Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.
X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.
प्रतिदीप्ति इमेजिंग पहचान और एक नमूने में मौजूद तत्वों की मात्रा दोनों के लिए अनुमति देता है एक्स-रे स्थानिक हल किया जाना है। हादसा एक्स-रे, ब्याज की भारी तत्व की ऊर्जा बाध्यकारी इलेक्ट्रॉन से अधिक होना करने के लिए चयनित एक ऊर्जा का, नाभिक एक करने के भीतरी खोल इलेक्ट्रॉनों के बंधन ऊर्जा से उबरने। इस इलेक्ट्रॉन खोल में एक 'छेद' बनाता है। उच्च-ऊर्जा इलेक्ट्रॉनों इन छेद में नीचे गिर के रूप में, फ्लोरोसेंट एक्स-रे तरंगदैर्ध्य जिसका उन कक्षाओं के ऊर्जा जुदाई पर निर्भर है उत्सर्जित कर रहे हैं। कक्षाओं के ऊर्जा रिक्ति एक दिया तत्व की विशेषता है, एक्स-रे प्रतिदीप्ति उत्सर्जन भी तत्व पर निर्भर विशेषता तरंग दैर्ध्य है। यह मौजूद तत्वों की पहचान की अनुमति देता है कि एक विशेषता तरंग दैर्ध्य में इस उत्सर्जन है। प्रतिदीप्ति तीव्रता का कैलिब्रेशन मौजूद तत्वों के quantitation अनुमति देता है।
एक्स-रे प्रतिदीप्ति microscopवाई (XFM) आंशिक रूप से इस तरह के स्प्रिंग-8 जापान में, यूरोपीय विकिरण सिंक्रोट्रॉन सुविधा फ्रांस में (ESRF), और उन्नत फोटॉन स्रोत (पर उन लोगों के रूप में बहुत प्रतिभाशाली एक्स-रे सिंक्रोटॉन सूत्रों का कहना है, के विकास के लिए तेजी से उपयोग किया हो गया है अमेरिका में 2 ए पी एस)। इन सूत्रों का बहुत ही उच्च तीव्रता एक्स-रे मुस्कराते हुए प्रदान करते हैं। एक ही समय में, इस तरह के क्षेत्र की थाली प्रौद्योगिकी के रूप में एक्स-रे प्रकाशिकी के क्षेत्र में सुधार, बल्कि निकम्मेपन से तीन हालांकि, उप माइक्रोन स्पॉट करने के लिए इन मुस्कराते हुए ध्यान केंद्रित की अनुमति दी। बहुत उच्च तीव्रता मुस्कराते हुए, वर्तमान में उपलब्ध डिटेक्टर तकनीक के साथ मापा जा सकता है कि कोशिकाओं में अंतर्जात धातुओं उत्तेजित करने के लिए पर्याप्त है ध्यान केंद्रित किया जा सकता है कि प्रकाश की भी एक अपेक्षाकृत छोटी राशि, उत्पादन संकेत के साथ। इस प्रकार, सेल में धातुओं के रासायनिक जीवविज्ञान का अध्ययन कर इस तकनीक 4-10 में हाल के घटनाक्रम के कई का उपयोग करता है कि विशेष रूप से एक आवेदन पत्र है।
एप्लिकेशन को, जबकि माना जा करने के लिए कई महत्वपूर्ण कारक हैंXFM झूठ बोल सुसंस्कृत स्तनधारी कोशिकाओं या अन्य जैविक नमूने का मौलिक वितरण और मात्रा का ठहराव जांच करने के लिए। सबसे पहले, नमूना सार्थक होने की माप के लिए आदेश में, दोनों संरचनात्मक रूप और अपनी मौलिक रचना के लिए सम्मान के साथ बरकरार रखा जाना चाहिए। यह एक केंद्रित एक्स-रे किरण की वजह से हो सकता है कि विकिरण क्षति के लिए हार्डी इतना है कि दूसरे, नमूना भी किसी तरह से संरक्षित किया जाना चाहिए। एक नमूना एक बार में इन मानदंडों दोनों को पूरा कर सकते हैं कि एक तरह से तेजी से एक कांच का, अनाकार बर्फ 11,12 में जमे हुए किया जा रहा है। तेजी से ठंड अक्सर ऐसे डुबकी ठंड या उच्च दबाव 13-16 ठंड के रूप में विभिन्न cryopreservation तकनीकों के माध्यम से हासिल की है। यह आम तौर पर cryopreservation संभव के रूप में देशी राज्य के करीब के रूप में जैविक नमूने में समग्र सेलुलर वास्तुकला और रासायनिक रचनाओं को बरकरार रखता है कि स्वीकार किया जाता है। कोशिकाओं और ऊतकों में fixatives की धीमी गति से और चयनात्मक प्रवेश की वजह से दूसरे हाथ पर रासायनिक निर्धारण, w के रूप मेंपक्ष झिल्ली पारगम्यता के रूप में बाद में परिवर्तन, विभिन्न सेलुलर आयनों विशेष रूप से इस तरह के सीएल, सीए और कश्मीर के रूप में प्रसारण आयनों इस प्रकार 17-19 उपअनुकूलित इन तत्वों की जांच प्रतिपादन, leached खो दिया है या दूसरी जगह जाने की अनुमति हो सकती है। विशेष रूप से पक्षपाती स्तनधारी कोशिकाओं के लिए सामान्य रूप में रासायनिक निर्धारण, अधिक क्रायो-निर्धारण के स्पष्ट लाभ के बावजूद, cryopreservation विभिन्न सीमाओं 20-23 है। सबसे स्पष्ट एक नहीं हर अनुसंधान प्रयोगशाला cryopreservation उपकरणों के लिए आसान पहुँच गया है। यहां तक कि सबसे वर्तमान उच्च दबाव फ्रीजर या फ्रीजर ही दूर कोशिकाओं incubated रहे हैं, जहां से हो सकता है जो क्रायो सुविधाओं की एक सबसेट ने महंगा और स्वामित्व उतर रही। cryopreservation के लाभ कोशिकाओं पर रखा यात्रा तनाव के नुकसान के लिए कारोबार किया जा सकता है। Cryopreservation निश्चित रूप से एक्स-रे प्रतिदीप्ति विश्लेषण के लिए नमूने संरक्षित करने के लिए सबसे कठोर तरीका है, जबकि इस प्रकार, यह निश्चित रूप से सभी परिस्थितियों के तहत सभी शोधकर्ताओं के लिए सबसे सुलभ नहीं है;और न ही यह हमेशा जरूरी है – ब्याज की धातुओं कसकर फिक्स बड़े अणुओं के लिए बाध्य है, और नमूना imaged किया जाएगा, जिस पर संकल्प सुखाने के दौरान हो सकता है कि अल्ट्रा microstructure के लिए क्षति से अधिक है कर रहे हैं। निरंतर 24 के प्रति जागरूक, रासायनिक निर्धारण और सुखाने के लिए एक उपयुक्त विकल्प हो सकता है।
एक सफल एक्स-रे प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रयोग में अन्य कारकों उचित विश्लेषण शामिल हैं। एक्स-रे प्रतिदीप्ति इमेजिंग मौलिक स्थानिक संकल्प प्रदान करने के लिए रेखापुंज स्कैनिंग के साथ संयुक्त एक्स-रे प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रोस्कोपी है। एकत्र एक्स-रे प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा उत्सर्जन चोटियों, पृष्ठभूमि, और घटना बीम के लोचदार और स्थिर बिखरने चोटियों ओवरलैपिंग का एक संयोजन होते हैं। इन योगदान के डे-कनवल्शनफ़िल्टर्स, और उत्सर्जन चोटियों की फिटिंग के लिए सक्षम बनाता है कि सॉफ्टवेयर, तो इस क्षेत्र में 25 के लिए एक महत्वपूर्ण विकास किया गया है। इसके अलावा, विकास और वाणिज्यिक जिलेसामग्री की मात्रा के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता रिश्तेदार जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जाना जाता संरचना, की पतली फिल्म मानकों की ribution भी बहुत महत्वपूर्ण हो गया है।
इस प्रोटोकॉल रासायनिक निर्धारण और हवा सुखाने के द्वारा पक्षपाती कोशिकाओं की तैयारी का एक विवरण प्रदान करता है। इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम अक्सर सफलता के लिए एक विशेष फैशन कुंजी में कोमल से rinsing बना रही है, अच्छी तरह से पालन नहीं करते जो सिलिकॉन नाइट्राइड खिड़कियों पर कोशिकाओं की वृद्धि है।
एक्स-रे प्रतिदीप्ति इमेजिंग भूविज्ञान, पदार्थ विज्ञान, और रासायनिक जीवविज्ञान 26-34 सहित कई क्षेत्रों में उपयोगी है। सिंक्रोटॉन एक्स-रे के क्षेत्र में अग्रिम, और उनके ध्यान केंद्रित, बहुत उच्च तीव्?…
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge Stefan Vogt for his assistance in the fitting of the representative data shown in this paper, and helpful discussions. The authors also acknowledge Chris Jacobsen for his support to Q. J.
Use of the Advanced Photon Source, beamlines 2-ID-E and 8-BM-B, at Argonne National Laboratory was supported by the U. S. Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, under Contract No. DE-AC02-06CH11357.
silicon nitride windows | Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom | No part numbers available. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm. Thickness 500 nm. Frame size: 5 mm x 5 mm. Frame thickness: 200 µm | Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc.West Chester, PA |
reverse tweezers | Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 | 78520-5X | EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers |
rubber grid mat | Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 | 71170 | Round Grid Mat |
acetic acid | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 | 338826 | trace metals grade concentrated acetic acid |
PIPES buffer | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 | P6757 | solid PIPES buffer |
formaldehyde stock solution | Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 | RT 17113 | 10 x 10mL ampules of 20% aqueous paraformaldehyde |