Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Kimyasal Fiksasyon X-ışını Floresans Görüntüleme Değme Hücreleri hazırlanması

Published: March 12, 2015 doi: 10.3791/52370
Automatic Translation
1, 2
1X-ray Science Division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory, 2Department of Physics and Astronomy, Northwestern University

Introduction

Floresan Görüntüleme kimlik ve bir numunede bulunan elementlerin nicelik sağlar X-ışını uzaysal çözülmesi. Olay X-ışınları, ilgi konusu ağır elemanının bağlanma enerjisi elektron daha büyük olacak şekilde seçilir, bir enerji, hücre çekirdeğinin 1 iç kabuk elektronların bağlanma enerjisi üstesinden gelir. Bu elektron kabuğu bir 'delik' oluşturur. Yüksek enerjili elektronlar bu deliklerin içine düşmek gibi, floresan X-ışınları dalga boyu bu orbitallerinin enerji ayrımı bağlıdır yayılır. Orbital enerji aralığı, belirli bir elemanın karakteristik olduğu için, X-ışını floresans emisyon da aletin göre karakteristik dalga boylarında, yer alır. Mevcut elemanların belirlenmesini sağlar karakteristik dalga boyunda bu emisyon olduğunu. Floresan yoğunluğunun kalibrasyonu bulunan elementlerin kantitatif sağlar.

X-ışını flüoresans mikroskopy (XFM) kısmen böyle Bahar-8 Japonya'da, Avrupa Radyasyon Sinkrotron Tesisi Fransa'da (SDBY), ve İleri Foton Kaynağı (olanların çok parlak X-ışını sinkrotron kaynaklarının gelişimine, giderek kullanılan haline gelmiştir ABD'de 2 APS). Bu kaynaklar çok yüksek yoğunluklu X-ışını kirişler sağlamak. Aynı zamanda, böyle bir bölge plaka teknolojisi gibi X-ışını optik gelişmeler, oldukça verimsiz 3 olsa, alt-mikron noktalar bu kirişlerin odaklanarak izin. Çok yüksek yoğunluklu kirişler, mevcut detektör teknoloji ile ölçülebilir hücrelerde endojen metallerin uyarmak için yeterlidir odaklanabilir ışık bile nispeten küçük bir miktarı, üretim sinyali ile. Böylece, hücrenin içindeki metallerin kimyasal biyoloji okuyan bu teknikle 4-10 son gelişmelerin birçoğu kullanan özellikle bir uygulamadır.

App sırasında dikkate alınması gereken birçok kritik faktör vardırXFM yatan kültürlenmiş memeli hücreleri veya diğer biyolojik örneklerin temel dağılımı ve miktarının araştırılması. İlk olarak, numune anlamlı olması için ölçme amacıyla, hem yapısal ve elementel kompozisyon bakımından, sağlam tutulması gerekir. Bu odaklanmış bir X-ışını neden olabilir, radyasyona karşı dayanıklı olacak şekilde İkinci olarak, örnek de bir şekilde korunmalıdır. Bir örnek bir seferde bu iki ölçütü karşılayan bir yolu, hızlı bir şekilde camsı, amorf buz 11,12 içine dondurulacaksa. Hızlı dondurma genellikle dalma dondurma ya da yüksek basınçlı 13-16 dondurma gibi çeşitli dondurarak saklama teknikleri ile elde edilir. Genellikle, dondurarak saklama mümkün yerli halde yakın olarak biyolojik numunelerde toplam hücresel bir yapıya ve kimyasal bileşimleri muhafaza ettiği kabul edilmektedir. Hücrelere ve dokulara fiksatif yavaş ve seçici penetrasyon nedeniyle diğer taraftan Kimyasal sabitleme, well membran geçirgenliği olarak sonradan yapılacak değişiklikler, çeşitli hücresel iyonları özellikle Cl, Ca ve K gibi yayılabilir iyonlar böylece 17-19 suboptimaldir bu unsurların soruşturma render, süzülür kayıp ya da taşındı izin verebilir. Özellikle yapışık memeli hücrelerinde genel olarak kimyasal sabitleme, üzerinde cryo-tespitin net avantajına rağmen, Kriyoprezervasyonun çeşitli sınırlamalar 20-23 sahiptir. En belirgin değil, her araştırma laboratuvarı dondurarak saklama araçlarına kolay erişim olmasıdır. Hatta En güncel yüksek basınç dondurucular veya dondurucular sadece kadar hücreler kuluçkaya yerden olabilir cryo tesisleri bir alt tarafından pahalı ve sahip olduğu vardır dalma. kryoprezervasyon yararı hücreleri üzerinde yerleştirilen seyahat stres dezavantajı işlem olabilir. Dondurulması kesinlikle X-ışını floresans analizi için numune korumak için en titiz şekilde Böylece, bu kesinlikle her koşulda tüm araştırmacılara en erişilebilir değil;ne de her zaman önemlidir - ilgi metaller sıkı düzeltilebilir makromoleküllerin bağlı ve numune yansıması olacak hangi çözünürlük kurutma sırasında meydana gelebilecek ultra mikro hasar büyükse eğer. Uyarılar 24 Dikkatli, kimyasal tespiti ve kurutma uygun bir seçim olabilir.

Başarılı bir X-ışını fluoresans görüntüsü elde deneyde diğer faktörler uygun analiz içerir. X-ışını floresans görüntüleme temelde uzaysal çözünürlüğü sağlamak için raster tarama ile birlikte X-ışını floresans emisyon spektroskopisi olduğunu. Toplanan X-ışını floresans emisyon spektrumları emisyon zirveleri, arka plan, ve olay kirişin elastik ve inelastik saçılma doruklarına örtüşen bir kombinasyonunu içerir. Bu katkıların de-büklüm, ve emisyon doruklarına montajını sağlayan yazılım, bu alanda 25 kritik gelişme olmuştur. Ayrıca, geliştirme ve ticari distMalzeme miktar floresan yoğunluğu göreceli kalibre etmek için kullanılır bilinen kompozisyon, ince film standartlarının ribution, aynı zamanda çok önemli olmuştur.

Bu protokol, kimyasal sabitleme ve hava kurutma ile yapışan hücrelerin hazırlanması için bir tanımını sağlar. Bu süreçte hayati bir adım genellikle başarı için belirli bir moda anahtarı nazik durulama yaparak, iyi uymayan silisyum nitrür windows hücrelerin büyüme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Göstergeler, Materyalden, Kültür Medya ve Yemekleri 1. Hazırlık

  1. Silikon nitrür (Si 3 N 4) pencere Taşıma.
    1. Öte yandan, kapsül diğer ucunu dönerken, hafif, pencerenin kendisinin sıkmak üzere olan bir şekilde bir pencere ihtiva eden bir ucu sıkarak kapsül açın.
    2. Ters bir çift kontrol, stereomicroscope altında ince uçlu cımbız ucunda hiçbir yapıştırıcı, boşluklar veya virajlı olmadığından emin olmak için. Aksi takdirde, pencere cımbız ile kırık veya sonraki adımları sırasında onları uçtuğunu olabilir.
    3. Yavaşça pencerenin kenarları çıkıp gereken yere kapsül geniş yapmak amacıyla bir yönde basınç uygulayarak açık uca yakın kapsülü sıkarken, dikkatle cımbız ile pencerenin çerçevesini tutarak kapsülden pencereyi çıkarın.
  2. Pencere ön yıkama (opsiyonel).
    1. Hafifçe batırarak, ön yıkama pencere Eğer istenirse% 70 etanol içinde 2 dakika yıkama ve% 100 etanol içinde 2 dakika yıkama ve ardından 5 saniye için damıtılmış su içine.
  3. Iliştirilmesi ve kültür çanak pencereleri sterilize.
    1. Pencereleri tutturmak için, kültür çanak altındaki düz tarafı yukarı pencereyi ayarlamak, temiz bir cam slayt bir parça bant koyun. Bandın uzun kenarı aşağı çeyrek inç şerit kapalı yaklaşık kesin. Temiz bir jilet ile ("¾ tarafından" ⅛ at) kısa tarafı kapalı bant bir dilim alın.
    2. Izgara veya pencerenin kenarına bant dilim uygulamak için cımbız kullanın. Güvenli pencere açıklığı kendisini kapsayan olmadan uymak için yeterli kullanın. Cımbız ile yapıştırılır bant kurgulama, kültür çanak alt üzerine aşağı pencere ayarlayın. Sıkıca kültür çanak alt bandı yapıştırmak için cımbız ucu kullanın.
    3. Diğer kenarına başka bir teyp şeridi uygulayın ve sıkıca cımbız ucuyla altına bu uygun.
    4. Bir kez tüm pencereleri vardırbantlanmış, ultraviyole (UV) radyasyon ile kültür yemekleri pencereleri sterilize. Yaklaşık 1 saat boyunca bir laminar akış başlığı içinde UV lambası altında çanak yerleştirerek başarmak.
    5. Pencere, poli-lisin ile önceden kaplanmış edilecek (İsteğe bağlı), yani pencere Sterilizasyondan sonra yoktur. Kaplama, daha sonra 10 37 ° C kuluçka makinesi içinde, 1 saat boyunca steril% 0.01 Poli-L-lisin çözeltisinin ul ve pencere kültür ortamı ile geri kalan çözelti ile durulama.
  4. XFM önce son yıkama için tamponlar hazırlayın.
    1. Tris-glükoz ya da piperazin-N ya da hazırlama N-bis (etansülfonik asit) (BORU), kalsiyum ve magnezyum içermeyen Dulbecco fosfat tampon tuzlu suyla (D-PBS) ile osmolalite ve pH eşdeğer olan herhangi bir eser metallerin serbest tampon -sucrose. Hücreler kimyasal sabit sonra hücrelerin durulama için bu tamponlar birini kullanın.
      1. Tris-glükoz çözeltisi (10 mM Tris, 260 mM glukoz, 9 mM asetik asit) yapmak glukoz 1.4 g Tris baz, 36 mg eklemek veUltra-saf su, 20 ml asetik asit ve 16 ul. Daha sonra, aşırı saf su ile 30 ml nihai hacim ayarlayın. Hiçbir pH ayarlaması gereklidir. Bir haftaya kadar oda sıcaklığında saklayın.
      2. BORULARI sakaroz (20mM PIPES, 200 mM sükroz) BORU 0.18 g ve ultra saf su 20 ml sükroz 2.0 g'ı eklenmekte ve konsantre asetik asit ve küçük miktarlarda pH'ı 7.4'e ayarlayın yapmak. Daha sonra, aşırı saf su ile 30 ml nihai hacim ayarlayın. Bir haftaya kadar oda sıcaklığında saklayın.
        Not: son durulama PBS kullanarak engellemek için bir neden PBS fosfat, klorür ve potasyum konsantrasyonları tamamen hava ile kurutma işleminden önce çıkarılması değilse bu XFM engelleyebilir kadar yüksek olmasıdır.
  5. Hücre kaplama için tampon hazırlayın.
    1. Hazırlama veya RPMI ortamı 1640 gibi tüm medya, çıkarma, 1x tripsin-EDTA çözeltisi, D-PBS, ve normal olarak yapışmış olan hücrelerin O pasaj için yapıldığı gibi, özellikle yapışkan hücre hattı için gereken başka herhangi bir reaktiff faiz ve 37 ° C onları sıcak.

Hücreler 2. Kaplama

  1. Laminar akış başlığı içinde pencere ihtiva eden sterilize edilmiş kültür kabı için, hafifçe eğimli bir zeminde onunla kültür çanak tarafındaki, ortam (100 mm kültür çanağı için 10 mi) ilave edin. Gereksiz yüzey gerilimini oluşturma veya silisyum nitrür pencere yüzeyine doğrudan medya bırakarak kaçının. Medya ilave olarak, yavaş yavaş kaplamak eğim açısı medya ile ızgara ve pencere rahatlatmak.
  2. Trypsinizing veya hücre hattı pasaj için her zamanki gibi plakalar kapalı hücreler kazıma, uygun faiz yapışık hücre hattı hazırlayın. Taze plaka hücreleri uygulamadan önce gerekli herhangi bir hücre sayımı, ya da diğer hazırlık yapın.
  3. Tipik haliyle, 24-72 saat içinde% 50-% 70 izdiham ulaşmak için gerekli olan bir hücre yoğunluğunda pencereli kültür tabağına hücreleri ekleyin ve% 5 karbon dioksit ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de inkübe edin. Istenilen hücre yoğunluğuna kadar (genellikle 50% -70% izdiham) ulaşıldığında, bir ters ışık mikroskobu kullanılarak, zaman zaman hücrelerin büyümesini dikkate alınmalıdır.

Hücreler 3. Sabitleme

  1. Satın alınan stok (örneğin,% 25 paraformaldehit) seyreltilmesi ve (numuneye aşırı sodyum ilave önlemek için), asetik asit ile 7.4'e pH değerinin ayarlanması ile D-PBS içinde% 4 paraformaldehid, taze hazırlayın.
  2. Hücreler istediğiniz gibi yetiştirilen ve (örneğin Hoescht gibi) herhangi bir hayati lekeler uygulanmış ve görüntülü edildiğinde, tek elle bir 45 ° açıyla çanak eğerek, nazik aspirasyon ortamı çıkarın ve diğer el pipet ile aspire .
    NOT: yerine pipet harcanan medya, alternatif, pencere pick up kez D-PBS ile mikrosantrifüj tüpler içine pencere daldırma ve sonra PBS yıkama 2 kat, ardından 20 dakika boyunca sabitleyici çözümleri ile yeni bir kültür kabına onu yerleştirmektir artık fiksatif kaldırmak için. Bu seçilirse, dir gitmekectly 3.5 adıma.
  3. D-PBS ile hafifçe çanak durulayın ve yemeğin tarafına doğru, 45 ° açıyla pipetlenmesini çanak tutarak yavaşça taze% 4 PFA / PBS ekleyerek, ve yavaş yavaş izin eğim açısını rahatlatıcı hemen kaldırıldı sıvı yerine sabitleştirici çözüm pencereleri kapatmak için. Oda sıcaklığında 20 dakika için sabitleyici ile kaplı hücreler tutun.
  4. Biraz çanak eğerek ve elle aspire, yukarıdaki gibi yine, nazik aspirasyonu ile sıvı çıkarın.
  5. Yavaşça, BORU / sakaroz çözeltisi bazı ekleme Adım 3.3 tarif devirme ve pipetleme yöntemi kullanılarak uzaklaştırıldı sıvıyı değiştirin.
  6. Tekrar 3.4 ve 3.5 adımları.
  7. Kurutma için malzeme hazırlayın.
    1. Böyle Kimwipes gibi tüy bırakmayan havlu toplayın, ve çok hızlı ve kolay kullanışlı böylece kutunun bir out çekin.
    2. Pencere kurumaya ayarlamak için bir temiz olmayan düz bir yer hazırlayın. Sırtlar yüzden sahip elektron mikroskobu kullanılan türden, bir lastik ızgara hasır Setkuruduktan ise pencere bir ucunda sütyen olabilir. Bu kurudukça kurutma yüzeyine yapışmış getting pencere tutmak, ve numune kenarına kalan tampon drenaj olacaktır.
  8. Dikkatle sıvı pencereden dışarı tutmak için pencereye bağlı bandı tweeze. Ters cımbız ile onları toplayıp sonra onları yüzer almak için BORULARI / sakaroz küçük bir miktar uygulayarak tarafından bant dökülmek pencereleri alın.
  9. Dikkatle iyice ve (pencere kendisi dokunmadan) bir Kimwipe ile pencerenin kenarından taşan BORULARI / sakaroz sıvamak. Ayrıca Kimwipe bir yuvarlak kat kullanarak arka girintili alan sıvamak.
    Not: amacı mümkün olduğunca pencere yüzeyinde tuzları veya tamponlar gibi az kristalleşme sahip olmaktır.
  10. Izgara hasır üzerine pencereyi yerleştirin. Pencere ızgara mat düz yalan değil emin olun, ama (ızgara mat sırtlar kullanarak) ve ızgara gibi küçük dokunmadan bir kenarında sütyenmümkün mat. Pencere kurumasını bekleyin.

4. Numune Montaj ve Görüntüleme

  1. Örnek kuruduktan sonra, bir ışık mikroskobu kullanarak windows hücrelerin varlığını doğrulamak. Bir sinkrotron ulaşım için numune hazırlamadan önce, bu doğrulamayı gerçekleştirin.
  2. Denemenizi barındırma sinkrotron beamline ulaşım için pencereleri paketleyin. Yavaşça, sonra bir cam slayt iki tarafta bant ile yapıştırın pencereler plastik Petri kabı alt bant ile cam slayt yapıştırın. Petri kabı kapalı Teyp.
    NOT: Bu noktadan önce, bu aşamalar herhangi bir tipik laboratuarda gerçekleştirilebilir. Aşağıdaki adımlar en iyi şekilde bir sinkrotron beamline yapılabilir olacaktır.
  3. Cımbız ile hafifçe penceresinden bandı çıkarın. Sinkrotronu de beamline işbirlikçileri tarafından sağlanan bir alüminyum sahibine pencereleri güvenli, pencerenin kenarında ince bir hatta kaplamada, oje kullanın.
  4. Içine alüminyum tutucu yerleştirinkinematik bir montaj ve X-ışını mikroskop konuma yerleştirin. Beamline de örnek odasının içine, motorlu aşamaları bağlayarak bir destek üzerine monte örnek.
  5. Örnek X-ışını mikroskobu enstrüman alanı (kurşun dolu duvarlar yapılmış bir baraka), kurulum tarama çıktıktan sonra. Bir video çapraz saç ile donatılmış bir kamera kullanarak örnek üzerinde X-ışını konumunu görüntülerken, tarama numunenin uygun alanı seçmek, beamline özel bir yazılım kullanılarak önceden hizalanmış bir alt scintillator kamera ile.
  6. Çevrede küçük özelliği büyüklüğü bir tahmine dayalı bir numune için uygun çözünürlük, seçin. Tek memeli hücrelerini görüntüleme için (~ boyutu 20-40 mikron), 0,25-0,5 mikron çözünürlük kullanın. Dokuların alanları görüntülenmesi ve birbirinden hücre tabakaları ayırmak için, 2-20 um çözünürlüğü kullanır.
  7. Araya miktarının bir tahmine dayalı numune için uygun bekleme süresi, SeçinFaiz mevcut ark. Metallerin yüksek miktarlarda varsa hızlı bir bakış tarama için, ya da, piksel başına 30-300 msn bekleme süreleri ile sinek taramaları kullanın. Az malzeme varsa, ya da, düşük bağıl bolluğu metaller ölçmek piksel başına 1-2 sn bekleme süreleri ile adım taramaları kullanmak için.
  8. Beamline özel yazılım içine taramaları Program. Bir raster tarama görüntü elde. Her element için karakteristik enerji zirveleri tespit edecek yazılımı ile verileri analiz etmek beamline işbirlikçileri ile birlikte çalışın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Biyolojik örnekler hakkında bilgi temin etmek üzere X-ışını floresans görüntüleme yeteneği, bu örnekler, deney süresi ölçeğinde radyasyona karşı sağlam bir şekilde hazırlanmaktadır edilmesine bağlıdır ve yine kimyasal ve yapısal özellikleri iyi olan korunmuş. Tespit hücrenin bu yönleri, (Şekil 1) korunmuş olduğunu gösteren - yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanmış ve görüntülenmiştir olan bir numune sonucu görüntüleme olarak, bu elemanlar varyasyon olduğunu görmek mümkündür.

Tersine, bir örnek de yerine bakarak bu süreç iyi gitmedi, ve tampon kurutma sırasında mevcut kaldığı, mevcut moleküllerden kapsamlı kristal oluşumu hücreleri yapısal hasar oluşturur ve ayrıca (X-ışını floresans spektrumları koleksiyonu ile müdahale Şekil 2).

Bu görüntüler piksel başına uydurma tarafından oluşturulan Görüntüdeki her noktada X-ışını flüoresan spektrumunun. Bu, her bir piksel ile toplanan her spektrumu, ayrı ayrı analiz edilmiş olduğu anlamına gelir. Monte verilerden oluşturulan bu görüntülerin panelleri görüntülerken, görüntüdeki her noktasına atanan değer verilen bir elementin karakteristik emisyon için Gauss entegre toplamı (örneğin, demir) en iyi olarak X-ışını floresan uyar spektrum bu noktada toplanmıştır. Örneğin, görüntüdeki tek bir piksel, demir karakteristik emisyon enerji bir Gauss eğrisinin altında kalan alanın toplamı demir için bir değer (sayı), sahip olduğu bu noktada emisyon spektrumu için uyan ve modeller, veri örnek. Veri yüksek ve görüntü içinde belirli değerlere (her görüntünün altında) renk tablosunun düşük uçlarını atamak her resmin üzerine eşik değerleri (maks ve min) ile gösterilir.

tp_upload / 52.370 / 52370fig1highres.jpg "width =" 700 "/>
Şekil İnsan SH-SY5Y Cell 1. X-ışını Floresans Görüntü. Bu görüntüde Her panel aynı hücreler hakkında farklı bilgiler görüntüler. İlk panel, etiketli DIC, hücre optik diferansiyel-interferans-kontrast mikrografıdır. Soldan sağa doğru aşağıdaki paneller, fosfor (P), kükürt (S), demir (Fe) ve hücre bölge üzerindeki dağılımını gösteren aynı hücrelerin çinko (Zn) görüntülerdir. gösterilen ölçek çubuğu 20 mikron. rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

Şekil 2,
Bir Rat B103 Cell Şekil 2. X-ışını Floresans Görüntü, tamponların zayıf veya yetersiz kaldırma ile hazırlanmış. İki hücre fosfor (P) panelinde görünür,ve demir (Fe), çinko (Zn) panel biraz görebilir. Bununla birlikte, kristal Tamponun varlığının, görüntü merkezinden, parçacıklardan oluşan bir leke olarak görülebilir, bilgilerin en gizlemektedir. gösterilen ölçek çubuğu 20 mikron. rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

X-ışını floresans görüntüleme yerbilimleri, malzeme bilimi ve kimya biyoloji 26-34 olmak üzere birçok alanda, yararlıdır. Sinkrotron X-ışınları gelişmeler ve onların odaklanarak, çok yüksek yoğunluklu ışınları üretmişlerdir. Odaklı X-ışını mevcut silikon sürüklenme detektörü teknolojisi ile ölçülebilir sinyalinin oluşturulması, şu anda varolan hücreler endojen metallerin uyarmak için yeterli kirişler. Ve hücrede metallerin kimyasal biyoloji okuyan bu alandaki son gelişmelerin birçoğu kullanan özellikle bir uygulamadır.

Bunlar Hidratlanmış çünkü Ancak, X-ışını floresans mikroskobu kullanarak biyolojik maddelerin çalışma aynı zamanda, diğer malzemelere ilişkin özel zorluklar sunar. Radyasyon hasarı önlemek için, ideal örnekler ölçüm sırasında vitreus buz donmuş olacaktır. Ancak, kimyasal tespit ve hava kurutma acemi çok daha erişilebilir ve metaller eğer uygun olabilirilgi Eylemsiz düzeltilebilir makromoleküller bağlı ve numune yansıması olacak hangi çözünürlük kurutma sırasında meydana gelebilecek ultra mikro hasar büyüktür vardır.

Yapışık hücre XFM çalışmaları için alt tabakaları göz önüne alındığında, ideal bir substrat aşağıdaki temel gereksinimleri karşılaması gerekir: 1) Normal proliferatif ve fenotipik hücre büyümesini alternatif olmadan sağlam hücre büyümesini desteklemek, 2) elemanları olanlar ile örtüşmektedir X-ışını floresan olmamalıdır Çevrede bulunan, 3) XFM önce ışık mikroskobu altında hücre büyüme değerlendirmesi için optik bakımdan transparan olması ve 4) kültür ve daha sonra tespit sırasında herhangi bir fiziksel ve kimyasal işleme dayanabilmelidir. Tarihsel olarak, kaplanmış altın transmisyon elektron mikroskopisi formvar ince polikarbonat folyolar / filmleri 35-37, (TEM) kadar farklı alt-tabakalar, 38-42 ve silisyum nitrür pencere 5,17,43-46 ızgaraları, memeli hücre büyümesi için kullanılmıştırs ve X-ışını fluoresans görüntüsü için de kullanılır. XFM, silisyum nitrür membran ile yapışkan memeli hücrelerini görüntülenmesi için mevcut olan ve potansiyel yüzeyler arasında karşılaştırıldığında (Si 3N 4) dönüş nedeniyle, alçak flüoresans fonu ve nispeten basit temel bileşim 4-6,47,48 için en uygun olanlardır. Ayrıca Si 3 N 4 pencere sağlam hücre eki ve çoğalmasını destekler. TEM ızgaraların, Si 3N gibi yaygın olarak kullanılan diğer alt-tabakalara göre 4 pencere ayrıca pencere X-ışını tomografisi için kullanılan özel bir avantajı ise, çok daha büyük, kesintisiz bir görüntüleme alanı vardır.

Si 3 N 4 pencere satıcılar sınırlı sayıda ticari olarak temin edilebilmektedir. Silisyum nitrür pencere ile çalışma kazanılmış bir yetenektir. windows çok kırılgan ve onları tutarken onları paramparça olabilir, ya da onları damla herhangi bir büküm güçleri oluşturmak değil büyük özen gerektirir. Handlters cımbız kullanarak kenarlarından ing popüler bir yaklaşımdır. En çok pencere 30 nm ile 500 nm, ve 5 x 5 mm ilâ 1 x 1 mm arasında bir genişliğe kadar kalınlığa sahiptir. Genel, kalın zarında, daha sağlam onlar stres taşıma her türlü vardır. Ancak, artan kalınlığı ve daha az optik şeffaflık, onlar örnekten arka plan emisyon artacak. 200 nm kalınlığında membranlar oldukça idealdir. Onlar ölçüm üzerinde minimal bir etkiye sahip, henüz yeterince sağlam fazla kırılma olmadan ele alınmalıdır.

Birçok hücre tipleri, başlangıçta eklemek ve sağlam steril Si 3 N 4 pencere üzerinde büyüyebilir test rağmen silisyum nitrür pencere üzerinde yetiştirilen hücreler genel çok daha kolay geleneksel hücre kültürü plakaları üzerinde hücrelerden daha ajite vardır. Kolayca toplu, müstakil ya da rutin medya değişiklikleri sırasında yuvarlanır hale gelir. Biz önceden yıkanmış pencereler genellikle daha hidrofilik hale bulundu; Hücreler daha eklemek ve daha az chan vardıce birlikte agrega. protokol açıklanan adımlar yukarıdaki pencerede hücreleri tutmak için nazik bir yıkama yaklaşımı tasvir. Alınabilir Diğer bazı adımlar, sadece bir kudreti kat bir lamel poli-lizin, veya laminin ile pencere kaplama bulunmaktadır.

Belirli bir deney başarılı veya başarısız olabilir Bu yöntemin bir başka özelliği ise örnekleri çalkalama olup. Plastik kültür gemilerinde hücrelerin büyümesini gözlemleyerek, pipetle ve plaka taşıma kaynaklanan ajitasyon normal aralık çok zarar görünmüyor. Ancak, silisyum nitrür pencere yetiştirilen hücreler için, ortam değişimi ve plaka taşıma sırasında ekstra bakım gereklidir. Böyle fare fibroblast hücreleri NIH / 3T3 gibi bazı kolayca ajite hücreler için, pencereleri içeren kültür plakaları dikkatle ele alınması gerekir. Bunlar dikkatle inkübatör çıkarılan ve yavaşça mikroskop aşamasında veya kabin yüzeyinde ayarlanacak var. İlle her küçük physical şok hücrelerini rahatsız edecek, ancak hücre dekolmanı riski ekstra bakım olmadan artar. Buna ek olarak, fetal sığır serumu ve silisyum nitrür pencere farklı partileri penceresinde hücrelerin bağlanması bazı etkilere sahip olabilir. Bazı serum kaynakları veya pencerelerin toplu benzer bakımı ile çok fazla rahatsızlık görmeden, yani çalışmak daha kolay görünüyor. Böylece, ilgi konusu bir hücre hattı için bir deneme yanılma tavsiye edilebilir.

X-ışını flüoresans mikropiliye kriyojenik aşamada, hem de dondurulmuş hidratlanmış biyolojik numunelerin hazırlanması için yeni araştırmalar gelişmeler sayesinde, ileride örnek hazırlama daha artan bir şekilde hidratlanmış örneklerin arasında dondurulmuş olasıdır. Silisyum nitrür pencere ile çalışma, ve hücre yapışmasını istinat aynı zorlukların çoğu orada da var. Ancak, bu tekniği mastering bir, kriyoprezervasyon denemeden önce becerilerini geliştirmeye başlamak için çok iyi bir yer kalırnd birçok kez, görüntü örnekleri mükemmel uygun bir yoldur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon nitride windows Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom SiRN-5.0-200-2.0-200. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm. Thickness: 200 nm. Frame size: 5 mm x 5 mm. Frame thickness: 200 µm. Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA.
Reverse tweezers Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 78520-5X EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers
Rubber grid mat Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 71170 Round Grid Mat
Acetic acid Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 338826 trace metals grade concentrated acetic acid
PIPES buffer Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 P6757 solid PIPES buffer
Formaldehyde stock solution Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 RT 17113 10 x 10 ml ampules of 20% aqueous paraformaldehyde

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, A. C. Center for X-ray Optics and Advanced Light Source. , 1-53 (2009).
  2. Helliwell, J. R. Synchrotron radiation facilities. Nat. Struct. Biol. 5, 614-617 (1988).
  3. Lai, B., et al. X-ray Phase Zone Plate Fabricated by Lithographic Techniques. Appl. Phys. Lett. 61 (16), 1877-1879 (1992).
  4. Dodani, S. C., et al. Calcium-dependent copper redistributions in neuronal cells revealed by a fluorescent copper sensor and X-ray fluorescence microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 5980-5985 (2011).
  5. Finney, L., et al. X-ray fluorescence microscopy reveals large-scale relocalization and extracellular translocation of cellular copper during angiogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (7), 2247-2252 (2007).
  6. Kehr, S., et al. X-ray fluorescence microscopy reveals the role of selenium in spermatogenesis. J. Mol. Biol. 389 (5), 808-818 (2009).
  7. McCormick, N., Velasquez, V., Finney, L., Vogt, S., Kelleher, S. L. X-ray fluorescence microscopy reveals accumulation and secretion of discrete intracellular zinc pools in the lactating mouse mammary gland. PloS One. 5 (6), (2010).
  8. Paunesku, T., Vogt, S., Maser, J., Lai, B., Woloschak, G. X-ray fluorescence microprobe imaging in biology and medicine. J. Cell. Biochem. 99 (6), 1489-1502 (2006).
  9. Twining, B. S., et al. Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe. Anal. Chem. 75 (15), 3806-3816 (2003).
  10. Chen, S., et al. The Bionanoprobe: hard X-ray fluorescence nanoprobe with cryogenic capabilities. J Synchrotron Radiat. 21, 66-75 (2014).
  11. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
  12. Forster, F., Medalia, O., Zauberman, N., Baumeister, W., Fass, D. Retrovirus envelope protein complex structure in situ studied by cryo-electron tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (13), 4729-4734 (2005).
  13. Muller, M., Moor, H. Science of Biological Specimen. , SEM, Inc. 131-138 (1984).
  14. Moor, H., Riehle, U. Proceedings of the 4th Eur. Reg. Conference Electron. , 33-34 (1968).
  15. Sitte, H. Advanced instrumentation and methodology related to cryoultramicrotomy: a review. Scanning Microsc Suppl. 10, 387-463 (1996).
  16. Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J. Microsc. 203, (Pt. 3, 285-294 (2001).
  17. Matsuyama, S., et al. Elemental mapping of frozen-hydrated cells with cryo-scanning x-ray fluorescence microscopy). X-Ray Spectrom. 39, 260-266 (2010).
  18. Schrag, M., et al. The effect of formalin fixation on the levels of brain transition metals in archived samples. Biometals. 23 (6), 1123-1127 (2010).
  19. James, S. A., et al. Quantitative comparison of preparation methodologies for X-ray fluorescence microscopy of brain tissue. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (3), 853-864 (2011).
  20. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23 (18), 3583-3588 (2004).
  21. Bouchet-Marquis, C., Hoenger, A. Cryo-electron tomography on vitrified sections: a critical analysis of benefits and limitations for structural cell biology. Micron. 42 (2), 152-162 (2011).
  22. Bouchet-Marquis, C., Dubochet, J., Fakan, S. Cryoelectron microscopy of vitrified sections: a new challenge for the analysis of functional nuclear architecture. Histochem. Cell Biol. 125 (1-2), 1-2 (2006).
  23. Mesman, R. J. A novel method for high-pressure freezing of adherent cells for frozen hydrated sectioning and CEMOVIS. J. Struct. Biol. 183 (3), 527-530 (2013).
  24. Hackett, M. J., et al. Chemical Alterations to murine brain tissue induced by formalin fixation: implications for biospectroscopic imaging and mapping studies of disease pathogenesis. Analyst. 136 (14), 2941-2952 (2011).
  25. Vogt, S. MAPS: A set of software tools for analysis and visualization of 3D x-ray fluorescence data sets. J Phys IV France. 104, 635-638 (2003).
  26. Vantelon, D., Lanzirotti, A., Scheinost, A. C., Kretzschmar, R. Spatial distribution and speciation of lead around corroding bullets in a shooting range soil studied by micro-X-ray fluorescence and absorption spectroscopy. Environ. Sci. Technol. 39 (13), 4808-4815 (2005).
  27. Robison, G., et al. X-ray fluorescence imaging of the hippocampal formation after manganese exposure. Metallomics : Integrated Biometal Science. 5 (11), 1554-1565 (2013).
  28. Hard Kemner, K. M. X-ray micro(spectro)scopy: a powerful tool for the geomicrobiologists. Geobiology. 6 (3), 270-277 (2008).
  29. Walsh, W. Scientific Testing of Beethoven's Hair. 17, José State University San José, CA. Naperville, Illinois, Beethoven Center, San. (2000).
  30. Casadio, F., Rose, V. High-resolution fluorescence mapping of impurities in historical zinc oxide pigments: hard X-ray nanoprobe applications to the paints of Pablo Picasso. Applied Physics A: Materials Science and Processing. 111 (1), 1-8 (2013).
  31. Leonardo, T., et al. Determination of elemental distribution in green micro-algae using synchrotron radiation nano X-ray fluorescence (SR-nXRF) and electron microscopy techniques--subcellular localization and quantitative imaging of silver and cobalt uptake by Coccomyxa actinabiotis. Metallomics : Integrated Biometal Science. 6 (2), 316-329 (2014).
  32. Wang, P., et al. Quantitative determination of metal and metalloid spatial distribution in hydrated and fresh roots of cowpea using synchrotron-based X-ray fluorescence microscopy. Sci. Total Environ. , 463-464 (2013).
  33. Ducic, T., et al. X-ray fluorescence analysis of iron and manganese distribution in primary dopaminergic neurons. J. Neurochem. 124 (2), 250-261 (2013).
  34. Kim, A. M., Vogt, S., O'Halloran, T. V., Woodruff, T. K. Zinc availability regulates exit from meiosis in maturing mammalian oocytes. Nature Chemical Biology. 6 (9), 674-681 (2010).
  35. Ortega, R., Cloetens, P., Deves, G., Carmona, A., Bohic, S. Iron storage within dopamine neurovesicles revealed by chemical nano-imaging. PloS One. 2 (9), (2007).
  36. Bohic, S., et al. Synchrotron hard X-ray microprobe: fluorescence imaging of single cells. Appl. Phys. Lett. 78 (22), 3544-3546 (2001).
  37. Kosior, E., et al. Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for sub-cellular metal quantification. J. Struct. Biol. 177 (2), 239-247 (2012).
  38. Glesne, D., Vogt, S., Maser, J., Legnini, D., Huberman, E. Regulatory properties and cellular redistribution of zinc during macrophage differentiation of human leukemia cells. J. Struct. Biol. 155 (1), 2-11 (2006).
  39. McRae, R., Lai, B., Vogt, S., Fahrni, C. J. Correlative microXRF and optical immunofluorescence microscopy of adherent cells labeled with ultrasmall gold particles. J. Struct. Biol. 155 (1), 22-29 (2006).
  40. Yang, L., et al. Imaging of the intracellular topography of copper with a fluorescent sensor and by synchrotron x-ray fluorescence microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (32), 11179-11184 (2005).
  41. Wagner, D., et al. Elemental analysis of Mycobacterium avium-, Mycobacterium tuberculosis-, and Mycobacterium smegmatis-containing phagosomes indicates pathogen-induced microenvironments within the host cell's endosomal system. J. Immunol. 174 (3), 1491-1500 (2005).
  42. Harris, H. H., et al. Time-dependent uptake, distribution and biotransformation of chromium(VI) in individual and bulk human lung cells: application of synchrotron radiation techniques. Journal Of Biological Inorganic Chemistry : JBIC : a publication of the Society of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 105-118 (2005).
  43. Corezzi, S., et al. Synchrotron-based X-ray fluorescence imaging of human cells labeled with CdSe quantum dots. Anal. Biochem. 388 (1), 33-39 (2009).
  44. Marmorato, P., et al. Cellular distribution and degradation of cobalt ferrite nanoparticles in Balb/3T3 mouse fibroblasts. Toxicol. Lett. 207 (2), 128-136 (2011).
  45. Weekley, C. M., et al. distribution, and speciation of selenoamino acids by human cancer cells: X-ray absorption and fluorescence methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
  46. Yuan, Y., et al. Epidermal growth factor receptor targeted nuclear delivery and high-resolution whole cell X-ray imaging of Fe3O4@TiO2 nanoparticles in cancer cells. ACS Nano. 7 (12), 10502-10517 (2013).
  47. McRae, R., Bagchi, P., Sumalekshmy, S., Fahrni, C. J. In situ imaging of metals in cells and tissues. Chem. Rev. 109 (10), 4780-4827 (2009).
  48. Carter, E. A., et al. Silicon nitride as a versatile growth substrate for microspectroscopic imaging and mapping of individual cells. Molecular Biosystems. 6 (7), 1316-1322 (2010).

Tags

Kimya Sayı 97 X-ışını floresan görüntüleme metaller kimyasal biyoloji mikroskopi sinkrotron
Kimyasal Fiksasyon X-ışını Floresans Görüntüleme Değme Hücreleri hazırlanması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Finney, L. A., Jin, Q. Preparing… More

Finney, L. A., Jin, Q. Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation. J. Vis. Exp. (97), e52370, doi:10.3791/52370 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter