Introduction
Dans les deux dernières décennies, la capacité de surexprimer et purifier des protéines de transport membranaire a considérablement augmenté: les canaux ioniques, les transporteurs primaires et secondaires sont maintenant couramment purifiés à partir de systèmes d'expression hétérologues, ainsi que des sources naturelles. De nouvelles approches pour surveiller l'expression, améliorer et faciliter l'extraction et à améliorer la stabilité de ces protéines sont constamment mises au point 1-5. Ces avancées technologiques ont joué un rôle dans le déclenchement de l'explosion de l'information structurelle niveau atomique de protéines membranaires qui, à son tour, amélioré notre compréhension des bases structurelles de leur fonction. En revanche, notre capacité à sonder les propriétés fonctionnelles des protéines purifiées ne ont pas augmenté au même rythme, de sorte que dans certains cas, des informations structurelles haute résolution est accompagnée de données fonctionnelles qualitatives, limitant ainsi notre capacité à tester quantitativement prédictions basées sur la structure. Par conséquent, la mist des analyses fonctionnelles quantitatives et généralisables est une étape clé pour l'élucidation des fondements mécanistes de la fonction des protéines de la membrane.
Nous décrivons ici un essai d'écoulement qui peut être utilisé pour déterminer quantitativement des propriétés fonctionnelles clés de reconstituées purifiées et Cl - canaux et des transporteurs. Les principes qui sous-tendent l'analyse peuvent être généralisés à une variété de systèmes de transport, ainsi que des protéines de transport non-ioniques. Les liposomes sont reconstitués purifiés avec canal Cl - / transporteurs en présence d'un grand Cl - gradient (Figure 1A, B). Cl - efflux est initiée par l'addition d'un ionophore pour permettre un flux contre-ion, dans notre cas le K + ionophore valinomycine, qui shunter la tension établie par le Cl - gradient et régler le potentiel de la membrane initiale au potentiel de K d'équilibre + 6,7. Sans til ne ionophore Cl nette significative - efflux se produit, comme cela est empêché par la génération d'un potentiel transmembranaire. Les données sont quantitativement décrite par deux paramètres mesurables (figure 1c): τ, la constante de temps de Cl - efflux, et f 0, la fraction de liposomes ne contenant pas de protéine active. De τ et f 0 Cl unitaire - taux de transport, la fraction de protéines actives et la masse moléculaire du complexe actif peuvent être dérivées 8. La technique est illustrée ici en utilisant protéoliposomes reconstituées avec la SIC-CE1, un type bien caractérisé CTC H + / Cl - échangeur de la structure et de la fonction connue. Ce dosage est facilement généralisable à des canaux ou transporteurs à sélectivité ionique ou différent, dont l'activité dépend de la présence de tension et / ou des ligands. En outre, ce test peut être utilisé pour déterminer si petites molécules affectent directement la protéine reconstitué,pour quantifier les effets de ces composés et de la façon dont la composition de la membrane ou des réactifs lipidiques modificateurs affectent la fonction des canaux reconstituées et les transporteurs.
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Protocol
1. Préparation des lipides
- Aliquoter les lipides quantité désirée dans un tube de verre clair. Tu Vois. coli extrait lipidique polaire, mais la plupart des compositions lipidiques peuvent être utilisés. Si les lipides sont sous forme de poudre, les remettre en suspension dans du chloroforme à une concentration de 20 mg / ml. Sécher les lipides à température ambiante sous N2 gaz jusqu'à ce que tout le solvant se est évaporé.
- Reprendre les lipides dans le pentane et le sécher à nouveau un flux régulier de gaz N 2 pour éliminer les traces de restes de chloroforme. Sec jusqu'à ce que tout le solvant se est évaporé. Bien que le séchage, faire tourner doucement le tube de façon que le lipide est distribué dans un film uniforme couvrant le tiers inférieur du tube plutôt que d'une formation d'une masse dense à la base.
- Ajouter le tampon de reconstitution contenant un détergent (300 mM de KCl, 50 mM d'acide citrique, 25 mM de K 2 HPO 4, à pH 4,5, CHAPS 35 mM) pour dissoudre les lipides. Utiliser d'autres détergents doux pour cette étape si la protéine est mal tolérants à CHAPS.
- ResuspenD les lipides à la clarté en utilisant un appareil à ultrasons à bain d'eau. Plonger le tube dans le centre du bain de sonicateur de l'eau à la puissance maximale à court (30 sec-1 min) avec des impulsions de courte durée (30 sec-1 min) pauses. La solution doit devenir clair.
NOTE: Le dernier degré de clarté atteint dépend de la composition lipidique spécifique utilisé. Une certaine variation de lot à lot dans cette étape, même parmi les lipides nominalement identiques, est également possible. Trouble résiduel est dû à la diffusion de lumière par les grosses particules dans la suspension, qui peuvent être éliminés par centrifugation. - Incuber les lipides remises en suspension à température ambiante pendant 20 à 60 min.
2. Formation protéoliposome
REMARQUE: Plusieurs stratégies peuvent être employées pour introduire la protéine solubilisée par un détergent dans des liposomes. Pour CLC-ec1 dialyse fonctionne bien et est donc la méthode de choix 6,9,10.
- Ajouter la protéine purifiée de la protéine souhaitée à des lipides (P / L) rapport (exprimé en pg o f protéine / mg de lipide). Le choix du rapport P / L dépend du but de l'expérience.
- Si le but est d'évaluer l'activité de la protéine d'intérêt, à haute reconstituer P / L's pour maximiser le signal, chaque liposome contient des copies multiples de la protéine. Pour quantifier l'activité et / ou la vitesse de transport unitaire de la protéine, reconstituer dans un régime à basse dilution Poisson P / L's, de sorte que chaque vésicule contient en moyenne une protéine. Voir l'étape 7 et discussion pour une analyse plus approfondie de l'utilisation de chaque régime.
- Pour déterminer les valeurs P / L optimales pour les différents schémas, effectuer un titrage complet de l'activité en fonction de la concentration en protéine 8,11-13. Toutefois, pour toute protéine pour laquelle le poids moléculaire (MW, exprimée en kDa) de l'unité active est connu dans le P / L valeurs suivantes peuvent être utilisés comme des estimations approximatives initiales:
pg "/>
- Charger le mélange de protéines et de lipides dans un tube de dialyse pré-mouillée ou une cassette. Placer le dispositif de dialyse dans un bêcher contenant 500-1,000x le volume du tampon de reconstitution lipide (par exemple, une mémoire tampon pour L 1 ml de lipide) remise en suspension sous agitation douce.
- Changer tampon 3-4 fois à intervalles> 3 h. A chaque changement de solution, laver la cassette / tube et le bécher avec de l'eau distillée et remplir le bécher avec le tampon de reconstitution frais. Inclure 1-2 O N / intervalles pour le changement de solution. Le nombre exact et la durée des changements de la solution dépend de la lipide exacte et les détergents utilisés.
- Après la dernière étape est terminée, retirez les liposomes de la cuve de dialyse, les aliquoter dans des tubes et flash les congeler dans un liquide N 2 ou gel à -80 ° C.
3. Enregistrement Set-up
<p class = "jove_content"> NOTE: L'enregistrement mis en place (figure 2A) se compose de deux chambres (cylindres à fond plat, ~ 3-4 ml de volume), un Cl - (voir ci-dessous) électrode, un pH-mètre avec un analogue ou sortie numérique électrique, un numériseur et un ordinateur avec un logiciel d'acquisition appropriée.- Connecter le Cl - électrode de pH-mètre, la sortie de l'appareil de mesure du pH au numériseur qui est relié à l'ordinateur. Placer l'électrode de référence dans une chambre de recodage et le fil dans l'autre (figure 2B).
NOTE: La polarité des fils est correct si AV Cal (voir l'étape 6.4 et 7.2) est positif. - Placez les chambres sur une plaque d'agitation avec un barreau d'agitation dans la chambre d'enregistrement (figure 1B). Assurez-vous que la barre d'agitation ne touche pas l'électrode.
- Raccorder les chambres en utilisant un pont d'agar (figure 2B) (100 mM de KCl et 2% d'agarose). Conserver les ponts Agar dans 100 mM de KCl.
4. Préparation du Cl - électrode
- Prenez un vieux et -possibly- électrode de pH non-fonctionnement. Briser le revêtement de verre pour révéler complètement les fils d'argent.
- Retirez délicatement le revêtement des fils d'argent en utilisant une lame de scalpel. Nettoyez les fils à l'aide de grandes quantités de H 2 O et EtOH.
- Placer dans une solution saturée de FeCl 3 (ou eau de Javel) jusqu'à ce que les fils sont recouverts d'un manteau sombre uniforme de AgCl.
5. Préparation de vésicules unilamellaires
- La nuit avant les expériences, gonfler 1 g de Sephadex G-50 perles dans 15 ml de tampon externe (1 mM de KCl, 150 mM de K 2 SO 4, l'acide citrique 25 mM, pH 4,5) en agitant doucement (Ne pas remuer) pour au moins trois heures à température ambiante avant utilisation. Chaque expérience nécessite ~ 3 ml de perles gonflées. Gardez les perles gonflées à 4 ° C pendant quelques jours au plus.
- Alors que les liposomes sont décongélation à température ambiante, verser dans chaque colonne ~ 3 ml de gonflées G-50 perles. Laissez-les sécher par gravité à la température ambiante; cela prend habituellement 1-2 min.
- Préparer vésicules unilamellaires par extrusion des protéoliposomes 11 fois à travers un mini-extrudeuse en utilisant un seuil de coupure de 0,4 m de Teflon.
- Placer la colonne dans un tube à fond rond en matière plastique. Faites tourner les colonnes pour éliminer l'excès de solution. Centrifuger pendant 20 à 30 secondes à 1400 xg dans une centrifugeuse clinique.
- Jeter accréditives, lieu colonne dans un tube de verre 13 x 100 mm et ajouter 100 pi des vésicules extrudées à la colonne. Spin colonne pendant 1 min à 500 g dans une centrifugeuse clinique.
- Recueillir ~ 200 pi d'accréditives qui seront ajoutés à la chambre d'enregistrement à l'étape 6.5.
6. Efflux mesure
- Placer 2 ml de 100 mM de KCl dans la référence (masse) chambre et 1,8 ml du tampon externe (1 mM de KCl, 150 mM de K 2 SO 4, l'acide citrique mM 25 à pH 4,5) à la chambre d'enregistrement. Le léger déséquilibre osmotique entre l'interneet des solutions externes ne affecte pas
- Démarrez le programme d'acquisition. Laissez la ligne de base équilibrer, cela peut prendre quelques minutes.
- Une fois le signal atteint une ligne de base stable (les liposomes sont prêts et les colonnes sèches), commencer l'enregistrement (figure 3A).
- Ajouter 15 ul d'une solution 10 mM de KCl pour calibrer le système (figure 2A).
- Ajouter liposomes. Un petit saut pourrait être visible en raison de l'élimination incomplète de Cl externe - des protéoliposomes (figure 3A). Attendez que la ligne de base se stabilise.
- Ajouter valinomycine (1 ul à 1 mg / ml dans EtOH) pour initier l'efflux (figure 3A).
- Laissez l'efflux suivre son évolution dans le temps jusqu'à ce qu'il plateaux (figure 3A).
- Ajouter 40 ul de 1,5 M β-octylglucoside (β-OG) préparé dans le tampon externe pour dissoudre tous les liposomes (figure 3A). Terminez l'enregistrement.
7. A donnéesnalyse
- Exportez le fichier de trace à partir dans un format ASCII ou texte et l'importer dans le programme d'analyse de choix.
- Mesurer la tension aux points suivants (figure 3A):
Au début de l'enregistrement (V 0);
Après addition de l'impulsion d'étalonnage (V cal);
Après addition des liposomes (V lipo);
A la fin de l'écoulement (V fin);
Après addition de détergent (V tot);
Baseline les tensions de sorte que V 0 = 0. - Utilisez l'équation de Nernst-Planck pour déterminer la valeur expérimentale de
en mesurant 
Où Vol Cal est le volume de l'impulsion d'étalonnage dans ul, 1800 est le volume de la chambre au début de l'expérience exprimée en1; l, [Cl] cal / en sont les Cl - les concentrations de l'impulsion de l'étalonnage et de la mémoire tampon externe mM et AV cal est le saut en mV mesurée après l'impulsion d'étalonnage.
NOTE: Cette détermination empirique de α répond à trois objectifs: il se assure que le système répond correctement, offre une mesure de la cohérence de la réponse de l'instrument entre les expériences ainsi que pour vérifier qu'aucun erreurs ont été commises dans la fabrication de la solution. - Calculer les concentrations en Cl après chaque étape comme suit:
Le facteur 3/400 vient de la dilution de l'impulsion de calibrage de 15 ul dans un volume final de 2000 pl. - Calculmangé les changements dans [Cl] à chaque étape, ΔCl lipo / FIN / tot.
- Autre V (t) Cl (t) avec
Directement déterminer les [CL] valeurs aux points critiques et de les comparer aux valeurs calculées comme un contrôle interne. - Normaliser la trace de sorte que la lipo Cl rel = 0 et Cl rel tot = 1
- Monter le cours de temps d'écoulement à l'équation suivante:
Où L est le taux de Cl - fuite qui est déterminé expérimentalement en mesurant Cl - efflux de liposomes exempts de protéines préparés dans les mêmes conditions et τ est la constante de temps du processus. - Calculer v, la vitesse initiale:
Lorsque ΔCl ailette est exprimée en millimoles et V est le volume de la chambre en pi. - Calculer le taux de transport / conductance
Où p est le rapport P / L, MW est le poids moléculaire du complexe actif exprimée en kDa
en mesurant 
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Representative Results
Nous décrivons un protocole détaillé et robuste pour mesurer Cl - le transport médié par la SIC-ec1 purifiée, un type CTC procaryote H + / Cl - échangeur, reconstituée dans des liposomes. Une représentation schématique de l'expérience est illustré à la figure 3 protéoliposomes reconstituées avec la SIC-ec1 purifié et contenant haute Cl interne -. Sont immergés dans une solution de bain contenant faible Cl -. Dans ces conditions Cl net - efflux est empêché par l'accumulation de charge positive dans le liposome (figure 3A). Ajout de valinomycine permet K + pour passer à travers la membrane de manœuvre ainsi le potentiel électrique et le lancement Cl - efflux (figure 3B). L'évolution dans le temps du flux est contrôlée en utilisant un Cl - électrode sélectif et la quantité totale de Cl - contenu dans les vésicules est mesurée directement par leur solubilisation avec un détergent. De ceux-ciexpériences en vrac il est possible de déterminer les propriétés des protéines reconstituées simples, tels que le taux de chiffre d'affaires, stoechiométrie du complexe actif et de la fraction de la protéine active. En utilisant les équations 7-9 pour se adapter à l'évolution dans le temps d'écoulement et d'estimer le taux de transport unitaire de CLC-ec1 nous constatons que τ (0,2 pg / mg) = 41 s et f 0 (0,2 pg / mg) = 0,31, ce qui indique que ~ 1 / 3 contient des liposomes 0 protéines actives. De ces valeurs nous calculons que le taux de transport unitaire est γ ~ 2500 Cl - sec -1, en bon accord avec les valeurs publiées 8,14.
Figure 1: Le Cl - dosage efflux (A - B) Représentation schématique du Cl - de dosage -efflux pour les liposomes sans protéines (A) ou CLC-CE1.vésicules reconstituées (B). (C) en fonction du temps simulé des ionophore initiative Cl - efflux de protéoliposomes (noir) ou des liposomes sans protéines (gris ligne pointillée). Efflux est initiée par l'addition d'ionophore (*) et terminée par l'addition de détergent pour dissoudre liposomes (^). Ligne pointillée rouge est un ajustement exponentiel pour déterminer la constante de temps, τ, de Cl -. Efflux de liposomes contenant au moins une copie active du CLC-ec1 et f 0 est la fraction de liposomes contenant 0 protéines actives Se il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.
Figure 2: Enregistrement mis en place (A) L'enregistrement mis en place.. (B) Close-up des chambres. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52369/52369fig2large.jpg" target = "_ blank"> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: trace de l'échantillon et d'analyse (A) V typique (t) des traces d'expériences d'efflux de protéoliposomes reconstituées avec WT CLC-ec1 à 0,2 pg / mg P / L.. Les flèches indiquent le temps d'addition de l'impulsion d'étalonnage KCl, liposomes, valinomycine et β-OG. Les lignes pointillées indiquent les valeurs de AV à différents stades. (B) V (t) est converti en trace Cl (t) en utilisant l'équation 5, normalisée en utilisant l'équation 6 et le temps d'écoulement est apte cours à l'équation 7 (ligne rouge en pointillés). (C) normalisé cours à temps efflux de protéoliposomes reconstituées avec WT CLC-ec1 à 0,2 pg / mg P / L (noir) ou à 5 ug / mg P / L (gris). Ligne pointillées sont meilleurs ajustements des cours de temps d'écoulement à l'équation 7.
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Discussion
Nous avons décrit un protocole détaillé pour mesurer Cl - le transport médié par les canaux ou transporteurs reconstitués dans des liposomes anioniques sélectif purifiés. L'exemple utilisé était le procaryote H + / Cl - Échangeur CLC-CE1. Toutefois, la méthode peut être facilement adapté à l'étude canaux gated par des ligands 12,13,15, 11,12 tension, ou de sport différente sélectivité anionique 15,16 en remplaçant le Ag: AgCl par celle adaptée pour l'ion à l'étude. Électrodes sélectives pour les ions autres que Cl -, tels que H +, I - et F -, sont disponibles dans le commerce.
Une discussion de certaines des étapes critiques et les hypothèses suivre.
Limites de la dilution hypothèse Poisson
La dérivation du taux unitaire (équation 7-9) ne est valable que dans un régime de dilution Poisson, quand la plupart des liposomes suiteain seulement une protéine active de sorte que la probabilité d'avoir de multiples copies dans une vésicule donné est faible et la constante macroscopique de temps d'écoulement de la population de vésicules est bien approximée par celle des liposomes contenant une protéine unique. En effet, une comparaison de la Cl - cours de temps d'écoulement médiation par des liposomes reconstitués avec la SIC-ec1 à basse (noir, 0,2 pg / mg) et de haute P / L (gris, 5 ug / mg) (figure 3C) montre que dans le dernier cas, la cinétique d'efflux devienne plus rapide et f 0 diminue, ce qui indique une plus petite fraction de l'ensemble des liposomes contient 0 protéines. La quantité totale de Cl - contenues dans les deux échantillons de vésicules était comparable, ~ 0,7 et ~ 0,55 umoles respectivement, ce qui indique que les volumes internes totales des vésicules dans les deux échantillons était similaire et que la quantité de protéine reconstitué ne affecte pas la taille de les vésicules. Montage de la / L efflux cours du temps haute P à l'équation 7 produit des valeurs de τ ; (5 ug / mg) = 8,8 s et f 0 (5 ug / mg) = 0,06, ce qui indique que seulement ~ 6% des vésicules contient pas de dimères CTC-EC1 actifs, contrairement à l '~ 31% trouvé lorsque P / L = 0,2 ng / mg. Ainsi, l'estimation du taux de rotation unitaire à haute P / L est γ ~ 450 Cl - sec -1, près de 6 fois plus faible que celle obtenue à basse P / L et des données publiées 8,14. Par conséquent, l'analyse des cours à temps efflux de liposomes reconstitués à haute P / L's sera sous-estimer le taux de transport unitaire de la protéine reconstituée. Ainsi, pour déterminer avec précision le taux de transport unitaire d'une nouvelle protéine, il est d'une importance capitale pour déterminer avec précision la quantité de protéine reconstituée et de travailler à basse P / L's, dans un régime de dilution Poisson. Ce est idéalement réalisée par la détermination d'une analyse complète des protéines de titrage d'identifier le régime optimal pour travailler à.
Détermination de la masse du complexe actif
tente "> L'analyse décrite ci-dessus suppose que la stoechiométrie du complexe actif est connu, et la protéine reconstitué est pleinement active. Toutefois, de nouvelles préparations pour ces quantités peuvent ne pas être connus a priori. Dans ce cas, il est possible de déterminer directement ces paramètres par mesure de la f 0 's protéine à différents rapports lipidiques
où p est la densité de la protéine, 
, Ρ est le nombre de liposomes par masse de lipides, N A est le nombre d'Avogadro, P M est la masse du complexe de canal fonctionnel et φ est la fraction de protéines actives. En installant l'déterminé expérimentalement f 0 's à divers protéines à des taux de lipides, il est possible de déterminer p 0, et donc M P et φ.
Une fraction de liposomes fini est réfractaire au incorporation
La dérivation du taux de transport unitaire suppose que à haute P / tous les liposomes de L'contiendront au moins une protéine de transport actif. Toutefois, dans certains cas, cela a été trouvé ne pas être le cas: à haute P / une fraction significative de L'de liposomes reste réfractaire à la reconstitution de certaines protéines 11-13,17. Bien que l'origine de ce phénomène ne sont pas claires, il est concevable que les protéines plus grandes peuvent être exclus de vésicules avec de plus petits rayons, réduisant ainsi le nombre de liposomes disponibles.
Dans ce cas, l'équation 10 doit être modifiée pour: 
où θ est la fraction de liposomes réfractaires à Protein incorporation. Surtout, ρ et φ sont également touchés par la méthode de reconstitution depuis différentes procédures auront différents recouvrements des lipides et des protéines au cours liposome reconstitution et la formation. En supposant un rendement de 100% pour les conduira à une mauvaise estimation de γ. Par conséquent, pour obtenir une quantification précise de la rotation unitaire / conductance, il est important de déterminer expérimentalement la fraction de lipides et de protéines lors de la reconstitution perdu 8,11.
Orientation des protéines reconstituées
Une des hypothèses retenues lors de l'analyse, ce est que toutes les protéines reconstituées sont fonctionnellement équivalents. Cependant, de nombreux canaux et transporteurs ont préféré directions des transports, un phénomène connu sous le nom de rectification. Cette asymétrie fonctionnelle pourrait conduire à une erreur d'estimation du taux de chiffre d'affaires. En outre, l'orientation des protéines reconstituées est a priori + gradients, des canaux ou des transporteurs qui sont ligand ou dépendant de la tension.
Considérations sur la formation de liposomes serrés
L'un des facteurs clés permettant l'utilisation of le dosage d'efflux décrit ici est la formation de liposomes serrés. Trois variables importantes à prendre en considération à cette fin sont le choix du détergent utilisé pour solubiliser la protéine, cette stratégie d'élimination de détergent et le choix de la composition en lipides des liposomes. Dans le protocole présenté ici, CLC-ec1 est solubilisé dans Decyl-maltopyranoside (DM), un détergent avec une valeur haute concentration critique de micelles (CMC) qui est donc facilement enlevé. Cependant, une variété de détergents synthétiques et naturels ont été utilisés pour purifier des protéines qui ont ensuite été reconstitués dans des liposomes serrés avec aucun effet sur l'étanchéité des vésicules. Ces détergents ont un large éventail de CMC, aussi haut que millimolaire (comme DM ou Digitonine) et aussi bas que micromolaire (comme dodécyl- maltopyranoside (DDM) ou dioctylpropane-bis-maltopyranoside (DMNG)). Il est important de noter, cependant, que les lipides utilisés pour former les liposomes sont solubilisées à l'aide de CHAPS, ou un autre détergent douxEt par conséquent, les micelles mixtes résultant du mélange de protéines et de lipides peuvent avoir des propriétés physico-chimiques différentes de celles des détergents mères. Il est donc possible que, dans certains cas, l'élimination du détergent résiduel qui pourrait déstabiliser les liposomes conduisant à des fuites plus prononcés. Pour contourner ce problème, il est conseillé d'étudier les stratégies d'élimination de détergent alternatives, telles que BioBeads 12,13, colonnes de spin de filtration 15 ou 18 gel. Enfin, la composition lipidique des vésicules est un paramètre important que des mélanges spécifiques pourraient être percé de différents ions dans certaines conditions. Par exemple, les liposomes formés à partir de E. coli extrait lipidique polaire sont serrés à cl - à pH acide de mais deviennent progressivement moins étanches que le pH augmente 19 ou liposomes formés à partir d'un mélange 3: 1 de 1-palmitoyl-2-oléoyl phosphatidyléthanolamine (POPE) et 1-palmitoyl- 2-oléoyl phosphatidylglycérol (POPG) Afficher une perméabilité beaucoup plus faible à H + que ceux formés à partir E. coli extrait lipidique polaire 20. Il est important de noter, cependant, que la composition lipidique des vésicules peut également affecter l'activité de la protéine 13,21,22 reconstitué. Ainsi, il est important de déterminer précisément les propriétés des vésicules sans protéines préparés dans chaque état, puis à évaluer la manière dont ceci affecte les propriétés de la protéine reconstitué.
Généralisation à des canaux et des transporteurs de type CTC non
L'essai d'écoulement, tel que décrit ici, peut être directement utilisée pour déterminer les propriétés de molécules uniques de toute Cl - canal sélectif ou transporteur, et par exemple, a été utilisée pour caractériser les propriétés du -activated Cl Ca 2+ - canal 12 TMEM16A . Nous discutons maintenant de savoir comment adapter le dosage d'efflux pour étudier les propriétés des transporteurs ou channEls qui ne sont pas Cl - sélective et / ou des taux de transport unitaires qui sont significativement différents de la 10 ~ 3 sec -1 ions de CLC-CE1.
Le cas le plus simple est que la protéine à l'étude est d'anions sélective. Dans ce cas, le seul ajustement nécessaire est de remplacer l'Ag: AgCl avec un disponible dans le commerce une sélectivité appropriée, comme cela a été fait pour le F - Flucs sélectifs et CLC 16,23,24 ou I - canaux perméables tels que CFTR 15 . Si, en revanche, la protéine reconstituée est sélectif pour les cations, un ionophore autre que la valinomycine doit être utilisé pour initier efflux. Étant donné la rareté des validé Cl - ionophores un substitut utile est un H + ionophore, tels que le cyanure de carbonyle 4- (trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP). Dans ce cas, il est important de se assurer que le pH est maintenu constant intravésiculaire, par exemple en augmentant la mémoire tamponing capacité de la solution interne. Une stratégie alternative consiste à suivre cation écoulement à travers un canal ou transporteur reconstitué à l'aide de protons en tant que contre-ion H + et le suivi de transport à l'aide d'un pH-mètre 25 ou une sonde sensible au pH 26 ratiométrique. Cependant, la nature indirecte de ces mesures rend la quantification des propriétés de transport de la protéine reconstitué difficile. Enfin, les électrodes sélectives pour un certain nombre de cations existent et sont disponibles dans le commerce. Un troisième scénario est que la protéine à l'étude est perméable à la fois aux anions et de cations, par exemple un canal sélectif mal ou un cation 13 / Cl - cotransporteur. Dans ce cas, les liposomes reconstitués ne maintiennent pas un gradient de KCl pendant le processus d'échange de solution (étapes 5.4 à 5.5), de sorte qu'ils perdent leur teneur en sel. Par conséquent, dans ce cas, toutes les informations cinétique est perdue. Cependant, la fraction de liposomes contenant au moins un actif protein, f 0, peut encore être déterminée par addition de détergent et mesurer le résiduel piégé Cl - contenu (étape 6.8). Cela permet la détermination de la masse moléculaire de la protéine en effectuant un titrage de protéine et en utilisant l'équation 10.
Un autre aspect à considérer est la possibilité que le taux de transport unitaire de la protéine est reconstituée ordres de grandeur différent de celui de la SIC-EC1. Par exemple, la plupart des transporteurs ont des taux de 1 à 10 sec -1, 2-3 ordres de grandeur inférieure à CLC-ec1 chiffre d'affaires, tandis que la plupart des chaînes conduite ions à 10 6 -10 7 sec -1, 3-4,000 fois plus rapide que la SIC -ec1. Pour les transporteurs lents, le taux de Cl - fuite des liposomes sans protéines peuvent devenir limitant, comme son poids relatif dans les processus d'efflux augmente à mesure que les baisses de taux de transport de la protéine. Dans notre expérience, le taux de fuite varie quelque peu entre les préparations et est habituellement de l'ordre d'unpeu d'ions sec -1. Par conséquent, lorsque l'on travaille avec des transporteurs lents, il est conseillé de préparer des liposomes sans protéines côte à côte pour chaque reconstitution de mesurer avec précision la fuite correspondant à chaque lot de vésicules. L'essai d'écoulement a été utilisé avec succès pour déterminer le taux unitaire de transporteurs lents avec des taux de roulement autour de 1-10 ions sec -1, comme un CTC 27 cyanobactéries. La situation inverse se produit lorsque la protéine reconstituée a une conductance élevée, par exemple un canal ionique. Dans ce cas, la cinétique efflux sont trop rapides pour être résolus que le temps de mélange (~ 1-2 sec) et le temps de réponse intrinsèque de l'électrode d'enregistrement deviendra limitant la vitesse. Dans ce cas, l'information cinétique est perdue, mais la masse du complexe actif peut encore être déterminé 24. Il est à noter que d'autres approches, telles que les enregistrements plane bicouches lipidiques ou de liposomes de patch-clamp sont plus appropriés pour étudier les canaux ioniques purifiés que ceux-ci techniques fournir directement des informations molécule unique avec haute résolution temporelle.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | 610200 | |
| IEC Centra CL2 Benchtop | Thermo Scientific | ||
| Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter | These can be found on Ebay. | ||
| Non-functional pH probe | Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned. | ||
| DI-710 Data Logger | DATAQ instruments | ||
| WinDAQ acquisition software | DATAQ instruments | ||
| Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml | Pierce (Thermo Scientific) | 29922 | |
| KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass | Kimble Chase | 73500-13100 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids Inc. | 610000 | |
| Computer |
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