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Chemistry

रासायनिक फिक्सेशन द्वारा एक्स-रे प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए पक्षपाती कोशिकाओं की तैयारी

Published: March 12, 2015 doi: 10.3791/52370
Automatic Translation
1, 2
1X-ray Science Division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory, 2Department of Physics and Astronomy, Northwestern University

Introduction

प्रतिदीप्ति इमेजिंग पहचान और एक नमूने में मौजूद तत्वों की मात्रा दोनों के लिए अनुमति देता है एक्स-रे स्थानिक हल किया जाना है। हादसा एक्स-रे, ब्याज की भारी तत्व की ऊर्जा बाध्यकारी इलेक्ट्रॉन से अधिक होना करने के लिए चयनित एक ऊर्जा का, नाभिक एक करने के भीतरी खोल इलेक्ट्रॉनों के बंधन ऊर्जा से उबरने। इस इलेक्ट्रॉन खोल में एक 'छेद' बनाता है। उच्च-ऊर्जा इलेक्ट्रॉनों इन छेद में नीचे गिर के रूप में, फ्लोरोसेंट एक्स-रे तरंगदैर्ध्य जिसका उन कक्षाओं के ऊर्जा जुदाई पर निर्भर है उत्सर्जित कर रहे हैं। कक्षाओं के ऊर्जा रिक्ति एक दिया तत्व की विशेषता है, एक्स-रे प्रतिदीप्ति उत्सर्जन भी तत्व पर निर्भर विशेषता तरंग दैर्ध्य है। यह मौजूद तत्वों की पहचान की अनुमति देता है कि एक विशेषता तरंग दैर्ध्य में इस उत्सर्जन है। प्रतिदीप्ति तीव्रता का कैलिब्रेशन मौजूद तत्वों के quantitation अनुमति देता है।

एक्स-रे प्रतिदीप्ति microscopवाई (XFM) आंशिक रूप से इस तरह के स्प्रिंग-8 जापान में, यूरोपीय विकिरण सिंक्रोट्रॉन सुविधा फ्रांस में (ESRF), और उन्नत फोटॉन स्रोत (पर उन लोगों के रूप में बहुत प्रतिभाशाली एक्स-रे सिंक्रोटॉन सूत्रों का कहना है, के विकास के लिए तेजी से उपयोग किया हो गया है अमेरिका में 2 ए पी एस)। इन सूत्रों का बहुत ही उच्च तीव्रता एक्स-रे मुस्कराते हुए प्रदान करते हैं। एक ही समय में, इस तरह के क्षेत्र की थाली प्रौद्योगिकी के रूप में एक्स-रे प्रकाशिकी के क्षेत्र में सुधार, बल्कि निकम्मेपन से तीन हालांकि, उप माइक्रोन स्पॉट करने के लिए इन मुस्कराते हुए ध्यान केंद्रित की अनुमति दी। बहुत उच्च तीव्रता मुस्कराते हुए, वर्तमान में उपलब्ध डिटेक्टर तकनीक के साथ मापा जा सकता है कि कोशिकाओं में अंतर्जात धातुओं उत्तेजित करने के लिए पर्याप्त है ध्यान केंद्रित किया जा सकता है कि प्रकाश की भी एक अपेक्षाकृत छोटी राशि, उत्पादन संकेत के साथ। इस प्रकार, सेल में धातुओं के रासायनिक जीवविज्ञान का अध्ययन कर इस तकनीक 4-10 में हाल के घटनाक्रम के कई का उपयोग करता है कि विशेष रूप से एक आवेदन पत्र है।

एप्लिकेशन को, जबकि माना जा करने के लिए कई महत्वपूर्ण कारक हैंXFM झूठ बोल सुसंस्कृत स्तनधारी कोशिकाओं या अन्य जैविक नमूने का मौलिक वितरण और मात्रा का ठहराव जांच करने के लिए। सबसे पहले, नमूना सार्थक होने की माप के लिए आदेश में, दोनों संरचनात्मक रूप और अपनी मौलिक रचना के लिए सम्मान के साथ बरकरार रखा जाना चाहिए। यह एक केंद्रित एक्स-रे किरण की वजह से हो सकता है कि विकिरण क्षति के लिए हार्डी इतना है कि दूसरे, नमूना भी किसी तरह से संरक्षित किया जाना चाहिए। एक नमूना एक बार में इन मानदंडों दोनों को पूरा कर सकते हैं कि एक तरह से तेजी से एक कांच का, अनाकार बर्फ 11,12 में जमे हुए किया जा रहा है। तेजी से ठंड अक्सर ऐसे डुबकी ठंड या उच्च दबाव 13-16 ठंड के रूप में विभिन्न cryopreservation तकनीकों के माध्यम से हासिल की है। यह आम तौर पर cryopreservation संभव के रूप में देशी राज्य के करीब के रूप में जैविक नमूने में समग्र सेलुलर वास्तुकला और रासायनिक रचनाओं को बरकरार रखता है कि स्वीकार किया जाता है। कोशिकाओं और ऊतकों में fixatives की धीमी गति से और चयनात्मक प्रवेश की वजह से दूसरे हाथ पर रासायनिक निर्धारण, w के रूप मेंपक्ष झिल्ली पारगम्यता के रूप में बाद में परिवर्तन, विभिन्न सेलुलर आयनों विशेष रूप से इस तरह के सीएल, सीए और कश्मीर के रूप में प्रसारण आयनों इस प्रकार 17-19 उपअनुकूलित इन तत्वों की जांच प्रतिपादन, leached खो दिया है या दूसरी जगह जाने की अनुमति हो सकती है। विशेष रूप से पक्षपाती स्तनधारी कोशिकाओं के लिए सामान्य रूप में रासायनिक निर्धारण, अधिक क्रायो-निर्धारण के स्पष्ट लाभ के बावजूद, cryopreservation विभिन्न सीमाओं 20-23 है। सबसे स्पष्ट एक नहीं हर अनुसंधान प्रयोगशाला cryopreservation उपकरणों के लिए आसान पहुँच गया है। यहां तक ​​कि सबसे वर्तमान उच्च दबाव फ्रीजर या फ्रीजर ही दूर कोशिकाओं incubated रहे हैं, जहां से हो सकता है जो क्रायो सुविधाओं की एक सबसेट ने महंगा और स्वामित्व उतर रही। cryopreservation के लाभ कोशिकाओं पर रखा यात्रा तनाव के नुकसान के लिए कारोबार किया जा सकता है। Cryopreservation निश्चित रूप से एक्स-रे प्रतिदीप्ति विश्लेषण के लिए नमूने संरक्षित करने के लिए सबसे कठोर तरीका है, जबकि इस प्रकार, यह निश्चित रूप से सभी परिस्थितियों के तहत सभी शोधकर्ताओं के लिए सबसे सुलभ नहीं है;और न ही यह हमेशा जरूरी है - ब्याज की धातुओं कसकर फिक्स बड़े अणुओं के लिए बाध्य है, और नमूना imaged किया जाएगा, जिस पर संकल्प सुखाने के दौरान हो सकता है कि अल्ट्रा microstructure के लिए क्षति से अधिक है कर रहे हैं। निरंतर 24 के प्रति जागरूक, रासायनिक निर्धारण और सुखाने के लिए एक उपयुक्त विकल्प हो सकता है।

एक सफल एक्स-रे प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रयोग में अन्य कारकों उचित विश्लेषण शामिल हैं। एक्स-रे प्रतिदीप्ति इमेजिंग मौलिक स्थानिक संकल्प प्रदान करने के लिए रेखापुंज स्कैनिंग के साथ संयुक्त एक्स-रे प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रोस्कोपी है। एकत्र एक्स-रे प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा उत्सर्जन चोटियों, पृष्ठभूमि, और घटना बीम के लोचदार और स्थिर बिखरने चोटियों ओवरलैपिंग का एक संयोजन होते हैं। इन योगदान के डे-कनवल्शनफ़िल्टर्स, और उत्सर्जन चोटियों की फिटिंग के लिए सक्षम बनाता है कि सॉफ्टवेयर, तो इस क्षेत्र में 25 के लिए एक महत्वपूर्ण विकास किया गया है। इसके अलावा, विकास और वाणिज्यिक जिलेसामग्री की मात्रा के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता रिश्तेदार जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जाना जाता संरचना, की पतली फिल्म मानकों की ribution भी बहुत महत्वपूर्ण हो गया है।

इस प्रोटोकॉल रासायनिक निर्धारण और हवा सुखाने के द्वारा पक्षपाती कोशिकाओं की तैयारी का एक विवरण प्रदान करता है। इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम अक्सर सफलता के लिए एक विशेष फैशन कुंजी में कोमल से rinsing बना रही है, अच्छी तरह से पालन नहीं करते जो सिलिकॉन नाइट्राइड खिड़कियों पर कोशिकाओं की वृद्धि है।

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Protocol

उपकरण, substrates, संस्कृति मीडिया और व्यंजन के 1. तैयारी

  1. सिलिकॉन नाइट्राइड (सी 3 एन 4) खिड़कियों की हैंडलिंग।
    1. दूसरे हाथ से कैप्सूल के दूसरे छोर जबकि घूर्णन, थोड़ा ही खिड़की निचोड़ नहीं करने के लिए इस तरह के रूप में खिड़की से युक्त एक छोर फैलाएंगे द्वारा कैप्सूल खोलें।
    2. रिवर्स की एक जोड़ी की जाँच करें, stereomicroscope के तहत ठीक इत्तला दे दी चिमटी नोक पर कोई चिपकने वाला, अंतराल या झुकता कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए। अन्यथा, Windows चिमटी से टूटी हुई है या बाद के चरणों के दौरान उनमें से उड़ान भरने जा सकता है।
    3. धीरे खिड़की के किनारों से बाहर आने की जरूरत है, जहां कैप्सूल व्यापक बनाने के लिए इतनी के रूप में एक दिशा में दबाव लागू करने के खुले अंत के पास कैप्सूल निचोड़ है, जबकि ध्यान से चिमटी के साथ खिड़की के फ्रेम लोभी द्वारा कैप्सूल से खिड़की निकालें।
  2. विंडो पूर्व धोने (वैकल्पिक)।
    1. धीरे उन्हें सूई से, पूर्व धोने Windows अगर वांछित70% इथेनॉल में 2 मिनट धोने और 100% इथेनॉल में 2 मिनट धोने के द्वारा पीछा 5 सेकंड के लिए आसुत जल में।
  3. Affixing और संस्कृति डिश पर Windows स्टरलाइज़।
    1. Windows प्रत्यय, संस्कृति डिश के तल पर फ्लैट पक्ष के साथ खिड़की सेट, एक साफ कांच स्लाइड पर टेप का एक टुकड़ा रखें। टेप के लंबे पक्ष के नीचे एक चौथाई इंच पट्टी बंद के बारे में काटें। एक साफ धार के साथ ("¾ द्वारा" ⅛ पर) संक्षिप्त ओर से टेप का एक टुकड़ा ले लो।
    2. ग्रिड या खिड़की के किनारे करने के लिए टेप का टुकड़ा लागू करने के लिए चिमटी का प्रयोग करें। सुरक्षित रूप से खिड़की खोलने खुद को कवर के बिना यह पालन करने के लिए पर्याप्त का प्रयोग करें। चिमटी के साथ पालन टेप से छेड़छाड़ संस्कृति डिश के तल पर नीचे खिड़की की स्थापना की। मजबूती से संस्कृति डिश के नीचे करने के लिए टेप पालन करने के लिए चिमटी की नोक का प्रयोग करें।
    3. अन्य किनारे करने के लिए एक और टेप पट्टी लागू करें और मजबूती से चिमटी की नोक के साथ नीचे करने के लिए इस पालन करें।
    4. एक बार सभी खिड़कियां हैंटेप, पराबैंगनी (यूवी) विकिरण के साथ संस्कृति बर्तन में खिड़कियों बाँझ। के बारे में एक घंटे के लिए एक लामिना का प्रवाह हुड में यूवी लैंप के तहत पकवान रखकर यह पूरा।
    5. Windows पाली lysine साथ पूर्व लेपित किया जाए तो (वैकल्पिक), तो खिड़की नसबंदी निम्नलिखित है। कोट तो 10 एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए बाँझ 0.01% पाली एल Lysine समाधान के μl, और साथ खिड़की संस्कृति मीडिया के साथ शेष समाधान बंद कुल्ला।
  4. XFM से पहले अंतिम धोने के लिए बफ़र्स तैयार करें।
    1. एक Tris-ग्लूकोज या piperazine- एन या तो तैयार है, 'एन -bis (ethanesulfonic एसिड) (पाइप) कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना है Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (डी पीबीएस) को परासरणीयता और पीएच समकक्ष के साथ किसी भी धातुओं का पता लगाने के लिए स्वतंत्र बफर -sucrose। कोशिकाओं रासायनिक तय कर रहे हैं के बाद कोशिकाओं कुल्ला करने के लिए इन बफ़र्स में से एक का उपयोग करें।
      1. Tris-ग्लूकोज समाधान (10 मिमी Tris, 260 मिमी ग्लूकोज, 9 मिमी एसिटिक एसिड,) बनाने ग्लूकोज की 1.4 ग्राम, Tris आधार के 36 मिलीग्राम जोड़ने के लिए औरUltrapure पानी की 20 मिलीलीटर एसिटिक एसिड के 16 μl। फिर, ultrapure पानी के साथ 30 मिलीलीटर अंतिम मात्रा समायोजित करें। कोई पीएच समायोजन की जरूरत है। ऊपर से एक सप्ताह के लिए आरटी पर स्टोर।
      2. पाइप-सुक्रोज (20 मिमी पाइप, 200 मिमी सूक्रोज) पाइपों की 0.18 ग्राम और ultrapure पानी की 20 मिलीलीटर sucrose के 2.0 जी जोड़ने और केंद्रित एसिटिक एसिड की छोटी मात्रा के साथ 7.4 पीएच को समायोजित करने के लिए। फिर, ultrapure पानी के साथ 30 मिलीलीटर अंतिम मात्रा समायोजित करें। ऊपर से एक सप्ताह के लिए आरटी पर स्टोर।
        नोट: अंतिम कुल्ला में पीबीएस का उपयोग कर से बचने के लिए कारण पीबीएस में फॉस्फेट, क्लोराइड और पोटेशियम की सांद्रता यह पूरी तरह से हवा सुखाने से पहले नहीं हटाया जाता है तो यह XFM के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं कि इतनी अधिक हैं कि है।
  5. सेल चढ़ाना के लिए बफ़र्स तैयार करें।
    1. तैयार है या इस तरह के RPMI मध्यम 1640 के रूप में सभी मीडिया, बाहर ले जाना, 1x trypsin-EDTA समाधान, डी पीबीएस, और सामान्य रूप से पक्षपाती कोशिकाओं ओ passaging के लिए किया जा सकता है के रूप में विशेष रूप से पक्षपाती सेल लाइन के लिए जरूरत के रूप में किसी भी अन्य अभिकर्मकोंएफ ब्याज, और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए उन्हें गर्म है।

प्रकोष्ठों के 2. चढ़ाना

  1. लामिना का प्रवाह हुड में खिड़कियां, युक्त निष्फल संस्कृति डिश के लिए, धीरे से एक कोण पर झुका इसके साथ संस्कृति डिश के पक्ष के साथ, मीडिया (एक 100 मिमी संस्कृति डिश के लिए 10 एमएल) जोड़ने। अनावश्यक सतह तनाव पैदा करने या सिलिकॉन नाइट्राइड खिड़कियों की सतह पर सीधे मीडिया को छोड़ने से बचें। मीडिया में जोड़ा जाता है, धीरे-धीरे कोट करने के लिए झुकाव कोण मीडिया के साथ ग्रिड और खिड़की से छुटकारा।
  2. Trypsinizing या सेल लाइन passaging के लिए हमेशा की तरह प्लेटों के बंद कोशिकाओं scraping, उचित ब्याज की पक्षपाती सेल लाइन तैयार करें। ताजा थाली करने के लिए कोशिकाओं को लागू करने से पहले आवश्यक किसी भी सेल गिनती, या अन्य तैयारी प्रदर्शन करते हैं।
  3. आम तौर पर 24-72 घंटा के भीतर 50% -70% संगम तक पहुँचने की जरूरत है कि एक सेल घनत्व में खिड़कियों के साथ संस्कृति डिश के लिए कोशिकाओं जोड़ें, और 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। वांछित सेल घनत्व तक (आमतौर पर 50% -70% संगम) तक पहुँच जाता है, एक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, कभी-कभी 'कोशिकाओं की वृद्धि को ध्यान से देखें।

प्रकोष्ठों के 3. फिक्सेशन

  1. एक खरीदे शेयर (जैसे 25% paraformaldehyde) गिराए और (नमूना करने के लिए अतिरिक्त सोडियम जोड़ने से बचने के लिए) एसिटिक एसिड के साथ 7.4 पीएच को समायोजित करके डी पीबीएस में ताजा 4% paraformaldehyde के तैयार करें।
  2. कोशिकाओं वांछित के रूप में विकसित किया गया है, और (जैसे Hoescht के रूप में) किसी भी महत्वपूर्ण दाग आवेदन किया है और imaged किया गया है, एक हाथ से एक 45 डिग्री के कोण पर पकवान झुकाव, कोमल आकांक्षा से मीडिया को दूर, और एक दूसरे के साथ हाथ पिपेट द्वारा aspirating ।
    नोट: इसके बजाय pipetting के खर्च की मीडिया के एक विकल्प है, खिड़की लेने दो बार डी पीबीएस के साथ microcentrifuge ट्यूबों में खिड़की डुबकी और फिर पीबीएस धोने की 2 बार द्वारा पीछा 20 मिनट के लिए लगानेवाला समाधान के साथ एक नई संस्कृति पोत में यह जगह करने के लिए है अवशिष्ट fixatives दूर करने के लिए। इस चुना है, निर्देशिका जानाectly 3.5 कदम करने के लिए।
  3. डी पीबीएस के साथ धीरे पकवान कुल्ला और पकवान के पक्ष की ओर, एक 45 डिग्री के कोण पर pipetting के पकवान धारण करते हुए धीरे ताजा 4% पीएफए ​​/ पीबीएस जोड़ने, और धीरे धीरे अनुमति देने के लिए झुकाव कोण को आराम से तुरंत हटा तरल की जगह लगानेवाला समाधान खिड़कियों को कवर करने के लिए। आरटी पर 20 मिनट के लिए लगानेवाला के साथ कवर कोशिकाओं रखें।
  4. थोड़ा पकवान झुकाव और हाथ से aspirating, ऊपर के रूप में फिर से, कोमल आकांक्षा से तरल निकालें।
  5. धीरे, पाइप / sucrose के समाधान के कुछ जोड़ने चरण 3.3 में वर्णित झुकने और pipetting विधि का उपयोग कर हटाया तरल बदलें।
  6. दोहराएँ 3.4 और 3.5 कदम।
  7. सुखाने के लिए सामग्री तैयार करते हैं।
    1. ऐसे Kimwipes के रूप में एक प्रकार का वृक्ष मुक्त तौलिए को इकट्ठा, और यह बहुत जल्दी और आसानी से काम है तो बॉक्स में से एक को बाहर खींच।
    2. खिड़की सुखाने के लिए स्थापित करने के लिए एक साफ, गैर स्तर जगह तैयार करें। लकीरें इतना है जो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में इस्तेमाल किया तरह की एक रबर ग्रिड चटाई बाहर सेटयह सूख जाता है, जबकि खिड़की एक छोर पर खड़ा किया जा सकता है। इस रूप में यह dries सुखाने की सतह के लिए अटक रही से खिड़की रखने के लिए, और नमूने के किनारे करने के लिए किसी भी शेष बफर पलायन होगा।
  8. ध्यान से तरल के बाहर खिड़की को धारण करने के लिए खिड़की से जुड़े टेप tweeze। रिवर्स चिमटी के साथ उन्हें उठा तो उन्हें नाव को पाने के लिए पाइप / सुक्रोज की एक छोटी राशि लागू करने और टेप के बंद आया है कि विंडोज़ निकालते हैं।
  9. ध्यान से अच्छी तरह से और (खिड़की खुद को छू के बिना) एक Kimwipe के साथ खिड़की के किनारे से किसी भी अतिरिक्त पाइप / सूक्रोज लीपापोती। इसके अलावा एक Kimwipe का एक गोल गुना का उपयोग कर वापस दांतेदार क्षेत्र लीपापोती।
    नोट: लक्ष्य के लिए संभव के रूप में खिड़की की सतह पर लवण या buffers के रूप में छोटे क्रिस्टलीकरण के लिए है।
  10. ग्रिड चटाई पर विंडो रखें। खिड़की ग्रिड चटाई पर फ्लैट झूठ नहीं बोल रही है कि सुनिश्चित करें, लेकिन (ग्रिड चटाई की लकीरें का उपयोग) और ग्रिड के रूप में छोटे छू एक किनारे पर खड़ाके रूप में संभव चटाई। खिड़की शुष्क करते हैं।

4. नमूना बढ़ते और इमेजिंग

  1. नमूना सूख गया है एक बार, एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर खिड़कियों पर कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि करें। एक सिंक्रोटॉन के लिए परिवहन के लिए नमूने तैयार करने से पहले, इस सत्यापन कार्य करें।
  2. अपने प्रयोग की मेजबानी सिंक्रोटॉन beamline के लिए परिवहन के लिए Windows पैकेज। फिर धीरे, एक गिलास स्लाइड करने के लिए दोनों पक्षों पर टेप के साथ Windows प्रत्यय एक प्लास्टिक पेट्री डिश के नीचे करने के लिए टेप के साथ गिलास स्लाइड प्रत्यय। पेट्री डिश बंद टेप।
    नोट: इस से पहले बात करने के लिए, इन चरणों का किसी भी ठेठ प्रयोगशाला में किया जा सकता है। निम्नलिखित चरणों का सबसे अच्छा एक सिंक्रोटॉन beamline पर किया जाएगा।
  3. चिमटी के साथ धीरे खिड़की से टेप निकालें। सिंक्रोट्रॉन में beamline सहयोगियों द्वारा प्रदान की जाने वाली एक एल्यूमीनियम धारक करने के लिए Windows सुरक्षित करने के लिए, खिड़की के किनारे के साथ एक पतली भी कोटिंग में, नेल पॉलिश का उपयोग करें।
  4. में एल्यूमीनियम धारक डालेंएक विज्ञान सम्बन्धी माउंट, और फिर एक्स-रे सूक्ष्मदर्शी में स्थिति में यह जगह। Beamline पर नमूना कक्ष के अंदर, मोटर चालित चरणों को जोड़ने एक वर्ग पर नमूना माउंट।
  5. नमूना एक्स-रे सूक्ष्मदर्शी यंत्र के क्षेत्र (सीसा-भरी दीवारों से बना एक हच), सेटअप स्कैन बाहर निकलने के बाद। एक वीडियो पार बाल और से लैस एक कैमरे का उपयोग नमूना पर एक्स-रे किरण की स्थिति को देखते हुए, स्कैन करने के लिए नमूना के उपयुक्त क्षेत्र चुनते हैं, beamline-विशेष सॉफ्टवेयर का उपयोग पूर्व गठबंधन एक बहाव scintillator कैमरे के साथ।
  6. ब्याज की छोटी से छोटी सुविधा के आकार के एक अनुमान के आधार पर नमूने के लिए उपयुक्त संकल्प, चुनें। एकल स्तनधारी कोशिकाओं इमेजिंग के लिए (~ आकार में 20-40 माइक्रोन), 0.25-0.5 माइक्रोन के एक संकल्प का उपयोग करें। ऊतकों के क्षेत्रों इमेजिंग, और एक दूसरे से सेल परतों भेद के लिए, 2-20 माइक्रोन के एक संकल्प का उपयोग करें।
  7. मुलाकात की मात्रा के एक अनुमान के आधार पर नमूने के लिए उपयुक्त समय ध्यान केन्द्रित करना, चुनेंब्याज वर्तमान की अल। धातुओं के उच्च मात्रा में मौजूद हैं, अगर एक त्वरित अवलोकन स्कैन के लिए, या, पिक्सेल प्रति 30-300 मिसे का ध्यान केन्द्रित करना टाइम्स के साथ उड़ स्कैन का उपयोग करें। कम सामग्री मौजूद है, तो या कम रिश्तेदार बहुतायत से धातुओं को मापने पिक्सेल प्रति 1-2 सेकंड के बसना समय के साथ कदम स्कैन का उपयोग करने के लिए।
  8. Beamline विशेष सॉफ्टवेयर में स्कैन कार्यक्रम। एक रेखापुंज स्कैन छवि मोल। प्रत्येक तत्व के लिए विशेषता ऊर्जा चोटियों की पहचान करेगा कि सॉफ्टवेयर के साथ डेटा का विश्लेषण करने के लिए beamline सहयोगियों के साथ मिलकर काम करते हैं।

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Representative Results

जैविक नमूने के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए एक्स-रे प्रतिदीप्ति इमेजिंग की क्षमता इन नमूनों वे प्रयोग के समय के पैमाने पर विकिरण क्षति को मजबूत कर रहे हैं कि इस तरह से तैयार किया जा रहा है पर प्रासंगिक है, और अभी तक अपने रासायनिक और ढांचागत सुविधाओं में अच्छी तरह से कर रहे हैं संरक्षित। नियतन सेल के इन पहलुओं (चित्रा 1) संरक्षित यह दर्शाता है कि - ऊपर वर्णित के रूप में तैयार और imaged किया गया है कि एक नमूने के परिणाम को देखने में, यह मौजूद तत्वों में भिन्नता है कि वहाँ देखने के लिए संभव है।

इसके विपरीत, एक नमूना पर बजाय तलाश में इस प्रक्रिया को अच्छी तरह से जाना नहीं था, और बफर सुखाने के दौरान उपस्थित रहता है, जहां मौजूद अणुओं से व्यापक क्रिस्टल के गठन की कोशिकाओं के लिए संरचनात्मक क्षति बनाता है और यह भी (एक्स-रे प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा के संग्रह के साथ हस्तक्षेप चित्र 2)।

इन छवियों को प्रति पिक्सेल फिटिंग द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं छवि में प्रत्येक बिंदु पर एक्स-रे प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम की। यह प्रत्येक पिक्सेल पर एकत्र प्रत्येक स्पेक्ट्रम, व्यक्तिगत रूप से विश्लेषण किया गया है कि इसका मतलब है। सज्जित डेटा से उत्पन्न इन छवियों में पैनल को देखने, छवि में प्रत्येक बिंदु को सौंपा मूल्य एक दिया तत्व की विशेषता उत्सर्जन के लिए एक गाऊसी के एकीकृत योग है (उदाहरण के लिए, लौह) सबसे अच्छा के रूप में एक्स-रे प्रतिदीप्ति फिट बैठता है स्पेक्ट्रम उस बिंदु पर एकत्र की। उदाहरण के लिए, छवि में एक एकल पिक्सेल, लोहे के लिए विशेषता उत्सर्जन ऊर्जा पर एक गाऊसी वक्र के तहत क्षेत्र का योग है, जो लोहे के लिए एक मूल्य (संख्या), है कि उस बिंदु के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के लिए फिट बैठता है और मॉडलों डेटा नमूना पर। डेटा उच्च और छवि के भीतर विशिष्ट मूल्यों के लिए (प्रत्येक छवि के तल पर) रंग-तालिका के कम-सिरों असाइन कि प्रत्येक छवि के ऊपर दहलीज मूल्यों (अधिकतम और न्यूनतम) के साथ प्रदर्शित किया जाता है।

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चित्रा एक मानव एसएच SY5Y सेल 1. एक्स-रे प्रतिदीप्ति छवि। इस छवि में प्रत्येक पैनल में एक ही कोशिकाओं के बारे में विभिन्न जानकारी प्रदर्शित करता है। पहली पैनल, लेबल डीआईसी, कोशिकाओं की ऑप्टिकल अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोग्राफ है। सही करने के लिए छोड़ दिया निम्नलिखित पैनलों, फास्फोरस (पी), सल्फर (एस), लौह (Fe), और सेल के क्षेत्र पर उनके वितरण दिखा ही कोशिकाओं की जिंक (Zn) छवियों, कर रहे हैं। दिखाया पैमाने बार 20 माइक्रोन है। आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
एक चूहा B103 सेल चित्रा 2. एक्स-रे प्रतिदीप्ति छवि, buffers की गरीब या अपर्याप्त हटाने के साथ तैयार किया। दो कोशिकाओं फास्फोरस (पी) के पैनल में दिखाई दे रहे हैं,और लोहा (Fe) और जिंक (Zn) पैनल में थोड़ा दिखाई दे रहे हैं। हालांकि, सघन बफर की उपस्थिति, छवि के केन्द्र के माध्यम से particulates से एक धब्बा के रूप में दिखाई दे, जानकारी का सबसे obscures। दिखाया पैमाने बार 20 माइक्रोन है। आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एक्स-रे प्रतिदीप्ति इमेजिंग भूविज्ञान, पदार्थ विज्ञान, और रासायनिक जीवविज्ञान 26-34 सहित कई क्षेत्रों में उपयोगी है। सिंक्रोटॉन एक्स-रे के क्षेत्र में अग्रिम, और उनके ध्यान केंद्रित, बहुत उच्च तीव्रता मुस्कराते हुए उत्पादन किया है। फोकस्ड एक्स-रे वर्तमान में उपलब्ध सिलिकॉन बहाव डिटेक्टर तकनीक के साथ मापा जा सकता है कि संकेत के उत्पादन, अब मौजूद कोशिकाओं में अंतर्जात धातुओं उत्तेजित करने के लिए पर्याप्त मुस्कराते हुए। और सेल में धातुओं के रासायनिक जीवविज्ञान का अध्ययन कर इस क्षेत्र में हाल के घटनाक्रम के कई का उपयोग करता है कि विशेष रूप से एक आवेदन पत्र है।

वे हाइड्रेटेड कर रहे हैं, क्योंकि अभी तक, एक्स-रे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग जैविक सामग्री के अध्ययन में यह भी अन्य सामग्री के सापेक्ष विशेष चुनौतियों प्रस्तुत करता है। विकिरण क्षति को रोकने के लिए, आदर्श नमूने माप के दौरान कांच का बर्फ में जमे हुए किया जाएगा। हालांकि, रासायनिक निर्धारण और हवा सुखाने नौसिखिए को और अधिक सुलभ हैं, और धातु यदि उपयुक्त हो सकता हैब्याज की inertly फिक्स बड़े अणुओं के लिए बाध्य है, और नमूना imaged किया जाएगा, जिस पर संकल्प सुखाने के दौरान हो सकता है कि अल्ट्रा microstructure के लिए क्षति से अधिक है कर रहे हैं।

पक्षपाती सेल XFM अध्ययन के लिए substrates के विचार में, एक आदर्श सब्सट्रेट निम्न बुनियादी आवश्यकताओं को पूरा करने की जरूरत है: 1) सामान्य प्रफलन और प्ररूपी सेल के विकास बारी के बिना मजबूत सेल के विकास का समर्थन है, 2) तत्वों के उन लोगों के साथ ओवरलैप है कि एक्स-रे प्रतिदीप्ति नहीं होना चाहिए ब्याज की, 3) XFM से पहले प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत सेल के विकास के मूल्यांकन के लिए ऑप्टिकली पारदर्शी हो, और 4) संवर्धन और बाद के निर्धारण के दौरान किसी भी भौतिक और रासायनिक हेरफेर का सामना करने में सक्षम हो। ऐतिहासिक, लेपित सोने संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी formvar पतली पॉली कार्बोनेट foils / फिल्म्स 35-37, (मंदिर) से लेकर विभिन्न substrates, 38-42 और सिलिकॉन नाइट्राइड Windows 5,17,43-46 ग्रिड, स्तनधारी सेल विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैs और एक्स-रे प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता है। XFM, सिलिकॉन नाइट्राइड झिल्ली द्वारा पक्षपाती स्तनधारी कोशिकाओं इमेजिंग के लिए मौजूदा और संभावित substrates के बीच तुलना में (सी 3 एन 4) खिड़कियों की वजह से उनके कम प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि और अपेक्षाकृत सरल मौलिक रचना 4-6,47,48 करने के लिए सबसे उपयुक्त हैं। इसके अलावा सी 3 एन में चार खिड़कियों मजबूत सेल लगाव और प्रसार का समर्थन है। ऐसे मंदिर ग्रिड, सी 3 एन के रूप में अन्य आमतौर पर इस्तेमाल किया substrates के मुकाबले चार खिड़कियां भी इन खिड़कियों एक्स-रे टोमोग्राफी के लिए उपयोग किया जाता है जब एक विशेष लाभ होता है, जो एक बहुत बड़ा निर्बाध इमेजिंग क्षेत्र है।

सी 3 एन 4 विंडोज विक्रेताओं की एक सीमित संख्या से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। सिलिकॉन नाइट्राइड खिड़कियों के साथ काम करना एक अधिग्रहीत कौशल है। Windows बहुत ही कमजोर हैं, और उनमें से निपटने जबकि उन्हें चकनाचूर हो सकता है, या उन्हें ड्रॉप करने के लिए कि किसी भी घुमा बलों का निर्माण नहीं करने के लिए महान देखभाल की आवश्यकता होती है। Handlरिवर्स चिमटी का उपयोग किनारों से उन्हें आईएनजी एक लोकप्रिय तरीका है। सबसे विंडोज 30 एनएम से 500 एनएम और 5 एक्स 5 मिमी के लिए 1 एक्स 1 मिमी से एक चौड़ाई को लेकर मोटाई है। जनरल, मोटा झिल्ली में, और अधिक मजबूत है कि वे तनाव से निपटने के सभी प्रकार के लिए कर रहे हैं। हालांकि, वृद्धि की मोटाई और कम ऑप्टिकल पारदर्शिता के साथ, वे नमूना से पृष्ठभूमि उत्सर्जन में वृद्धि होगी। 200 एनएम मोटी झिल्ली काफी आदर्श होते हैं। वे माप पर न्यूनतम प्रभाव पड़ता है, अभी तक काफी मजबूत ज्यादा टूटना बिना संभाला जा रहे हैं।

कई प्रकार की कोशिकाओं, शुरू में देते हैं और मजबूती के साथ बाँझ सी 3 एन 4 खिड़कियों पर विकसित कर सकते हैं परीक्षण किया हालांकि सिलिकॉन नाइट्राइड खिड़कियों पर विकसित कोशिकाओं सामान्य और अधिक आसानी से पारंपरिक सेल संस्कृति प्लेटों पर कोशिकाओं की तुलना में उत्तेजित में हैं। वे आसानी से एकत्रित, अलग या यहां तक ​​कि दिनचर्या मीडिया परिवर्तन के दौरान गोल हो जाते हैं। हम पूर्व धोया Windows अक्सर अधिक हाइड्रोफिलिक बन पाया; कोशिकाओं बेहतर देते हैं और कम चान थासीई एक साथ एकत्र करने के लिए। प्रोटोकॉल में वर्णित चरणों से ऊपर खिड़की पर कोशिकाओं रखने के लिए एक कोमल धोने दृष्टिकोण चित्रित करना। लिया जा सकता है कि कुछ अन्य कदम, बस के रूप में एक ताकत कोट एक coverslip पाली lysine, या laminin के साथ विंडोज कोटिंग शामिल हैं।

एक दिया प्रयोग की सफलता या विफलता हो सकता है कि इस पद्धति का एक अन्य पहलू के नमूनों का आंदोलन है। प्लास्टिक संस्कृति जहाजों पर कोशिकाओं के विकास को देख में, pipetting और प्लेट परिवहन से उत्पन्न आंदोलन के सामान्य श्रेणी में ज्यादा नुकसान का कारण प्रतीत नहीं होता है। हालांकि, सिलिकॉन नाइट्राइड खिड़कियों पर विकसित कोशिकाओं के लिए, मीडिया परिवर्तन और प्लेट परिवहन के दौरान अतिरिक्त देखभाल की जरूरत है। ऐसे माउस fibroblast कोशिकाओं एनआईएच / 3T3 के रूप में कुछ आसानी से उत्तेजित कोशिकाओं के लिए, Windows युक्त संस्कृति प्लेटों ध्यान से संभाला जाना चाहिए। वे सावधानी इनक्यूबेटर से बाहर ले जाया गया और धीरे खुर्दबीन मंच या कैबिनेट की सतह पर स्थापित किया जाना है। जरूरी नहीं कि हर छोटी Physical सदमे कोशिकाओं परेशान नहीं करेगा, लेकिन सेल टुकड़ी के जोखिम को अतिरिक्त देखभाल के बिना बढ़ जाती है। इसके अलावा, भ्रूण गोजातीय सीरम और सिलिकॉन नाइट्राइड खिड़कियों के विभिन्न बैचों खिड़की पर कोशिकाओं की कुर्की पर कुछ प्रभाव पड़ सकता है। कुछ सीरम के स्रोतों या खिड़कियों के बैच इसी तरह देखभाल से बहुत ज्यादा अशांति देखे बिना, यानी, के साथ काम करना आसान लग रहे हैं। तो, ब्याज की सेल लाइन के लिए कुछ परीक्षण और त्रुटि की सलाह दी जा सकती है।

एक्स-रे प्रतिदीप्ति microprobes के लिए क्रायोजेनिक चरणों, के रूप में अच्छी तरह से जमे हुए हाइड्रेटेड जैविक नमूने की तैयारी में नए अनुसंधान में विकास के साथ, यह भविष्य में नमूना तैयार करने में बहुत अधिक तेजी से हाइड्रेटेड नमूनों जमे हुए शामिल होंगे संभावना है। सिलिकॉन नाइट्राइड खिड़कियों के साथ काम कर रहा है, और कोशिका आसंजन बनाए रखने में ही चुनौतियों में से कई के रूप में अच्छी तरह से वहाँ मौजूद हैं। फिर भी, इस तकनीक के माहिर एक, cryopreservation प्रयास करने से पहले कौशल विकसित करने में शुरू करने के लिए एक बहुत अच्छी जगह बनी हुई हैएन डी कई बार, छवि के नमूने के लिए एक पूरी तरह से उपयुक्त तरीका है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon nitride windows Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom SiRN-5.0-200-2.0-200. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm. Thickness: 200 nm. Frame size: 5 mm x 5 mm. Frame thickness: 200 µm. Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA.
Reverse tweezers Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 78520-5X EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers
Rubber grid mat Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 71170 Round Grid Mat
Acetic acid Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 338826 trace metals grade concentrated acetic acid
PIPES buffer Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 P6757 solid PIPES buffer
Formaldehyde stock solution Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 RT 17113 10 x 10 ml ampules of 20% aqueous paraformaldehyde

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Finney, L. A., Jin, Q. Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation. J. Vis. Exp. (97), e52370, doi:10.3791/52370 (2015).

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