Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

הכנת תאים חסידים הדמיה הקרינה רנטגן על ידי קיבוע כימי

Published: March 12, 2015 doi: 10.3791/52370
Automatic Translation
1, 2
1X-ray Science Division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory, 2Department of Physics and Astronomy, Northwestern University

Introduction

X-ray הדמיה הקרינה מאפשרת לשניהם זהות והכמות של אלמנטים קיימים במדגם להיפתר במרחב. תקרית צילומים רנטגן, של אנרגיה נבחרה להיות גדול יותר מהאלקטרון מחייב אנרגיה של היסוד הכבד ביותר של עניין, להתגבר על אנרגית הקשר של אלקטרונים פנימי קליפה לגרעין 1. זה יוצר "חור" בקליפת האלקטרונים. כאלקטרונים גבוהות אנרגיה ליפול לתוך חורים אלה, צילומי רנטגן ניאון נפלטים אורך הגל שהוא תלוי בהפרדת האנרגיה של אורביטלים אלה. מאז את מרווח האנרגיה של אורביטלים אופייני לאלמנט מסוים, פליטת הקרינה X-ray יש גם אורכי גל אופייניים, תלוי באלמנט. זה פליטה זה באורך גל אופייני המאפשר זיהוי של האלמנטים הנוכחיים. כיול של עוצמת הקרינה מאפשר לכמת את האלמנטים הנוכחיים.

microscop הקרינה רנטגןy (XFM) הפך יותר ויותר מנוצל, בין ההיתר בשל פיתוח מקורות מאוד מבריקים X-ray סינכרוטרון, כגון אלה באביב-8 ביפן, המתקן האירופי הקרינה Synchrotron (ESRF) בצרפת, והפוטון המתקדם המקור ( APS) בארה"ב 2. מקורות אלה מספקים קורות X-ray גבוהה מאוד בעוצמה. באותו הזמן, שיפורים באופטיקה רנטגן, כגון טכנולוגית צלחת האזור, אפשרו התמקדות של קורות אלה לכתמים תת-מיקרון, אם כי לא באופן בלתי יעיל 3. עם מאוד קורות בעוצמה גבוהה, גם כמות קטנה יחסית של אור שיכול להיות ממוקדת מספיק כדי להלהיב את מתכות אנדוגני בתאים, אות ייצור שניתן למדוד עם טכנולוגית גלאי זמינה כרגע. כך, מחקר על הביולוגיה הכימית של מתכות בתא הוא יישום אחד בפרט שעושה שימוש ברבים מההתפתחויות האחרונות בטכניקה זו 4-10.

ישנם גורמים קריטיים רבים כדי להיחשב בעת יישוםשוכב XFM לחקור את ההפצה וכימות הבסיסיות של תאי יונקים בתרבית או דגימות ביולוגיות אחרות. ראשית, המדגם צריך להיות כל הזמן בשלמות, גם מבני והן ביחס לרכב היסודות שלה, על מנת שהמדידה יהיה משמעותי. שנית, המדגם חייב גם יישמר בדרך כלשהי, כך שהוא קשוח לניזקי הקרינה שיכול להיגרם על ידי קרן רנטגן ממוקדת. אחת דרכים שמדגם יכול לפגוש שני הקריטריונים הללו בבת אחת הוא להיות מוקפאים במהירות לתוך קרח זגוגי, אמורפי 11,12. הקפאה מהירה מושגת לעתים קרובות באמצעות טכניקות שונות, כגון הקפאת הקפאה לצלול או בלחץ גבוה הקפאת 13-16. הדעה מקובלת היא שההקפאה שומרת ארכיטקטורה הסלולר כוללת והרכבים כימיים בדגימות ביולוגיות קרובות למצב טבעי ככל האפשר. קיבעון כימי, ומצד שני, בשל החדירה האיטית וסלקטיבית של fixatives לתאים ורקמות כמו well שינויים לאחר כבחדירות קרום, עשויים לאפשר יונים סלולריים שונים במיוחד יוני diffusible כגון Cl, Ca ו- K להיות דלפו, שאבדו או הועברו, וכך הופכים חקירה של האלמנטים האלה לא טובים 17-19. למרות היתרון ברור של cryo-קיבעון על קיבעון כימי באופן כללי, לתאי יונקים חסיד בפרט, יש הקפאת מגבלות שונות 20-23. הברור ביותר הוא שלא לכל מעבדת מחקר גישה קלה למכשירי הקפאה. רוב המקפיאים לחץ גבוה הנוכחיים או אפילו לצלול מקפיאים הם יקרים ובעלות רק על ידי קבוצת משנה של מתקני cryo, אשר עשויים להיות רחוק מהמקום שבי תאים מודגרת. היתרון של הקפאה עשוי להיסחר בחסרון של מתח נסיעות מונח על התאים. וכך, בעוד ההקפאה היא ללא ספק הדרך המחמיר ביותר לשמירת דגימות לבדיקת הקרינה רנטגן, זה בהחלט לא נגיש ביותר לכל החוקרים בכל הנסיבות;זה גם לא תמיד חיוני - אם המתכות של ריבית הדוקה למקרו-מולקולות הניתנים לקביעה, ואת הרזולוציה שבי המדגם יהיה צילמה גדולה מהניזק לאולטרה-המייקר שעלול להתרחש במהלך ייבוש. מודע לאזהרות 24, קיבעון כימי וייבוש עשוי להיות בחירה מתאימה.

גורמים אחרים בניסוי הדמיה הקרינה רנטגן מוצלח כוללים ניתוח נכון. ההדמיה הקרינה רנטגן היא ביסוד ספקטרוסקופיה פליטת הקרינה רנטגן בשילוב עם סריקה סריקה כדי לספק רזולוציה מרחבית. ספקטרום פליטת הקרינה X-ray שנאסף מכיל שילוב של חופף פסגות פליטה, רקע, ואת פסגות פיזור אלסטי והקשיחות של קורה האירוע. תוכנה המאפשרת דה-פיתול של תרומות אלה, וראויים של פסגות הפליטה, הייתה התפתחות קריטית לתחום זה 25. כמו כן, הפיתוח וdist המסחריribution של תקני סרט דק של הרכב ידוע, המשמש לכיול עוצמת הקרינה יחסית לכמות חומר, גם היה מאוד חשוב.

פרוטוקול זה מספק תיאור של הכנת תאים חסיד ידי קיבוע כימי וייבוש באוויר. צעד חיוני בתהליך זה הוא הצמיחה של התאים על חלונות סיליקון ניטריד, אשר לעתים קרובות אינו דבקים גם, מה שהופך את השטיפה עדינה במפתח אופנה מסוים להצלחה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה של מכשירים, מצעים, תרבות מדיה וכלים

  1. טיפול של הסיליקון Nitride (Si 3 N 4) חלונות.
    1. לפתוח את הכמוסה מעט על ידי סחיטת קצה אחד המכיל את החלון באופן שלא לסחוט את החלון עצמו כזה, תוך סיבוב בקצה השני של הכמוסה ביד השנייה.
    2. בדוק זוג הפוך, פינצטה קנס שקצה תחת סטראו לוודא שאין דבק, פערים או עיקולים בקצה. אחרת, החלונות עשויים להיות שבורים על ידי פינצטה או לעוף משלהם במהלך השלבים הבאים.
    3. הסר את החלון מהכמוסה ידי אחיזה במסגרת של החלון עם פינצטה בזהירות, תוך כדי לחיצות הכמוסה בעדינות לקראת הסוף הפתוח הפעלת לחץ בכיוון כדי להפוך את הכמוסה רחבה יותר שבו הקצוות של החלון צריכים לצאת.
  2. חלון מראש לשטוף (לא חובה).
    1. אם תרצה, חלונות קדם שטיפה בעדינות על ידי טבילתםבמים מזוקקים למשך 5 שניות, ואחריו 2 דקות לשטוף באתנול 70% ולשטוף 2 דקות ב 100% אתנול.
  3. פרזול וחיטוי חלונות בצלחת התרבות.
    1. להדביק את החלונות, להגדיר את החלון עם צד שטוח עד בתחתית צלחת התרבות, מקום חתיכת הסרט בשקופית זכוכית נקייה. חותך על רצועת סנטימטר במורד הצד השני של הקלטת הארוכה. קח פרוסת הקלטת מהצד הקצר (ב⅛ "על ידי ¾") בסכין גילוח נקי.
    2. להשתמש בפינצטה כדי להחיל את פרוסת הקלטת לקצה של הרשת או חלון. השתמש מספיק כדי לדבוק אותו היטב ללא כיסוי פתיחת החלון עצמו. מניפולציה של הקלטת דבקה עם פינצטה, להגדיר את החלון למטה, אל החלק התחתון של המנה התרבות. השתמש בקצה פינצטה לדבוק קלטת לתחתית צלחת התרבות בתקיפות.
    3. החל רצועת קלטת נוספת לקצה האחר ולדבוק זה לתחתית בתקיפות בחוד של פינצטה.
    4. ברגע שכל החלונותמוקלט, לעקר חלונות בתרבות מנות עם אולטרה סגול (UV). להשיג זאת על ידי הצבת הצלחת תחת מנורת UV בזרימה למינרית במשך כ -1 שעה.
    5. (אופציונאלי) אם חלונות הם להיות מראש מצופים עם פולי-ליזין, עושה זאת לאחר חלון עיקור. מעיל החלון עם 10 μl של 0.01% תמיסה סטרילית poly-L- ליזין עבור שעה 1 באינקובטור 37 ° C, ולאחר מכן לשטוף את הפתרון שנותר עם התקשורת והתרבות.
  4. הכן מאגרים לשטיפה סופית לפני XFM.
    1. הכן או טריס-גלוקוז או N piperazine-, '-bis N (חומצת ethanesulfonic) (צינורות) -sucrose חיץ חופשי מכל עקבות מתכות עם osmolality ושווה ערך ה- pH מלוח חיץ פוספט של Dulbecco (D-PBS) ללא סידן ומגנזיום. השתמש באחד מהמאגרים אלה כדי לשטוף תאים לאחר תאים קבועים כימי.
      1. כדי להפוך את פתרון טריס-גלוקוז (10 מ"מ טריס, 260 מ"מ גלוקוז, חומצה אצטית 9 מ"מ,) להוסיף 1.4 גרם של גלוקוז, 36 מ"ג של בסיס טריס ו16 μl של חומצה אצטית 20 מיליליטר של מים ultrapure. לאחר מכן, להתאים את הנפח סופי 30 מיליליטר עם מים ultrapure. אין צורך בהתאמת pH. אחסן בRT עד שבוע.
      2. כדי להפוך את הצינורות-סוכרוז (20 צינורות מ"מ, 200 מ"מ סוכרוז) להוסיף 0.18 גרם של צינורות וגרמו 2.0 של סוכרוז 20 מיליליטר של מים ultrapure ולהתאים את ה- pH ל 7.4 עם כמויות קטנות של חומצה אצטית מרוכזת. לאחר מכן, להתאים את הנפח סופי 30 מיליליטר עם מים ultrapure. אחסן בRT עד שבוע.
        הערה: הסיבה להימנע משימוש PBS בשטיפה הסופית היא שהריכוזים של פוספט, כלוריד ואשלגן בPBS כל כך גבוהים שזה יכול להפריע לXFM אם הוא לא הוסר לחלוטין לפני ייבוש באוויר.
  5. הכן מאגרים לציפוי תא.
    1. הכן או להוציא את כל אמצעי התקשורת, כגון בינוני RPMI 1640, 1x פתרון טריפסין-EDTA, D-PBS, וכל חומרים כימיים אחרים לפי צורך לשורת התאים חסיד מסוימת כבדרך כלל להיעשות לpassaging התאים חסיד oעניין f, ולחמם אותם עד 37 מעלות צלזיוס.

2. ציפוי של תאים

  1. למנת התרבות המעוקרות המכילה את החלונות, בזרימה למינרית, בעדינות להוסיף מדיה (10 מיליליטר למנת תרבות 100 מ"מ), בצד של צלחת התרבות עם זה נטוי בזווית. הימנע מיצירת מתח פנים מיותרים או להפיל תקשורת ישירות על גבי משטח של חלונות סיליקון ניטריד. כאמצעי תקשורת נוספת, להקל לאט זווית ההטיה למעייל הרשת וחלון עם תקשורת.
  2. הכן את שורת התאים חסיד של עניין כראוי, trypsinizing או מגרד את תאי הנחה של הצלחות כרגיל לpassaging שורת התאים. לבצע כל ספירת תאים, או תכשיר אחר נחוצה לפני יישום התאים לצלחת הטרי.
  3. הוספת תאים לצלחת התרבות עם חלונות בצפיפות תאים מה שצריך כדי להגיע בדרך כלל 50% -70% בתוך מפגש 24-72 שעות, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס חממת humidified עם 5% פחמן דו חמצני. שים לב הצמיחה של התאים מעת לעת, באמצעות מיקרוסקופ אור הפוכה, עד שצפיפות התא הרצויה (בדרך כלל 70% מפגש 50%) הוא הגיע.

3. קיבוע של תאים

  1. הכן paraformaldehyde 4% טריים בD-PBS על ידי דילול מניות שנרכשו (paraformaldehyde כגון 25%) והתאמת ה- pH 7.4 עם חומצה אצטית (להימנע מהוספת עודף נתרן לדוגמא).
  2. כאשר תאים כבר גדלו כרצוי, וכל כתמים חיוניים (כגון Hoescht) יושמו וצלמו, להסיר את המדיה על ידי שאיפה עדינה, הטיה הצלחת בזווית של 45 מעלות ביד אחת, וaspirating ביד עם פיפטה האחרות .
    הערה: במקום תקשורת pipetting בילה, אלטרנטיבה היא לבחור את החלון עד, לטבול את החלון לתוך צינורות microcentrifuge עם D-PBS פעמיים ולאחר מכן למקם אותו לכלי חדש תרבות עם פתרונות מקבע עבור 20 דקות ואחריו 2 פעמים לשטוף PBS כדי להסיר את fixatives השייר. אם זה נבחר, ללכת directly לשלב 3.5.
  3. יש לשטוף את הצלחת בעדינות עם D-PBS ולהחליף את הנוזל להסיר מייד על ידי הוספה בעדינות 4% PFA / PBS הטרי תוך כדי לחיצה על הצלחת בזווית של 45 מעלות, pipetting לכיוון הצד של המנה, ומרגיע לאט זווית ההטיה כדי לאפשר הפתרון מקבע כדי לכסות את החלונות. שמור את התאים מכוסים במקבע במשך 20 דקות ב RT.
  4. הסר את הנוזל על ידי שאיפה עדינה, שוב כאמור לעיל, הטיה הצלחת מעט וaspirating ביד.
  5. החלף את הנוזל הוסר בעדינות על ידי הוספה כמה מהצינורות / הפתרון סוכרוז, תוך שימוש בשיטת ההטיה וpipetting מתואר בשלב 3.3.
  6. חזור על שלבי 3.4 ו -3.5.
  7. הכן את החומרים לייבוש.
    1. לאסוף מגבות ונטולי מוך כגון Kimwipes, ולשלוף אחד של רחבה ולכן הוא שימושי מאוד במהירות ובקלות.
    2. הכן מקום נקי, ברמה שאינה להגדיר את החלון לייבוש. יצא מחצלת רשת גומי מהסוג המשמש במיקרוסקופ אלקטרונים, שבו יש כל כך רכסיםהחלון יכול להיות שעונה על קצה אחד בזמן שהוא מתייבש. זה יהיה לשמור על החלון מלהיתקע על פני השטח הייבוש כהוא מתייבש, ולנקז כל חיץ שנותר עד לקצה של המדגם.
  8. למרוט בזהירות את הקלטת המצורפת לחלון כדי להחזיק את החלון עד מתוך הנוזל. אחזר חלונות שיורדים מהקלטת על ידי מריחת כמות קטנה של צינורות / סוכרוז כדי לגרום להם לצוף ולאחר מכן לאסוף אותם עם פינצטה ההפוכה.
  9. בזהירות (בלי לגעת בחלון עצמו) וביסודיות למחות כל צינורות / סוכרוז עודף מקצה החלון עם Kimwipe. גם למחות אזור מסוכסך הגב באמצעות קיפול מעוגל של Kimwipe.
    הערה: המטרה היא שהתגבשות קטנה כמו של מלחים או מאגרים על פני השטח של החלון ככל האפשר.
  10. הנח את החלון על מחצלת הרשת. ודא שהחלון לא שוכב על מזרן הרשת, אבל שעונה על קצה (שימוש ברכסים של מחצלת הרשת) ונגיעה קטנה כמו של הרשתמחצלת האפשר. בואו חלון היבש.

4. הרכבה לדוגמא והדמיה

  1. לאחר המדגם התייבש, לאמת את הנוכחות של תאים על החלונות באמצעות מיקרוסקופ אור. לבצע אימות זה, לפני הכנת הדגימות לתחבורה לסינכרוטרון.
  2. חבילה של Windows לתחבורה לbeamline סינכרוטרון אירוח הניסוי שלך. בעדינות להדביק את החלונות עם סרט על שני צדדים לשקופיות זכוכית, ולאחר מכן להדביק את שקף הזכוכית עם קלטת לתחתית צלחת פטרי פלסטיק. קלטת עצומה צלחת פטרי.
    הערה: לפני שלב זה, ניתן לבצע את הפעולות הבאות בכל מעבדה טיפוסית. השלבים הבאים יהיו הטוב ביותר להיעשות בbeamline סינכרוטרון.
  3. הסר את הסרט מהחלון בעדינות עם פינצטה. למרוח לק על ציפורניים, באפילו ציפוי דק לאורך הקצה של החלון, כדי לאבטח את החלונות לבעל אלומיניום הניתן על ידי משתפי הפעולה beamline בסינכרוטרון.
  4. הכנס את בעל אלומיניום לkinematic הר, ולאחר מכן למקם אותו למקומו במיקרוסקופ X-ray. הר המדגם על תושבת חיבורו לשלבים ממונעים, בתוך חדר המדגם בbeamline.
  5. לאחר היציאה ממדגם אזור X-ray מכשיר מיקרוסקופ (לול עשוי מקירות מלא עופרת), התקנת הסריקה. שימוש בתוכנת beamline ספציפי, בחר את האזור המתאים של המדגם לסרוק, בעת הצגת עמדתה של קרן רנטגן על המדגם באמצעות מצלמה מצוידת בצלב שיער-וידאו ועם מצלמה scintillator במורד הזרם מיושר מראש.
  6. בחר את הרזולוציה המתאימה למדגם, המבוסס על הערכה של הגודל של התכונה הקטנה ביותר של עניין. הדמיה תאי יונקים יחידים (~ 20-40 מיקרומטר בגודל), להשתמש ברזולוציה של .25-0.5 מיקרומטר. הדמיה אזורים של רקמות, והבחנת שכבות תאים מזה, להשתמש ברזולוציה של 2-20 מיקרומטר.
  7. בחר את הזמן המתאים להתעכב למדגם, המבוסס על הערכה של הכמות נפגשאל הווה עניין. לסריקת סקירה מהירה, או אם כמויות גבוהות של מתכות הן מופיע, השתמש בסריקות לטוס עם זמנים להתעכב של 30-300 msec לפיקסל. אם חומר קטן הוא הווה, או למדוד מתכות של שפע יחסי נמוך, להשתמש בסריקות צעד עם פעמים להתעכב של 1-2 שניות לכל פיקסל.
  8. לתכנת את הסריקות לתוך תוכנת beamline הספציפי. לרכוש תמונת סריקה סריקה. לעבוד יחד עם משתפי הפעולה beamline כדי לנתח את הנתונים עם תוכנה שיזהו את פסגות אנרגיה האופייניות לכל רכיב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

היכולת של הדמיה הקרינה רנטגן על מנת לספק מידע על דגימות ביולוגיות מותנית דגימות אלה שמכינים באופן כזה שהם חזקים לנזקי קרינה בזמן בקנה המידה של הניסוי, ובכל זאת הכימית שלהם והתכונות מבניות היטב השתמר. בצפיית התוצאה ממדגם שהוכן כפי שתואר לעיל וצלם, אפשר לראות שיש שוני באלמנטים הנוכחיים - מצביע על כך שהקיבעון נשמר היבטים של התאים אלה (איור 1).

לעומת זאת, מחפש במקום במדגם שבו תהליך זה לא הלך טוב, והחיץ נותר נוכח במהלך ייבוש, היווצרות גבישים נרחבת מהמולקולות הנוכחיות יוצרת נזק מבנים לתאים וגם מפריעה לאוסף של ספקטרום הקרינה X-ray ( איור 2).

תמונות אלה מופקות על ידי התאמה לכל פיקסל של ספקטרום הקרינה רנטגן בכל נקודה בתמונה. משמעות דבר היא כי כל ספקטרום, שנאסף על כל פיקסל, כבר ניתח בנפרד. בעת צפייה בתמונות אלה הלוחות שנוצרו מנתונים המותאמים, הערך שהוקצה לכל נקודה בתמונה הוא הסכום המשולב של גאוס לפליטה האופיינית לאלמנט מסוים (למשל, ברזל) כמתאים ביותר לקרינת רנטגן ספקטרום שנאסף בשלב זה. לדוגמא, פיקסל אחד בתמונה יש ערך (מספר) עבור ברזל, שהוא הסכום של אזור הנתון לעקומת גאוס באנרגית הפליטה האופיינית לברזל, שמתאים לדגמים והנתונים לספקטרום הפליטה של ​​נקודה ש במדגם. הנתונים מוצגים בערכי סף מעל כל תמונה (מקסימום ומינימום) שלהקצות הגבוהה ונמוכים קצוות של הצבע לשולחן (בתחתית כל תמונה) לערכים ספציפיים בתוך התמונה.

tp_upload / 52,370 / "width =" 700 52370fig1highres.jpg "/>
איור 1. תמונת הקרינה רנטגן של תאים אנושיים SH-SY5Y. כל פנל בתמונה זו מציג מידע שונה על אותם תאים. הפנל הראשון, שכותרתו דסק"ש, הוא מיקרוסקופ התערבות ההפרש לעומת זאת האופטית של התאים. הלוחות הבאים, משמאל לימין, הם זרחן (P), גופרית (S), הברזל (Fe), ותמונות אבץ (Zn) של תאים באותו, מראים ההפצה שלהם על פני השטח של התא. סרגל קנה המידה המוצג הוא 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.

איור 2
תמונת איור 2. X-ray Fluorescence של תא העכברוש B103, מוכן עם ההסרה עניה או מספקת של מאגרים. שני תאים גלויים בלוח זרחן (P),ושהם נראים מעט בברזל (Fe) ואבץ לוחות (Zn). עם זאת, הנוכחות של חיץ מגובש, נראה כמו כתם של חלקיקים דרך מרכז התמונה, מטשטשת את רוב המידע. סרגל קנה המידה המוצג הוא 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ההדמיה הקרינה רנטגן שימושית בתחומים רבים, כולל geosciences, מדע חומרים, וביולוגיה כימית 26-34. התקדמות בצילומי רנטגן סינכרוטרון, והפוקוס שלהם, יצרה מאוד קורות בעוצמה גבוהה. X-ray הממוקד קורות מספיק כדי לעורר את מתכות אנדוגני בתאים קיימות כיום, לייצר אות שניתן למדוד עם טכנולוגית גלאי להיסחף סיליקון זמין כרגע. ומחקר על הביולוגיה הכימית של מתכות בתא הוא יישום אחד בפרט שעושה שימוש ברבים מההתפתחויות האחרונות בתחום זה.

עם זאת, המחקר של חומרים ביולוגיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רנטגן גם מציב אתגרים מיוחדים, יחסית לחומרים אחרים, כי הם התייבשות. כדי למנוע נזקי קרינה, באופן אידיאלי הדגימות יהיו קפואות בקרח הזגוגית במהלך המדידה. עם זאת, קיבעון כימי וייבוש האוויר הם הרבה יותר נגישים לטירון, ועשוי להיות מתאים אם המתכותשל ריבית בלא הניע חייב מקרו-מולקולות הניתנים לקביעה, ואת הרזולוציה שבי המדגם יהיה צילמה גדולה מהניזק לאולטרה-המייקר שעלול להתרחש במהלך ייבוש.

בבואנו לבחון את מצעים ללימודי XFM תא חסיד, מצע אידיאלי צריך לעמוד בדרישות הבסיסיות הבאות: 1) לתמוך בצמיחת תאים חזקה ללא לסירוגין צמיחת תאי שגשוג ופנוטיפי רגילה, 2) לא חייבים להיות הקרינה רנטגן חופפת לאלו של אלמנטים של עניין, 3) להיות שקוף אופטי להערכת גדילת תאים תחת מיקרוסקופ אור לפני XFM, ו -4) להיות מסוגל לעמוד בכל מניפולציה פיזית וכימית במהלך culturing וקיבעון שלאחר מכן. מבחינה הסטורית, מצעים שונים, הנעים בין שקפים פוליקרבונט / סרטים דקים 35-37, formvar מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים מצופה זהב (TEM) רשתות 38-42 וסיליקון ניטריד חלונות 5,17,43-46, כבר משמש לגידול תאים יונקיםים ומשמש להדמית הקרינה רנטגן. בהשוואה בין מצעים הקיימים ופוטנציאליים להדמית תאי יונקים חסיד ידי XFM, קרום סיליקון ניטריד (סי 3 N 4) חלונות מתאימים ביותר בשל הרקע שלהם נמוך הקרינה והרכב יסודות פשוט יחסית 4-6,47,48. בנוסף Si 3 N 4 חלונות לתמוך מצורף תא חזק ושגשוג. בהשוואה למצעים נפוצים אחרים כגון רשתות TEM, Si 3 N 4 חלונות יש גם אזור הדמיה ללא הפרעה הרבה יותר גדול וזה יתרון מסוים כאשר חלונות אלה משמשים לטומוגרפיה X-ray.

Si 3 N 4 חלונות זמינים מסחרי ממספר מצומצם של ספקים. עבודה עם חלונות סיליקון ניטריד היא מיומנות נרכשת. החלונות הם שבירים מאוד, ודורשים זהירות רבה כדי לא ליצור כל כוחות פיתול בזמן הטיפול בהם שעלול לנפץ אותם, או לזרוק אותם. Handling אותם בקצוות באמצעות פינצטה הפוכה הוא גישה פופולרית. רוב החלונות עוביים הנעים בין 30 ננומטר ל -500 ננומטר ורוחב מ 1 x 1 מ"מ עד 5 x 5 מ"מ. באופן כללי עבה הקרום,, חזק יותר הם לכל סוגי טיפול לחץ. עם זאת, עם עובי מוגבר ושקיפות פחות אופטית, הם יגדילו את פליטת הרקע מן הדגימה. 200 הקרומים העבים ננומטר הם די אידיאליים. יש להם השפעה מינימאלית על המדידה, עדיין הם יציב מספיק כדי להיות מטופלים בלי הרבה שבירה.

למרות שסוגים רבים של תאים שנבדקו בתחילה יכולים לצרף ולגדול וחסונה על Si 3 N 4 חלונות סטרילי, תאים שגודלו בחלונות סיליקון ניטריד הם באופן כללי הרבה יותר בקלות מאשר תאים נסערים על צלחות תרבית תאים מסורתיות. הם הופכים בקלות מנותקת, מצטברים או מעוגלים כלפי מעלה גם במהלך שינויי תקשורת שיגרתי. מצאנו חלונות מראש שטף לעתים קרובות הפכו הידרופילי יותר; התאים לצרף טובים יותר והיה פחות chance כדי לצבור יחד. השלבים מתוארים בפרוטוקול לעיל להתוות גישה עדינה לשטיפת לשמירה על התאים על החלון. כמה צעדים אחרים שניתן לקחת כוללים ציפוי חלונות עם פולי-ליזין, או laminin, מעיל כוח רק כאחד coverslip.

היבט נוסף של שיטה זו שיכולה להיות ההצלחה או כישלון של ניסוי נתון הוא תסיסה של הדגימות. בהתבוננות הצמיחה של תאים בכלי פלסטיק תרבות, הטווח הנורמלי של תסיסה וכתוצאה מpipetting והתחבורה צלחת לא נראה לגרום נזק רב. עם זאת, לתאים שגודלו על חלונות סיליקון ניטריד, יש צורך בטיפול נוסף במהלך שינוי תקשורת והתחבורה צלחת. לחלק מתאים נסער בקלות כגון תאי פיברובלסטים עכבר NIH / 3T3, צלחות התרבות המכילות חלונות צריכים להיות מטופל בזהירות. הם צריכים להילקח בזהירות החוצה מהחממה ולהגדיר בעדינות על הבמה מיקרוסקופ או משטח ארון. לא בהכרח כל p הקטןהלם hysical יפריע תאים, אך הסיכון של ניתוק תא מגביר ללא טיפול נוסף. בנוסף, קבוצות שונות של חלונות בסרום וסיליקון ניטריד שור העוברית עשויות להיות השפעה מסוימת על הקובץ המצורף של תאים על החלון. מקורות מסוימים של סרום או קבוצות של חלונות נראים קלים יותר לעבוד איתו, כלומר, בלי לראות יותר מדי הפרעה בטיפול דומה. אז, עשוי להיות מומלץ קצת ניסוי וטעייה לשורת התאים של עניין.

עם התפתחויות בשלבי קירור לmicroprobes הקרינה רנטגן, כמו גם מחקר חדש בהכנת דגימות ביולוגיות hydrated קפואים, סביר להניח כי הכנת מדגם בעתיד תהיה הרבה יותר יותר ויותר כוללת קפוא דגימות hydrated. רבים מהם האתגרים בעבודה עם חלונות סיליקון ניטריד, ושמירה על הידבקות תא קיימים גם שם. עם זאת, שליטה בטכניקה זו נותרת מקום טוב מאוד להתחיל בפיתוח מיומנויות לפני שתנסה הקפאה,nd פעמים רבות, היא דרך מתאימה בצורה מושלמת לדגימות תמונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon nitride windows Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom SiRN-5.0-200-2.0-200. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm. Thickness: 200 nm. Frame size: 5 mm x 5 mm. Frame thickness: 200 µm. Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA.
Reverse tweezers Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 78520-5X EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers
Rubber grid mat Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 71170 Round Grid Mat
Acetic acid Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 338826 trace metals grade concentrated acetic acid
PIPES buffer Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 P6757 solid PIPES buffer
Formaldehyde stock solution Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 RT 17113 10 x 10 ml ampules of 20% aqueous paraformaldehyde

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, A. C. Center for X-ray Optics and Advanced Light Source. , 1-53 (2009).
  2. Helliwell, J. R. Synchrotron radiation facilities. Nat. Struct. Biol. 5, 614-617 (1988).
  3. Lai, B., et al. X-ray Phase Zone Plate Fabricated by Lithographic Techniques. Appl. Phys. Lett. 61 (16), 1877-1879 (1992).
  4. Dodani, S. C., et al. Calcium-dependent copper redistributions in neuronal cells revealed by a fluorescent copper sensor and X-ray fluorescence microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 5980-5985 (2011).
  5. Finney, L., et al. X-ray fluorescence microscopy reveals large-scale relocalization and extracellular translocation of cellular copper during angiogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (7), 2247-2252 (2007).
  6. Kehr, S., et al. X-ray fluorescence microscopy reveals the role of selenium in spermatogenesis. J. Mol. Biol. 389 (5), 808-818 (2009).
  7. McCormick, N., Velasquez, V., Finney, L., Vogt, S., Kelleher, S. L. X-ray fluorescence microscopy reveals accumulation and secretion of discrete intracellular zinc pools in the lactating mouse mammary gland. PloS One. 5 (6), (2010).
  8. Paunesku, T., Vogt, S., Maser, J., Lai, B., Woloschak, G. X-ray fluorescence microprobe imaging in biology and medicine. J. Cell. Biochem. 99 (6), 1489-1502 (2006).
  9. Twining, B. S., et al. Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe. Anal. Chem. 75 (15), 3806-3816 (2003).
  10. Chen, S., et al. The Bionanoprobe: hard X-ray fluorescence nanoprobe with cryogenic capabilities. J Synchrotron Radiat. 21, 66-75 (2014).
  11. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
  12. Forster, F., Medalia, O., Zauberman, N., Baumeister, W., Fass, D. Retrovirus envelope protein complex structure in situ studied by cryo-electron tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (13), 4729-4734 (2005).
  13. Muller, M., Moor, H. Science of Biological Specimen. , SEM, Inc. 131-138 (1984).
  14. Moor, H., Riehle, U. Proceedings of the 4th Eur. Reg. Conference Electron. , 33-34 (1968).
  15. Sitte, H. Advanced instrumentation and methodology related to cryoultramicrotomy: a review. Scanning Microsc Suppl. 10, 387-463 (1996).
  16. Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J. Microsc. 203, (Pt. 3, 285-294 (2001).
  17. Matsuyama, S., et al. Elemental mapping of frozen-hydrated cells with cryo-scanning x-ray fluorescence microscopy). X-Ray Spectrom. 39, 260-266 (2010).
  18. Schrag, M., et al. The effect of formalin fixation on the levels of brain transition metals in archived samples. Biometals. 23 (6), 1123-1127 (2010).
  19. James, S. A., et al. Quantitative comparison of preparation methodologies for X-ray fluorescence microscopy of brain tissue. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (3), 853-864 (2011).
  20. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23 (18), 3583-3588 (2004).
  21. Bouchet-Marquis, C., Hoenger, A. Cryo-electron tomography on vitrified sections: a critical analysis of benefits and limitations for structural cell biology. Micron. 42 (2), 152-162 (2011).
  22. Bouchet-Marquis, C., Dubochet, J., Fakan, S. Cryoelectron microscopy of vitrified sections: a new challenge for the analysis of functional nuclear architecture. Histochem. Cell Biol. 125 (1-2), 1-2 (2006).
  23. Mesman, R. J. A novel method for high-pressure freezing of adherent cells for frozen hydrated sectioning and CEMOVIS. J. Struct. Biol. 183 (3), 527-530 (2013).
  24. Hackett, M. J., et al. Chemical Alterations to murine brain tissue induced by formalin fixation: implications for biospectroscopic imaging and mapping studies of disease pathogenesis. Analyst. 136 (14), 2941-2952 (2011).
  25. Vogt, S. MAPS: A set of software tools for analysis and visualization of 3D x-ray fluorescence data sets. J Phys IV France. 104, 635-638 (2003).
  26. Vantelon, D., Lanzirotti, A., Scheinost, A. C., Kretzschmar, R. Spatial distribution and speciation of lead around corroding bullets in a shooting range soil studied by micro-X-ray fluorescence and absorption spectroscopy. Environ. Sci. Technol. 39 (13), 4808-4815 (2005).
  27. Robison, G., et al. X-ray fluorescence imaging of the hippocampal formation after manganese exposure. Metallomics : Integrated Biometal Science. 5 (11), 1554-1565 (2013).
  28. Hard Kemner, K. M. X-ray micro(spectro)scopy: a powerful tool for the geomicrobiologists. Geobiology. 6 (3), 270-277 (2008).
  29. Walsh, W. Scientific Testing of Beethoven's Hair. 17, José State University San José, CA. Naperville, Illinois, Beethoven Center, San. (2000).
  30. Casadio, F., Rose, V. High-resolution fluorescence mapping of impurities in historical zinc oxide pigments: hard X-ray nanoprobe applications to the paints of Pablo Picasso. Applied Physics A: Materials Science and Processing. 111 (1), 1-8 (2013).
  31. Leonardo, T., et al. Determination of elemental distribution in green micro-algae using synchrotron radiation nano X-ray fluorescence (SR-nXRF) and electron microscopy techniques--subcellular localization and quantitative imaging of silver and cobalt uptake by Coccomyxa actinabiotis. Metallomics : Integrated Biometal Science. 6 (2), 316-329 (2014).
  32. Wang, P., et al. Quantitative determination of metal and metalloid spatial distribution in hydrated and fresh roots of cowpea using synchrotron-based X-ray fluorescence microscopy. Sci. Total Environ. , 463-464 (2013).
  33. Ducic, T., et al. X-ray fluorescence analysis of iron and manganese distribution in primary dopaminergic neurons. J. Neurochem. 124 (2), 250-261 (2013).
  34. Kim, A. M., Vogt, S., O'Halloran, T. V., Woodruff, T. K. Zinc availability regulates exit from meiosis in maturing mammalian oocytes. Nature Chemical Biology. 6 (9), 674-681 (2010).
  35. Ortega, R., Cloetens, P., Deves, G., Carmona, A., Bohic, S. Iron storage within dopamine neurovesicles revealed by chemical nano-imaging. PloS One. 2 (9), (2007).
  36. Bohic, S., et al. Synchrotron hard X-ray microprobe: fluorescence imaging of single cells. Appl. Phys. Lett. 78 (22), 3544-3546 (2001).
  37. Kosior, E., et al. Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for sub-cellular metal quantification. J. Struct. Biol. 177 (2), 239-247 (2012).
  38. Glesne, D., Vogt, S., Maser, J., Legnini, D., Huberman, E. Regulatory properties and cellular redistribution of zinc during macrophage differentiation of human leukemia cells. J. Struct. Biol. 155 (1), 2-11 (2006).
  39. McRae, R., Lai, B., Vogt, S., Fahrni, C. J. Correlative microXRF and optical immunofluorescence microscopy of adherent cells labeled with ultrasmall gold particles. J. Struct. Biol. 155 (1), 22-29 (2006).
  40. Yang, L., et al. Imaging of the intracellular topography of copper with a fluorescent sensor and by synchrotron x-ray fluorescence microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (32), 11179-11184 (2005).
  41. Wagner, D., et al. Elemental analysis of Mycobacterium avium-, Mycobacterium tuberculosis-, and Mycobacterium smegmatis-containing phagosomes indicates pathogen-induced microenvironments within the host cell's endosomal system. J. Immunol. 174 (3), 1491-1500 (2005).
  42. Harris, H. H., et al. Time-dependent uptake, distribution and biotransformation of chromium(VI) in individual and bulk human lung cells: application of synchrotron radiation techniques. Journal Of Biological Inorganic Chemistry : JBIC : a publication of the Society of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 105-118 (2005).
  43. Corezzi, S., et al. Synchrotron-based X-ray fluorescence imaging of human cells labeled with CdSe quantum dots. Anal. Biochem. 388 (1), 33-39 (2009).
  44. Marmorato, P., et al. Cellular distribution and degradation of cobalt ferrite nanoparticles in Balb/3T3 mouse fibroblasts. Toxicol. Lett. 207 (2), 128-136 (2011).
  45. Weekley, C. M., et al. distribution, and speciation of selenoamino acids by human cancer cells: X-ray absorption and fluorescence methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
  46. Yuan, Y., et al. Epidermal growth factor receptor targeted nuclear delivery and high-resolution whole cell X-ray imaging of Fe3O4@TiO2 nanoparticles in cancer cells. ACS Nano. 7 (12), 10502-10517 (2013).
  47. McRae, R., Bagchi, P., Sumalekshmy, S., Fahrni, C. J. In situ imaging of metals in cells and tissues. Chem. Rev. 109 (10), 4780-4827 (2009).
  48. Carter, E. A., et al. Silicon nitride as a versatile growth substrate for microspectroscopic imaging and mapping of individual cells. Molecular Biosystems. 6 (7), 1316-1322 (2010).

Tags

כימיה גיליון 97 X-ray הקרינה הדמיה מתכות ביולוגיה כימית מיקרוסקופיה סינכרוטרון
הכנת תאים חסידים הדמיה הקרינה רנטגן על ידי קיבוע כימי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Finney, L. A., Jin, Q. Preparing… More

Finney, L. A., Jin, Q. Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation. J. Vis. Exp. (97), e52370, doi:10.3791/52370 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter