Vorbereitung adhärenter Zellen für die Röntgenfluoreszenzbildgebung durch chemische Fixierung

Summary

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Abstract

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Introduction

Röntgen-Fluoreszenz-Bildgebung ermöglicht sowohl für die Identität und Menge der in einer Probe vorhandenen Elemente räumlich aufgelöst werden. Einfallenden Röntgenstrahlen, einer größer gewählt als die Elektronenbindungsenergie der schwerste Element von Interesse zu sein, Energie, die Überwindung der Bindungsenergie von Elektronen der inneren Schale an den Kern ^1. Dadurch entsteht ein "Loch" in der Elektronenhülle. Als höherenergetischen Elektronen fallen in diese Löcher werden die Röntgenfluoreszenzstrahlung emittiert, dessen Wellenlänge abhängig von der Energie Trennung dieser Orbitale. Da der Energieabstand der Orbitale ist charakteristisch für ein gegebenes Element weist die Röntgenfluoreszenzemission ebenfalls charakteristischen Wellenlängen, abhängig von dem Element. Es ist diese Emission bei einer charakteristischen Wellenlänge, welche die Identifikation der vorhandenen Elemente ermöglicht. Die Kalibrierung der Fluoreszenzintensität ermöglicht die Quantifizierung der vorhandenen Elemente.

Röntgenfluoreszenz microscopy (XFM) zunehmend genutzt, zum Teil auf die Entwicklung von sehr brillanten Röntgensynchrotronquellen, wie sie bei Spring-8 in Japan, der Europäischen Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Frankreich und der Advanced Photon Source ( APS) in den USA ^2. Diese Quellen liefern eine sehr hohe Intensität von Röntgenstrahlen. Zur gleichen Zeit, Verbesserung der Röntgenoptik, wie Zonenplatte Technologie, erlaubt die Fokussierung dieser Strahlen auf Sub-Mikrometer-Spots, wenn auch eher ineffizient ^3. Mit sehr hoher Intensität Strahlen, auch eine relativ kleine Menge an Licht, das konzentriert sein kann, ist ausreichend, um die endogenen Metallen in Zellen anzuregen, wodurch Signal, das mit den derzeit verfügbaren Detektortechnologie gemessen werden kann. So studieren die chemische Biologie der Metalle in der Zelle ist eine Anwendung insbesondere die Verwendung von vielen der jüngsten Entwicklungen in dieser Technik ^4-10 macht.

Es gibt viele wichtige Faktoren, die in Betracht gezogen werden, während AppLiegen XFM, um die Elementverteilung und Quantifizierung von kultivierten Säugerzellen oder anderen biologischen Proben zu untersuchen. Erstens muss die Probe intakt gehalten werden soll, sowohl strukturell als auch in bezug auf die elementare Zusammensetzung, damit die Messung aussagekräftig zu sein. Zweitens muss die Probe auch in irgendeiner Weise gespeichert, dass sie hart zur Strahlungsschäden, die durch einen fokussierten Röntgenstrahl verursacht werden kann, ist. Eine Möglichkeit, dass eine Probe nur eines dieser Kriterien auf einmal zu erfüllen ist es, sich schnell zu einem glasartigen, amorphen Eis ^11,12 eingefroren werden. Schockgefrieren wird oft durch verschiedene Kryokonservierung Techniken wie Tauch Einfrieren oder Hochdruckgefrier ^13-16 erreicht. Es ist allgemein anerkannt, dass die Kryokonservierung bewahrt Gesamtzellarchitektur und chemischen Zusammensetzungen in biologischen Proben so nahe nativen Zustand möglich. Chemische Fixierung, auf der anderen Seite, aufgrund der langsamen und selektive Durchdringung von Fixiermittel in Zellen und Geweben als well als nachträgliche Veränderungen in der Membrandurchlässigkeit, können verschiedene zelluläre Ionen besonders die diffundierbare Ionen wie Cl, Ca und K, um ausgelaugt werden, verloren oder verlegt werden, so machen Untersuchung dieser Elemente suboptimal ^17-19 ermöglichen. Trotz der klaren Vorteile der Kryo-Fixierung über chemische Fixierung im Allgemeinen, für adhärente Säugetierzellen hat insbesondere die Kryokonservierung verschiedenen Einschränkungen ^20-23. Der offensichtlichste ist, dass nicht jede Forschungslabor hat leichten Zugang zu Kryokonservierung Instrumente. Für aktuelle Hochdruckgefriergeräte oder sogar stürzen Gefriergeräte sind teuer und gehören, nur eine Teilmenge der Kryo Einrichtungen, die weit von dem Zellen inkubiert werden kann. Der Vorteil der Kryokonservierung könnte zum Nachteil des Reise Stress auf die Zellen gegeben gehandelt werden. Während also die Kryokonservierung ist sicherlich die härteste Weg, um Proben für die Röntgenfluoreszenzanalyse zu erhalten, ist es sicherlich nicht die zugänglich für alle Forscher, unter allen Umständen;es ist auch nicht immer erforderlich – wenn die Metalle von Interesse sind eng fixierbar Makromoleküle gebunden sind, und die Auflösung, mit der die Probe abgebildet wird größer als die Beschädigung der ultraMikroStruktur, die während der Trocknung auftreten könnte, ist. Eingedenk der Vorbehalte ²⁴ kann chemische Fixierung und Trocknung eine geeignete Wahl sein.

Andere Faktoren, die zu einer erfolgreichen Röntgenfluoreszenz-Bildgebung Test einbezogen korrekte Analyse. Röntgen-Fluoreszenz-Bildgebung ist grundsätzlich Röntgenfluoreszenzemissionsspektroskopie kombiniert mit Rasterabtastformat die räumliche Auflösung zu liefern. Die gesammelten Röntgenfluoreszenzemissionsspektren enthalten eine Kombination von überlappenden Emissionsspitzen, den Hintergrund und die elastischen und inelastischen Streuungspeaks des einfallenden Strahls. Software, die die Entfaltungs dieser Beiträge und der Anpassung der Emissionsspitzen ermöglicht, hat zu diesem Bereich ²⁵ schon eine kritische Entwicklung. Auch die Entwicklung und kommerzielle distribution Dünnschicht Standards bekannter Zusammensetzung verwendet, um die Fluoreszenzintensität relativ zur Materialmenge zu kalibrieren, wurde auch sehr wichtig.

Dieses Protokoll stellt eine Beschreibung der Herstellung der haftenden Zellen durch chemische Fixierung und Lufttrocknung. Ein wichtiger Schritt in diesem Prozess ist das Wachstum der Zellen auf den Siliziumnitrid-Fenster, die oft nicht gut an, so dass sanfte Spülung in einer bestimmten Art und Weise der Schlüssel zum Erfolg.

Protocol

1. Herstellung des Instruments, Substrate, Kultur, Medien und Gerichte Handhabung von Siliciumnitrid (Si 3 N 4) Fenster. Öffnen der Kapsel leicht durch Zusammendrücken eines Endes, die das Fenster in solcher Weise, dass das Fenster sich nicht einklemmen, während sich das andere Ende der Kapsel mit der anderen Hand. Überprüfen Sie ein Paar umgekehrt zu spitzen Pinzette unter Stereomikroskop stellen Sie sicher, gibt es keine Haft, Lücken oder Kurven an der Spitze. …

Representative Results

Die Fähigkeit der Röntgenfluoreszenzabbildung, um Informationen über biologische Proben bereitzustellen ist abhängig wobei diese Proben in einer Weise, dass sie robust gegenüber Strahlungsschäden auf der Zeitskala des Experiments sind, hergestellt, und doch ihre chemischen und strukturellen Merkmale gut erhalten. Bei der Betrachtung des Ergebnisses einer Probe, die hergestellt wurde wie oben beschrieben und abgebildet wird, ist es möglich zu sehen, dass es eine Variation in der vorhandenen Elemente – was anzeigt,…

Discussion

Röntgenfluoreszenz-Bildgebung ist in vielen Bereichen, einschließlich der Geowissenschaften, Materialwissenschaften und der chemischen Biologie ^26-34 nützlich. Fortschritte in der Synchrotron-Röntgenstrahlen und ihre Fokussierung haben sehr hoher Intensität Strahlen erzeugt. Fokussierten Röntgenstrahlen ausreichend ist, um die endogenen Metallen in Zellen existieren nun erregt, wodurch Signal, das mit den derzeit verfügbaren Silizium-Driftdetektortechnologie gemessen werden kann. Und das Studium der ch…

Materials

silicon nitride windows	Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom	No part numbers available. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm.  Thickness 500 nm.  Frame size: 5 mm x 5 mm.  Frame thickness: 200 µm	Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc.West Chester, PA
reverse tweezers	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	78520-5X	EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers
rubber grid mat	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	71170	Round Grid Mat
acetic acid	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	338826	trace metals grade concentrated acetic acid
PIPES buffer	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	P6757	solid PIPES buffer
formaldehyde stock solution	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	RT 17113	10 x 10mL ampules of 20% aqueous paraformaldehyde