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at lipidsammensætningen af vesiklerne også kunne påvirke aktiviteten af den rekonstituerede protein 13,21,22. Således er det vigtigt præcist at bestemme egenskaberne af de protein-frie vesikler fremstillet i hver tilstand, og derefter at vurdere, hvordan dette påvirker egenskaberne af det rekonstituerede protein.
Generalisering til ikke CLC-type kanaler og transportører
Efflux assay, som beskrevet her, kan direkte anvendes til at bestemme enkelt molekyle egenskaber for ethvert Cl - -selektiv kanal eller transportør, og for eksempel er blevet anvendt til at karakterisere egenskaberne af Ca2 + -aktiverede Cl - kanal TMEM16A 12 . Vi har nu drøfte, hvordan man tilpasse efflux-analysen til at undersøge egenskaberne af transportører eller kanaliEls, der ikke er Cl - selektive og / eller har enhedsstat transportpriser, der er betydeligt forskellig fra den ~ 10 3 ion sek -1 af CLC-EC1.
Det enkleste tilfælde er, at proteinet under undersøgelsen er anion-selektiv. I dette tilfælde er den eneste nødvendige justeringer er at erstatte Ag: AgCl elektrode med en kommercielt tilgængelig en af passende selektivitet, som det blev gjort for F - -selektive Flucs og CLCS 16,23,24 eller I - permeable kanaler som CFTR 15 . Hvis på den anden side den rekonstituerede protein er selektiv for kationer, andet end valinomycin ionophor skal anvendes til at iværksætte udstrømning. I betragtning af knapheden på validerede Cl - Ionophorer en nyttig erstatning er en H + ionophor, såsom Carbonyl cyanid 4- (trifluormethoxy) phenylhydrazon (FCCP). I dette tilfælde er det vigtigt at sikre, at intravesikulær pH holdes konstant, for eksempel ved at øge buffering kapacitet i den interne opløsning. En alternativ strategi er at følge kation udstrømning gennem en rekonstitueret kanal eller transportør ved hjælp af protoner som en modion og overvågning H + transport ved hjælp af et pH-meter 25 eller en ratiometrisk pH-følsom sonde 26. Men den indirekte karakter af disse målinger gør kvantificering af transport- egenskaber rekonstituerede protein vanskeligt. Endelig elektroder er selektive for en række af kationer findes og er kommercielt tilgængelige. En tredje scenarie er, at proteinet under undersøgelse er permeabel for både anioner og kationer, for eksempel en dårligt selektiv kanal 13 eller en kation / Cl - cotransporter. I dette tilfælde har de rekonstituerede liposomer ikke opretholde en KCl gradient under løsningen udvekslingsprocessen (trin 5,4-5,5), således at de mister deres saltindhold. Derfor vil der i dette tilfælde alle kinetiske oplysninger går tabt. Men den del af liposomer indeholdende mindst en aktiv protein, f 0, stadig kan bestemmes ved at tilsætte detergent og måle den resterende fanget Cl - indhold (trin 6.8). Dette muliggør bestemmelse af molekylvægten af proteinet ved at udføre et protein titrering og anvendelse af ligning 10.
Et andet aspekt at overveje, er muligheden for, at ensartet transport rate af den rekonstituerede protein er størrelsesordener forskellige fra den for CLC-EC1. For eksempel de fleste transportører har omsætningshastigheder på 1-10 sek -1, 2-3 størrelsesordener lavere end CLC-EC1, mens de fleste kanaler adfærd ioner ved 10 6 -10 7 sek -1, 3-4.000 gange hurtigere end CLC -ec1. For langsomme transportører satsen for Cl - lækage fra protein-fri liposomer kan blive begrænsende, da dens relative vægt i efflux proces øges, når protein transport- aftager. Det er vores erfaring læk sats varierer noget mellem præparater og er normalt i størrelsesordenen enfå ion sek -1. Derfor, når der arbejdes med langsomme transportører er det tilrådeligt at fremstille protein-fri liposomer ved siden af hinanden til hver rekonstitution til nøjagtigt at måle lækagen svarer til hvert parti af vesikler. Den efflux-analysen er med succes blevet brugt til at bestemme enhedsstat sats for langsomme transportører med omsætningshastigheder omkring 1-10 ion sec -1, såsom en cyanobakteriel CLC 27. Den omvendte situation opstår, når den rekonstituerede protein har en høj ledningsevne, for eksempel en ion-kanal. I dette tilfælde efflux kinetikken er for hurtig til at blive løst som blandetiden (~ 1-2 sek), og den iboende reaktionstid for optagelsen elektrode blive hastighedsbegrænsende. I dette tilfælde er den kinetiske oplysninger tabt, men massen af aktivt kompleks kan stadig bestemmes 24. Det er værd at bemærke, at andre metoder, såsom plane lipiddobbeltlag optagelser eller patch fastspænding liposomer er mere velegnede til at studere oprensede ionkanaler som disse techniques direkte give enkelt molekyle information med høj tidsopløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | 610200 | |
| IEC Centra CL2 Benchtop | Thermo Scientific | ||
| Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter | These can be found on Ebay. | ||
| Non-functional pH probe | Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned. | ||
| DI-710 Data Logger | DATAQ instruments | ||
| WinDAQ acquisition software | DATAQ instruments | ||
| Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml | Pierce (Thermo Scientific) | 29922 | |
| KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass | Kimble Chase | 73500-13100 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids Inc. | 610000 | |
| Computer |
References
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14, 673-681 (2006).
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat Protocols. 3, 784-798 (2008).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
- Almo, S. C., Love, J. D. Better and faster: improvements and optimization for mammalian recombinant protein production. Curr Opin Struct Biol. 26, 39-43 (2014).
- Xiao, S., Shiloach, J., Betenbaugh, M. J. Engineering cells to improve protein expression. Curr Opin Struct Biol. 26, 32-38 (2014).
- Accardi, A., Miller, C. Secondary active transport mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. Nature. 427, 803-807 (2004).
- Nguitragool, W., Miller, C. Uncoupling of a CLC Cl-/H+ exchange transporter by polyatomic anions. J. Mol. Biol. 362, 682-690 (2006).
- Walden, M., et al. Uncoupling and turnover in a Cl-/H+ exchange transporter. J. Gen. Physiol. 129, 317-329 (2007).
- Accardi, A., Kolmakova-Partensky, L., Williams, C., Miller, C. Ionic currents mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. J. Gen. Physiol. 123, 109-119 (2004).
- Basilio, D., Noack, K., Picollo, A., Accardi, A. Conformational changes required for H(+)/Cl(-) exchange mediated by a CLC transporter. Nat Struct Mol Biol. 21, 456-463 (2014).
- Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. Journal of Molecular Biology. 387, 1055-1060 (2009).
- Terashima, H., Picollo, A., Accardi, A. Purified TMEM16A is sufficient to form Ca2+ activated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 19354-19359 (2013).
- Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nature Communications. 4, 2367 (2013).
- Picollo, A., Malvezzi, M., Houtman, J. C., Accardi, A. Basis of substrate binding and conservation of selectivity in the CLC family of channels and transporters. Nat Struct Mol Biol. 16, 1294-1301 (2009).
- Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287, 36639-36649 (2012).
- Stockbridge, R. B., et al. Fluoride resistance and transport by riboswitch-controlled CLC antiporters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15289-15294 (2012).
- Menon, I., et al.
- Nimigean, C. M., Miller, C. Na+ block and permeation in a K+ channel of known structure. J Gen Physiol. 120, 323-335 (2002).
- Picollo, A., Xu, Y., Johner, N., Bernèche, S., Accardi, A. Synergistic substrate binding determines the stoichiometry of transport of a prokaryotic H(+)/Cl(-) exchanger. Nat Struct Mol Biol. 19, 525-531 (2012).
- Tsai, M. F., Fang, Y., Miller, C. Sided functions of an arginine-agmatine antiporter oriented in liposomes. Biochemistry. 51, 1577-1585 (2012).
- Heginbotham, L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Functional reconstitution of a prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 111, 741-749 (1998).
- Lundbaek, J. A., Collingwood, S. A., Ingólfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S. Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes. J R Soc Interface. 7, 373-395 (2010).
- Lim, H. H., Stockbridge, R. B., Miller, C. Fluoride-dependent interruption of the transport cycle of a CLC Cl(-)/H(+) antiporter. Nat Chem Biol. 9, 712-715 (2013).
- Stockbridge, R. B., Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. A family of fluoride-specific ion channels with dual-topology architecture. Elife. 2, e01084 (2013).
- Nimigean, C., Shane, T., Miller, C. A cyclic nucleotide modulated prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 124, 7 (2004).
- Brohawn, S. G., del Mármol,, J,, MacKinnon, R. Crystal Structure of the Human K2P TRAAK, a Lipid- and Mechano-Sensitive K+ Ion Channel. Science. 335, 436-441 (2012).
- Jayaram, H., Robertson, J. L., Wu, F., Williams, C., Miller, C. Structure of a slow CLC Cl-/H+ antiporter from a cyanobacterium. Biochemistry. 50, 788-794 (2011).
