Introduction
I senaste två decennierna förmågan att överuttrycker och rena membrantransportproteiner har dramatiskt ökat: jonkanaler, primära och sekundära transportörer nu rutinmässigt renas från heterologa expressionssystem samt naturliga källor. Nya metoder för att övervaka uttryck, förbättra och underlätta utvinning och förbättra stabiliteten i dessa proteiner ständigt utvecklas 1-5. Dessa tekniska genombrott har varit avgörande för att utlösa explosionen av atomnivå strukturell information om membranproteiner som i sin tur förbättrade vår förståelse av de strukturella grunderna för deras funktion. Däremot att vår förmåga sondera de funktionella egenskaperna hos de renade proteinerna ökade inte i samma takt, så att i vissa fall hög upplösning strukturell information åtföljs av kvalitativa funktionella data, vilket begränsar vår förmåga att kvantitativt testa strukturbaserade förutsägelser. Således, den development av kvantitativa och generaliserbara funktionella analyser är ett viktigt steg mot att klarlägga de mekanistiska grunderna för membranproteinfunktion.
Här beskriver vi en utflödesanalys som kan användas för att kvantitativt bestämma viktiga funktionella egenskaper hos renade och rekonstituerade Cl - kanaler och transportörer. De principer som ligger till grund för analysen kan generaliseras till en mängd olika transportsystem, liksom till icke jon-transporterande proteiner. Liposomer rekonstitueras med renade CL - kanal / transportörer i närvaro av ett stort Cl - lutning (figur 1A, B). Cl - utflöde initieras genom tillsats av en jonofor att möjliggöra kontra jonflöde, i vårt fall K + jonoforen valinomycin som shunt spänningen fastställts av Cl - lutning och ställa den inledande membranpotentialen till jämviktspotential K + 6,7. Utan tHan jonofor ingen betydande netto Cl - utflöde sker, eftersom det förhindras genom generering av en transpotential. Uppgifterna kvantitativt beskrivs av två mätbara parametrar (Figur 1C): τ, tidskonstant Cl - utflöde, och f 0, den del av liposomer som inte innehåller ett aktivt protein. Från τ och f 0 den enhetliga Cl - transporthastighet, kan den del av aktiva proteiner och molekyl massan av den aktiva komplexet härledas 8. Tekniken illustreras här med proteoliposomer ombildade med CLC-EC1, en väl karakteriserad CLC-typ H + / Cl - växlare av känd struktur och funktion. Denna analys är lätt generaliseras till kanaler eller transportörer med olika joniska selektivitet eller vars verksamhet är beroende av förekomsten av spänning och / eller ligander. Dessutom kan denna analys användas för att bestämma huruvida små molekyler som direkt påverkar den rekonstituerade proteinet,för att kvantifiera effekterna av dessa föreningar och hur membrankomposition eller lipid-modifierande reagens påverkar funktionen av de rekonstituerade kanaler och transportörer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lipid Framställning
- Alikvotera den önskade mängden lipider i en klar glasröret. Använd E. coli-polär lipid extrakt, men de flesta lipidkompositionerna kan användas. Om lipiderna är i pulverform, återsuspendera dem i kloroform till en koncentration av 20 mg / ml. Torka lipider vid RT under N2 gas tills allt lösningsmedel har avdunstat.
- Resuspendera lipider i pentan och torka den igen en stadig ström av gas N2 för att avlägsna överblivna spår av kloroform. Torr tills allt lösningsmedel har avdunstat. Medan torkning, rotera försiktigt röret så att lipiden är fördelad i en likformig film som täcker den nedre tredjedelen av röret i stället för ett bildande av en tät massa i botten.
- Lägg rekonstitutionen buffert innehållande detergent (300 mM KCl, 50 mM citronsyra, 25 mM K 2 HPO 4, pH 4,5, 35 mM CHAPS) för att lösa lipiderna. Använd andra milda tvättmedel för detta steg om proteinet är dåligt tolerant mot CHAPS.
- Resuspend lipiderna till klarhet med en vatten badsonikator. Sänk ned röret i mitten av vatten sonikator badet vid maximal effekt kort (30 sek-1 min) pulser med kort (30 sek-1 min) pausas. Lösningen bör bli klar.
OBS: Den slutliga graden av klarhet som uppnås beror på den specifika lipid komposition som används. Vissa sats till sats variation i detta steg, även bland nominellt identiska lipider, är också möjligt. Rest haze beror på ljusspridning av stora partiklar i suspensionen, som kan avlägsnas genom centrifugering. - Inkubera resuspenderade lipider vid RT under 20-60 minuter.
2. Proteoliposome Bildning
OBS: Flera strategier kan användas för att sätta in detergent-solubiliserade proteinet i liposomer. För CLC-EC1 dialys fungerar bra och är därför den metod som före 6,9,10.
- Lägg det renade proteinet till det önskade proteinet och lipid (P / L) förhållandet (uttryckt i | ig o F-protein / mg lipid). Valet av P / L-förhållandet beror på syftet med experimentet.
- Om målet är att bedöma aktiviteten hos proteinet av intresse, rekonstituera vid höga P / L: s för att maximera signalen, eftersom varje liposomer innehåller flera kopior av proteinet. För att kvantifiera aktiviteten och / eller enhetlig transporthastighet av proteinet, rekonstituera i en Poisson utspädnings regim vid låg P / L: s, så att varje vesikel innehåller i genomsnitt 1 protein. Se steg 7 och diskussion för en mer djupgående analys av när du ska använda varje regim.
- För att bestämma de optimala P / L-värden för de olika regimer, utför en fullständig titrering av aktiviteten som en funktion av proteinkoncentration 8,11-13. Men för varje protein för vilket molekylvikt (MW, uttryckt i kDa) av den aktiva enheten är känd följande P / L-värden kan användas som initiala guesstimates:
pg "/>
- Fyll på proteinet och lipidblandningen i en i förväg vätt dialysrör eller en kassett. Placera dialysanordning i en bägare innehållande 500-1,000x volymen av lipiden rekonstitution buffert (dvs., en L-buffert under 1 ml lipid resuspension) under försiktig omrörning.
- Byt buffert 3-4 gånger i intervaller> 3 tim. Vid varje lösning förändring, tvätta kassetten / slang och bägaren med destillerat vatten och fyll bägaren med färsk beredning buffert. Inkludera 1-2 O / N intervall för förändringen lösningen. Det exakta antalet och varaktigheten av förändringar lösningen beror på den exakta lipid och rengöringsmedel som används.
- Efter det sista steget är klar tar liposomerna från dialyskärlet, alikvot dem i rör och flash frysa dem i flytande N2 eller frysa vid -80 ° C.
3. Inspelning Set-up
<p class = "jove_content"> OBS: Inspelningen set-up (Figur 2A) består av två kamrar (flatbottnade cylindrar, ~ 3-4 ml volym), en Cl - (se nedan) elektrod, en pH-mätare med en analog eller digital eleffekt, en digitizer, och en dator med en lämplig förvärvs programvara.- Anslut Cl - elektroden till pH-mätare, utsignalen från pH-mätaren till digitaliseraren, som är ansluten till datorn. Placera referenselektrod i en kammare och omkodning tråden i den andra (Figur 2B).
OBS: Polariteten av trådarna är korrekt om AV Cal (se steg 6.4 och 7.2) är positiv. - Placera kamrarna på en uppståndelse tallrik med en omrörare i inspelningen kammaren (Figur 1B). Se till att omröraren inte vidrör elektroden.
- Anslut kamrarna med användning av en agar brygga (figur 2B) (100 mM KCl och 2% agaros). Förvara Agar broar i 100 mM KCl.
4. Beredning av Cl - Elektrod
- Ta en gammal och -possibly- icke fungerande pH-elektrod. Bryt glasbeläggningen att helt avslöja silvertrådar.
- Försiktigt bort beläggningen från silvertrådar med en skalpell blad. Rengör ledarna med kopiösa mängder H2O och EtOH.
- Placera i en mättad lösning av FeCl3 (eller blekmedel) tills trådarna är täckt med en enhetlig mörk lager AgCl.
5. Framställning av unilamellära vesiklar
- Kvällen innan experimenten, sväller 1 g Sephadex G-50 pärlor i 15 ml extern buffert (1 mM KCl, 150 mM K 2 SO 4, 25 mM citronsyra, pH 4,5) med försiktig skakning (inte rör) för minst 3 h vid RT före användning. Varje experiment kräver ~ 3 ml svullna pärlor. Behåll de svällda pärlorna vid 4 ° C under några dagar som mest.
- Medan liposomerna upptining vid RT, häll i varje kolumn ~ 3 ml av svällda G-50-pärlor. Låt dem torka av tyngdkraften flöde vid RT; Detta tar vanligtvis 1-2 minuter.
- Förbered enlamellvesiklar genom extrudering av proteoliposomer 11 gånger genom en Mini-Extruder med hjälp av en 0,4 m Teflon cutoff.
- Placera kolonnen i en plast rundbottnad rör. Snurra kolumnerna för att avlägsna överflödig lösning. Centrifugera under 20-30 sek vid 1400 xg i en klinisk centrifug.
- Kassera genomströmning, plats kolonn i en 13 x 100 mm glasrör och tillsätt 100 | il av de extruderade vesiklama till kolonnen. Spin kolumn 1 min vid 500 x g i en klinisk centrifug.
- Samla ~ 200 pl genomströmning som kommer att läggas till inspelningen kammaren i steg 6.5.
6. Efflux Mätning
- Placera 2 ml av 100 mM KCl i referens- (jord) kammare och 1,8 ml av den externa bufferten (1 mM KCl, 150 mM K 2 SO 4, 25 mM citronsyra, pH 4,5) till inspelningen kammaren. Den lilla osmotiska obalansen mellan den internaoch externa lösningar inte påverkar
- Starta förvärvsprogrammet. Låt baslinjen jämvikt, detta kan ta några minuter.
- När signalen når en stabil baslinje (liposomerna är redo och kolumnerna torka), starta inspelningen (figur 3A).
- Lägg 15 pl av en 10 mM KCl-lösning för att kalibrera systemet (Figur 2A).
- Lägg liposomer. Ett litet hopp kan vara synliga på grund av ofullständig avlägsnande av extern Cl - från proteoliposomer (Figur 3A). Vänta tills baslinjen stabiliseras.
- Lägg Valinomycin (en pl på en mg / ml i EtOH) för att initiera efflux (figur 3A).
- Låt utflödet köra tidsförloppet tills det platåer (Figur 3A).
- Lägg 40 pl av 1,5 M β-oktylglukosid (β-OG) framställd i den externa bufferten för att lösa upp alla liposomer (Figur 3A). Avsluta inspelningen.
7. Data ANALYS
- Exportera spårningsfilen från i en ascii eller textformat och importera den till analysprogrammet val.
- Mät spänningen på följande punkter (Figur 3A):
I början av inspelningen (V 0);
Efter tillsats av kalibreringspulsen (V cal);
Efter tillsats av liposomerna (V lipo);
Vid slutet av utflödet (V fin);
Efter tillsats av rengöringsmedel (V tot);
Baseline spänningarna så att V 0 = 0. - Använd Nernst-Plank ekvation för att bestämma det experimentella värdet av
genom att mäta 
Där Vol Cal är volymen av kalibreringspulsen i pl, 1800 är kammarvolymen vid början av experimentet uttrycks i1, l, [Cl] cal / i är Cl - koncentrationerna av kalibreringspulsen och den externa bufferten i mM och AV cal är hoppet i mV mätt efter kalibreringspulsen.
OBS: Denna empiriska bestämning av α tjänar tre syften: det garanterar att systemet fungerar korrekt, och erbjuder ett mått på konsistensen av instrumentets respons mellan experiment samt att kontrollera att inga misstag gjordes i lösningen andet. - Beräkna Cl koncentrationerna efter varje steg enligt följande:
Faktorn 3/400 kommer från utspädning av 15 pl kalibreringspuls till 2.000 l slutlig volym. - Calculåt förändringarna i [Cl] vid varje steg, ΔCl lipo / slutlig / tot.
- Konvertera V (t) i Cl (t) med
Direkt bestämma [Cl] värden vid de kritiska punkterna och jämföra dem med de beräknade värdena som en intern kontroll. - Normalisera spår så att Cl rel lipo = 0 och Cl rel tot = 1
- Montera utflödes tidsförloppet till följande ekvation:
Där L är graden av Cl - läckage som experimentellt bestäms genom mätning Cl - utflöde från proteinfria liposomer framställda under samma förhållanden och τ är tidskonstanten för processen. - Beräkna v, den initiala hastigheten:
Där ΔCl fena uttrycks i millimolar och V är volymen hos kammaren i il. - Beräkna transporthastighet / konduktans
Där p är P / L, är MW molekylvikten av den aktiva komplexet uttryckt i kDa
genom att mäta 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi beskriver en detaljerad och robust protokoll för att mäta Cl - transport förmedlad av renat CLC-EC1, en prokaryot CLC-typ H + / Cl - växlare, rekonstruerad i liposomer. En schematisk representation av experimentet visas i Figur 3 proteoliposomer rekonstituerade med renat CLC-EC1 och innehållande hög inre Cl -. Är nedsänkta i en badlösning innehållande låg Cl -. Under dessa förhållanden netto Cl - är utflöde förhindras genom uppbyggnaden av positiv laddning i liposomen (Figur 3A). Tillsättning av Valinomycin låter K + för att flytta över membranet därmed växling den elektriska potentialen och initiera Cl - utflöde (Figur 3B). Flödes tidsförloppet övervakas med hjälp av en Cl --selektiv elektrod och den totala mängden Cl - som finns i de blåsor direkt mäts genom solubilisering dem med diskmedel. Från dessabulk experiment är det möjligt att bestämma egenskaperna hos de enskilda rekonstituerade proteiner, såsom omsättningshastighet, stökiometri aktivt komplex och fraktionen av aktivt protein. Använda ekvationer 7-9 för att passa utflödes tidsförloppet och uppskatta den enhetliga transporthastigheten för CLC-EC1 finner vi att τ (0,2 ng / mg) = 41 sek och f 0 (0,2 ng / mg) = 0,31, vilket indikerar att ~ 1 / 3 av liposomerna innehåller 0 aktiva proteiner. Från dessa värden vi beräknar att den enhetliga transporthastigheten är γ ~ 2.500 Cl - sek -1, i god överensstämmelse med publicerade värden 8,14.
Figur 1: Cl - utflödes analys (A - B) Schematisk representation av Cl - -efflux analys för proteinfria liposomer (A) eller CLC-EC1.rekonstituerade vesiklar (B). (C) Simulerad tidsförloppet för jonofor initierad Cl - utflöde från proteoliposomer (svart) eller proteinfria liposomer (grå streckad linje). Utflöde initieras genom tillsats av jonofor (*) och avslutades genom tillsats av rengöringsmedel för att upplösa liposomer (^). Röd streckad linje är en exponentiell passform för att bestämma tidskonstant, τ, av Cl -. Utflöde från liposomer innehållande minst 1 aktiv kopia av CLC-EC1 och f 0 är den del av liposomer innehållande 0 aktiva proteiner Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Inspelning inrättas (A) Inspelningen inrättas.. (B) Närbild av kamrarna. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52369/52369fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Exempel på spår och analys (A) Typisk V (t) spår av utflödesexperiment från proteoliposomer ombildade med WT CLC-EC1 på 0,2 mikrogram / mg P / L.. Pilar indikerar tidpunkterna för tillsats av KCl Kalibreringspuls, Liposomer, valinomycin och β-OG. Streckade linjer anger de AV-värden i olika skeden. (B) V (t) spår omvandlas till Cl (t) med hjälp av ekvation 5, normaliserad använder ekvation 6 och utflödes tidsförloppet är lämplig till ekvation 7 (röd streckad linje). (C) Normaliserade utflödestidsförlopp från proteoliposomer ombildade med WT CLC-EC1 på 0,2 mikrogram / mg P / L (svart) eller på 5 mikrogram / mg P / L (grå). Streckad linjes är bästa anfall av de utflödestidsförlopp för att ekvationen 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrivit ett detaljerat protokoll för att mäta Cl - transport förmedlad av renade anjon-selektiva kanaler eller transportörer ombildade i liposomer. Exemplet som användes var den prokaryota H + / Cl - växla CLC-EC1. Emellertid kan metoden enkelt anpassas för att studera kanaler gated av ligander 12,13,15, spännings 11,12, eller idrottsliga olika anjoniska selektivitet 15,16 genom att ersätta Ag: AgCl-elektrod med en lämplig för jonen under övervägande. Elektroder selektiva för andra än Cl-joner -, såsom H +, I - och F -, är kommersiellt tillgängliga.
En diskussion om några av de kritiska stegen och antaganden följer.
Begränsningar i Poisson utspädnings antagandet
Härledningen av den enhetliga skattesats (Ekvation 7-9) är giltigt endast i en Poisson utspädnings regim, när de flesta liposomer fortsain endast ett aktivt protein, så att sannolikheten för att ha flera kopior i en given vesikel är låg och det makroskopiska utflödes tidkonstant vesikel populationen kan approximeras med den hos liposomer innehållande ett enda protein. Vid en jämförelse av Cl - (fig 3C) visar utflödes tidsförloppet medierad av liposomer ombildade med CLC-EC1 vid låga (svart, 0,2 pg / mg) och högt P / L (grå, 5 pg / mg) som i senare fallet de utflödes kinetik blir snabbare och f 0 minskar, vilket tyder på att en mindre andel av den totala liposomer innehåller 0 proteiner. Den totala mängden Cl - som finns i både blåsprov var jämförbar, ~ 0.7 och ~ 0,55 umol, vilket indikerar att den totala interna volymerna av blåsor i de två proven var liknande och att mängden protein rekonstituerad inte påverkar storleken på vesiklarna. Montering av höga P / L utflödes tidsförloppet till ekvation 7 producerar värden på τ ; (5 pg / mg) = 8,8 sek och f 0 (5 ^ g / mg) = 0,06, vilket indikerar att endast ~ 6% av vesiklarna innehåller inga aktiva CLC-EC1 dimerer i motsats till ~ 31% hittades när P / L = 0,2 | ig / mg. Således är uppskattningen av den enhetliga omsättningshastigheten vid höga P / L γ ~ 450 Cl - sek -1, nästan 6 gånger lägre än den som erhålls vid låg P / L och publicerade data 8,14. Därför analys av utflödestidsförlopp från liposomer ombildade vid hög P / L: s kommer att underskatta den enhetliga transporthastigheten av den rekonstituerade proteinet. Således, för att exakt fastställa den enhetliga transporthastighet ett nytt protein är det av central betydelse att exakt bestämma mängden protein beredas och att arbeta vid låga P / L: s, i en Poisson utspädnings regim. Detta är idealiskt uppnås genom att bestämma en fullständig protein titrering analys för att identifiera den optimala regimen att arbeta på.
Bestämning av massan av det aktiva komplexet
tält "> Den ovan beskrivna analysen förutsätter att stökiometrin för aktivt komplex är känd och det rekonstituerade proteinet är fullständigt aktivt. Men för nya preparat dessa kvantiteter inte kunde vara känd a priori. I detta fall är det möjligt att direkt fastställa dessa parametrar genom att mäta f 0 's vid annat protein till lipid-förhållanden
där p är proteindensiteten, 
Är ρ antalet liposomer per massa av lipid, är N A Avogadros tal, M P är massan av den funktionella kanalkomplexet och φ är fraktionen av aktiva proteiner. Genom att montera den experimentellt bestämda f 0 's vid olika protein till lipid är det posligt att bestämma p 0, och därför M P och φ.
En ändlig fraktion av liposomer är refraktär mot inkorporering
Härledningen av den enhetliga transporthastighet antar att vid höga P / L: s alla liposomer innehåller minst en aktiv transportprotein. Men i vissa fall har visat sig inte vara fallet: med hög P / L: s en större del av liposomer förblir eldfast till beredning av vissa proteiner 11-13,17. Medan ursprunget till detta fenomen är inte klart att det är tänkbart att större proteiner kan undantas från vesikler med mindre radier vilket minskar antalet tillgängliga liposomer.
I det här fallet behöver ekvation 10 ändras för att: 
där θ är den fraktion av liposomer eldfasta att protein inkorporering. Viktigt ρ och φ påverkas också av den beredning metoden eftersom olika förfaranden kommer att ha olika återvinningar för lipider och proteiner under liposomer beredning och formation. Förutsatt 100% avkastning för både kommer att leda till en felaktig uppskattning av γ. Därför, för att erhålla en exakt kvantifiering av den enhetliga omsättning / konduktans är det viktigt att experimentellt bestämma den fraktion av lipid och protein förloras under rekonstitution 8,11.
Orientering av de ombildade proteiner
En av de antaganden som gjorts under analysen är att alla rekonstituerade proteiner är funktionellt likvärdiga. Men många kanaler och transportörer Riktningar som föredras transporter, ett fenomen som kallas rättelse. Denna funktionella asymmetri kan leda till en uppskattning fel i omsättningshastighet. Dessutom är orienteringen av de ombildade proteinerna a priori + gradienter, för kanaler eller transportörer som är ligand- eller spänningsberoende.
Överväganden om bildandet av snäva liposomer
En av de viktigaste faktorerna som gör det möjligt att använda of utflödet analys som beskrivs här är bildandet av snäva liposomer. Tre viktiga variabler som skall beaktas för detta ändamål är valet av tvättmedel som används för att solubilisera proteinet, strategin detergent-avlägsnande och valet av lipidkompositionen för liposomerna. I protokollet presenteras här, är CLC-EC1 löses i Decyl-maltopyranosid (DM), ett tvättmedel med hög kritisk micellkoncentration (CMC) värde som därför enkelt tas bort. Dock har en mängd olika syntetiska och naturligt förekommande rengöringsmedel använts för att rena proteiner som därefter rekonstitueras i trånga liposomer utan effekter på täthet av blåsor. Dessa detergenter har ett brett utbud av CMC maskiner, så högt som millimolar (såsom DM eller Digitonin) och så lågt som mikromolar (t.ex. dodekyl- maltopyranosid (DDM) eller dioctylpropane-bis-maltopyranosid (DMNG)). Det är viktigt att notera emellertid att lipiderna användas för att bilda liposomerna solubiliseras med användning av CHAPS, eller annan milt rengöringsmedelOch därför hybrid miceller följd av blandning av protein och lipider kan ha kemisk-fysikaliska egenskaper som skiljer sig från de av moder tvättmedel. Det är därför möjligt att i vissa fall rest detergentavlägsnande som skulle kunna destabilisera liposomerna som leder till mer uttalade läckor. För att kringgå detta problem är det lämpligt att undersöka alternativa strategier borttagning tvättmedel, såsom biobeads 12,13, spinnkolonner 15 eller gel filtrerings 18. Slutligen är lipidkompositionen av vesiklarna en viktig parameter som specifika blandningar kan vara otät till olika joner i vissa förhållanden. Till exempel, liposomer bildade från E. coli-polär lipid extrakt är åtdragna med cl - vid sura pH-värden, men blir successivt mer läckande när pH ökar 19 eller liposomer bildade från en 3: 1 blandning av 1-palmitoyl-2-oleoyl fosfatidyl-etanolamin (POPE) och 1-palmitoyl- 2-oleoyl fosfatidylglycerol (POPG) Uppvisar en mycket lägre permeabilitet för H + än de som bildas från E. coli polär lipid extrakt 20. Det är viktigt att notera dock att lipidkompositionen av blåsor också kan påverka aktiviteten hos den rekonstituerade protein 13,21,22. Således är det viktigt att exakt bestämma egenskaperna hos de proteinfria vesiklar framställda i varje tillstånd och sedan att utvärdera hur detta påverkar egenskaperna hos den rekonstituerade proteinet.
Generalisering till icke CLC-typ kanaler och transportörer
Den utflödesanalys, som beskrivs här, kan direkt användas för att bestämma de enskilda molekylegenskaper alla Cl - -selektiva kanal eller transportör, och till exempel har använts för att karaktärisera egenskaperna för Ca2 + -activated Cl - kanal TMEM16A 12 . Vi diskuterar nu hur man anpassar utflödes analys för att undersöka egenskaperna hos transportörer eller kanaliels som inte är Cl - selektiv och / eller har enhetliga fraktsatser som skiljer sig påtagligt från ~ 10 3 jon sek -1 av CLC-EC1.
Det enklaste fallet är att proteinet som studeras är anjon-selektiva. I detta fall är den enda nödvändiga anpassningar för att ersätta Ag: AgCl-elektrod med en kommersiellt tillgänglig en av lämplig selektivitet, som gjordes för F - -selektiva Flucs och CLC 16,23,24 eller jag - släppliga kanaler såsom CFTR 15 . Om, å andra sidan, är den rekonstituerade proteinet selektivt för katjoner, en annan än valinomycin jonofor måste användas för att initiera efflux. Med tanke på bristen på validerade Cl - jonoforer ett användbart substitut är ett H + jonofor, såsom Carbonyl cyanid 4- (trifluormetoxi) fenylhydrazon (FCCP). I detta fall är det viktigt att säkerställa att den intravesikulär pH hålls konstant, t ex genom att öka bufferting kapacitet intern lösning. En alternativ strategi är att följa katjon utflöde genom en rekonstruerad kanal eller transportör med hjälp protoner som motjon och övervakning H + transporten med hjälp av en pH-mätare 25 eller en kvotmetrisk pH-känslig sond 26. Men den indirekta karaktären av dessa mätningar gör kvantifiering av transportegenskaper rekonstituerade proteinet svårt. Slutligen elektroder selektiva för ett antal katjoner existerar och är kommersiellt tillgängliga. Ett tredje scenario är att proteinet som studeras är permeabel för både anjoner och katjoner, t.ex. en dåligt selektiv kanal 13 eller en katjon / Cl - cotransporter. I detta fall behöver de ombildade liposomer inte behålla en KCl gradient under lösningen utbytesprocessen (steg 5,4-5,5) så att de förlorar sin salthalt. Därför i detta fall all kinetisk information går förlorad. Emellertid, den fraktion av liposomer innehållande åtminstone en aktiv protein, f 0, kan ändå bestämmas genom att lägga tvättmedel och mäta rest fångade Cl - innehåll (steg 6,8). Detta möjliggör bestämning av molekylmassa av proteinet genom att utföra ett protein titrering och använda ekvation 10.
En annan aspekt att beakta är möjligheten att enhetliga transporthastighet rekonstituerade proteinet är storleksordningar som skiljer sig från den hos CLC-EC1. Till exempel, de flesta transportörer har omsättningshastigheter på 1-10 sek -1, 2-3 tiopotenser lägre än CLC-EC1, medan de flesta kanaler genomföra joner vid 10 6 -10 7 sek -1, 3-4,000 gånger snabbare än CLC -ec1. För långsamma transportörer hastigheten av Cl - läckage från proteinfria liposomer kan bli begränsande, eftersom dess relativa vikt i utflödesprocess ökar när proteinets transporthastigheten minskar. I vår erfarenhet varierar läckaget något mellan förberedelser och är oftast i storleksordningen enfåtal jon sek -1. Därför, när du arbetar med långsamma transportörer är det lämpligt att förbereda proteinfritt liposomer sida vid sida till varje beredning att noggrant mäta läckan motsvarar varje sats av blåsor. Den utflödes analysen har framgångsrikt använts för att fastställa den enhetliga andelen långsamma transportörer med omsättningshastigheter runt 1-10 ion sek -1, till exempel en cyanobakterier CLC 27. Den omvända situationen uppträder när den rekonstituerade proteinet har en hög konduktans, exempelvis en jonkanal. I detta fall utflödes kinetik är för snabbt för att lösas så blandningstiden (~ 1-2 sek) och inneboende svarstid inspelningen elektroden blir hastighetsbegränsande. I detta fall är den kinetiska information förlorad men massan av den aktiva komplexet kan fortfarande bestämmas 24. Det är värt att notera att andra metoder, till exempel plana lipidbiskiktet inspelningar eller patch kläm liposomer är mer lämpade för att studera renade jonkanaler som dessa techniques direkt ge enda molekyl information med hög tidsupplösning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | 610200 | |
| IEC Centra CL2 Benchtop | Thermo Scientific | ||
| Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter | These can be found on Ebay. | ||
| Non-functional pH probe | Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned. | ||
| DI-710 Data Logger | DATAQ instruments | ||
| WinDAQ acquisition software | DATAQ instruments | ||
| Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml | Pierce (Thermo Scientific) | 29922 | |
| KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass | Kimble Chase | 73500-13100 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids Inc. | 610000 | |
| Computer |
References
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14, 673-681 (2006).
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat Protocols. 3, 784-798 (2008).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
- Almo, S. C., Love, J. D. Better and faster: improvements and optimization for mammalian recombinant protein production. Curr Opin Struct Biol. 26, 39-43 (2014).
- Xiao, S., Shiloach, J., Betenbaugh, M. J. Engineering cells to improve protein expression. Curr Opin Struct Biol. 26, 32-38 (2014).
- Accardi, A., Miller, C. Secondary active transport mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. Nature. 427, 803-807 (2004).
- Nguitragool, W., Miller, C. Uncoupling of a CLC Cl-/H+ exchange transporter by polyatomic anions. J. Mol. Biol. 362, 682-690 (2006).
- Walden, M., et al. Uncoupling and turnover in a Cl-/H+ exchange transporter. J. Gen. Physiol. 129, 317-329 (2007).
- Accardi, A., Kolmakova-Partensky, L., Williams, C., Miller, C. Ionic currents mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. J. Gen. Physiol. 123, 109-119 (2004).
- Basilio, D., Noack, K., Picollo, A., Accardi, A. Conformational changes required for H(+)/Cl(-) exchange mediated by a CLC transporter. Nat Struct Mol Biol. 21, 456-463 (2014).
- Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. Journal of Molecular Biology. 387, 1055-1060 (2009).
- Terashima, H., Picollo, A., Accardi, A. Purified TMEM16A is sufficient to form Ca2+ activated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 19354-19359 (2013).
- Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nature Communications. 4, 2367 (2013).
- Picollo, A., Malvezzi, M., Houtman, J. C., Accardi, A. Basis of substrate binding and conservation of selectivity in the CLC family of channels and transporters. Nat Struct Mol Biol. 16, 1294-1301 (2009).
- Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287, 36639-36649 (2012).
- Stockbridge, R. B., et al. Fluoride resistance and transport by riboswitch-controlled CLC antiporters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15289-15294 (2012).
- Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr Biol. 21, 149-153 (2011).
- Nimigean, C. M., Miller, C. Na+ block and permeation in a K+ channel of known structure. J Gen Physiol. 120, 323-335 (2002).
- Picollo, A., Xu, Y., Johner, N., Bernèche, S., Accardi, A. Synergistic substrate binding determines the stoichiometry of transport of a prokaryotic H(+)/Cl(-) exchanger. Nat Struct Mol Biol. 19, 525-531 (2012).
- Tsai, M. F., Fang, Y., Miller, C. Sided functions of an arginine-agmatine antiporter oriented in liposomes. Biochemistry. 51, 1577-1585 (2012).
- Heginbotham, L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Functional reconstitution of a prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 111, 741-749 (1998).
- Lundbaek, J. A., Collingwood, S. A., Ingólfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S. Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes. J R Soc Interface. 7, 373-395 (2010).
- Lim, H. H., Stockbridge, R. B., Miller, C. Fluoride-dependent interruption of the transport cycle of a CLC Cl(-)/H(+) antiporter. Nat Chem Biol. 9, 712-715 (2013).
- Stockbridge, R. B., Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. A family of fluoride-specific ion channels with dual-topology architecture. Elife. 2, e01084 (2013).
- Nimigean, C., Shane, T., Miller, C. A cyclic nucleotide modulated prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 124, 7 (2004).
- Brohawn, S. G., del Mármol,, J,, MacKinnon, R. Crystal Structure of the Human K2P TRAAK, a Lipid- and Mechano-Sensitive K+ Ion Channel. Science. 335, 436-441 (2012).
- Jayaram, H., Robertson, J. L., Wu, F., Williams, C., Miller, C. Structure of a slow CLC Cl-/H+ antiporter from a cyanobacterium. Biochemistry. 50, 788-794 (2011).
