Abstract
このプロトコルは、マウスのリブを利用した大規模な骨修復のための新しいモデルに研究者を紹介しています。 、周囲の肋間筋から目的の肋骨を露出させ、胸部体壁を開いて気胸を誘発することなく、リブの所望の部分を切除し、切開部を閉じる、手術のための動物の準備：手順は、以下の詳細を示します。四肢骨格の骨と比較すると、リブは非常にアクセス可能です。また、全く内部または外部固定器は、隣接するリブは自然な固定を提供するので必要ありません。手術は、市販品を使用して、学ぶことは簡単であり、そして動物によって十分に許容さ。手順は、または周囲の骨膜を除去することなく行うことができるので、修理の骨膜の寄与を評価することができる。 2ヶ月 - 結果は、骨膜が保持されている場合、強固な修復が1で発生したことを示している。私たちは、このプロトコルの使用が期待リブの補修に及び所見は体の周りの他の場所で骨修復を刺激するための新しい方法の開発を容易にするような研究を刺激する。
Introduction
骨格傷害、慢性変形性関節症を衰弱させる、と再建手術に関連した重大な問題は、経済生産性、家族の幸福、そして生活の質に影響を与える。小休憩と病変がかなりよく癒すことができますが、人間は大きな欠陥を修復することができないため、構造と機能を回復するために再建手続きに頼らなければならない。復興は、同種またはheterogeneic移植片、morcellized骨、移植された足場、または伸延骨形成を伴ってもよい。残念ながら、だけでなく、これらの治療法はなく、修復骨の本来の強さはほとんど達成されていないに関連した永続的な罹患率の要因があります。このため、新たな臨床アプローチが必要とされている。
分節欠損を治療するための革新的な方法を開発する一方向は、大規模な修復が天然に存在する状況を研究することである。哺乳類が目に限定されると考えている間に両生類は有名、骨格要素を再生成することができます能力である。しかし、20 世紀の初頭以来、人間のリブにおける再生の報告はほとんど人間が1-4そのように限定されないかもしれないことを示唆して発表されている。現在、この現象は、最高の顎、顔、耳再構成のために隔壁材料を使用する外科医に知られているが、それは、より広く5が認識されない。より詳細には、この修復を研究するために、我々は、マウスを使用して、外科的モデルを開発した。このプロトコルを使用して、研究者は、関連する生来の因子を特定し、他の場所で骨治癒を促進するためにこの情報を使用することができる。
骨修復を研究するためのモデルとしてのリブを使用することには多くの利点がある。 （大腿骨6,7の切除と比較して）まず、周囲のリブは自然な固定器を提供する。これは、内部と外部固定の罹患リスクを減少させ、手術手順を簡素化します。胸のWAの第二に、薄い筋肉層LL頭蓋冠切除8の利便性の検定に匹敵する簡単なアクセスと優れた視認性を提供する。第三に、膜内骨化によってその形、軟骨内骨化によってリブ形と中央骨幹のいずれかの端部に位置する成長板に拡張を介して長さに成長する頭蓋冠とは対照的である。そのため、リブの修理は、四肢骨格の長骨の修理により匹敵し得る。さらに、我々は、大腿骨と比べて、リブの骨膜が厚く、より簡単に操作することができることを見出した。このように、骨膜を研究または細胞治療、薬理学的薬剤、および/または組織足場をテストする目的で、骨修復を検定したい研究者らは、この外科的モデルが役に立つでしょう。要約すると、このリブ切除モデルは、一般的に使用されるそのようなモデルは、現在存在しないように、哺乳動物において天然の大規模骨修復を研究するためにその中にコンテキストを提供する。
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Protocol
注：すべての手順は、南カリフォルニア大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認された動物のプロトコルに従っている。
外科1.準備
- 必要な手術器具や消耗品（滅菌、アイテム1 - 材料のリストの18）をレイアウトし、フード内やダウンドラフトテーブルの上に解剖顕微鏡および光ファイバトランスイルミを手配。
- 麻酔を誘導するために、4％イソフルランで誘導チャンバー内に（3ヶ月 - - 30グラム、1〜20）性的に成熟したマウスを置きます。
- 足および/またはテールピンチテストで麻酔を確認してください。
- 手術中に目の乾燥を避けるために、マウスの目に軟膏を適用します。
- 顕微鏡ステージにマウスを移動します。メンテナンスホースのノーズコーンにマウスを置き、横方向に配置する。体温を維持するために動物に隣接した温暖化ポーチを提供します。
NOTE：マウスの位置は個人的な好み、および/または外科医の利き手に依存している、左または右のいずれかの側は問題ありません。 - メンテナンスのため、3％、および呼吸数を見て - 2にイソフルランを調整します。
- 25 G針を有する手術後の痛みのためにブプレノルフィン（0.05 mg / kgを）皮下（脚の横脇腹）を注入します。脚部は正常な反応であるけいれんがあります。
2.オープニング切開
- 触診が希望するリブを検出し、シェーバーで毛のエリアをクリア。
注：リブ1-7が肺に近いと11-13がかなり短いので、リブ8-10を推奨します。肋骨を数えるのは数1のような最も吻側リブで始める必要があります。 - （3Xは、多くの場合、動物使用プロトコルによって推奨）ポビドンヨードとイソプロパノール（70％）スワブを交互にエリアを準備します。
- 真上中小マイクロサージェリーのはさみで希望の肋骨に平行、皮膚を介して2cmの切開をカット。 Incis下の筋肉と脂肪の層を介して電子。
- 切開部のサイズを最小限に抑えながら、手術領域を露出させるために開創器にすべての3つの層（皮膚、筋肉、脂肪）を配置します。
3.リブを切除
- 5.0ミリメートルのメスでリブの所望の部分の上にある肋間筋を切断。リブとして非常に湾曲していない場合に、このようなchondrocostal共同の5 mmの近位の周りのこの切開がある。慎重に先端の細いピンセットで骨から筋肉を分離する。
- 動物に骨膜を保持しながら、切除を作成するために、5.0ミリメートルメスとリブの長さに沿って、骨膜を切断。慎重に先端の細い鉗子で横方向に下にある骨から骨膜を分離する。骨膜は非常にデリケートですし、ゼラチン状の一貫性を持っていたように、注意して進みます。
- 次に細かいマイクロハサミで一方の端部に骨の断面を作る。必要に応じて、との切除を測定顕微鏡や定規タイプのゲージでレチクル。その後、慎重に骨膜から骨を持ち上げ、もう一方の端をカット。
注：慎重に進みます。これは胸膜を引き裂くと気胸になります下の肋骨を切除せずに引き上げなど、ほとんどの繊細なステップ、である。胸膜が破れた場合胸腔の内部が見えるようになるので、これは容易に明らかであろう。 - 出血を止めるために5秒 - 出血が骨の切断の結果として発生した場合、4用綿棒との切断端に圧力をかける。
注：出血が続くことをまれに、それはかなりの血液損失が回復が損なわれるように動物を停止し、安楽死が必要な場合があり（流体を交換することなく、安全に失われることができる最大血液量は、全血液容量の10％であるまたは7.7 - 。）を200μl9 - 8μL/ gの25グラムのマウスの場合、これは約180に相当します。 - すぐにに削除されたリブを配置今後の分析のために4％PFA。
注：骨と骨膜の両方の切除を行うべきである場合、骨膜切開分離（ ステップ3.2）を省略する。骨膜は非常に緊密胸膜に取り付けられているのでティアリングを回避するために、ピンセットで離れて胸膜から肋骨をからかって、慎重に進んでください。
4.切開を閉じる
- 9-0縫合糸（2縫合糸は通常十分です）と残りの骨膜スリーブの上に肋間筋を縫合。手術の場所のための指標として機能するように、直接、リブの切断端の上に縫合糸を配置します。
- 開創器を取り外します。 （ - 4縫合通常は十分である3）9-0縫合糸で覆っている筋肉と脂肪を縫合。筋肉および/ または脂肪の特に厚い層を有するマウスでは、個別の層を縫合（ 例えば、筋肉層の縫合糸の1層および脂肪層のための縫合糸の1層）。
- 閉じ（ - 5縫合糸、通常は十分であり、4）は7-0縫合糸で皮膚。
- 大鉗子で一緒に端をつまんで、縫合糸接着剤で切開を固定します。
- ゆっくりと最初の数分間、1％に調整することで、オフイソフルランマウスを離乳してからオフにしてください。
- 10分 - 、5加熱ランプ下にマウスを置き、意識が回復されるまで残す。意識が回復した後、治癒期間中、マウスが移動し、正常に歩き回ると苦痛の兆候を示さないはずである。
5.回復と分析
- 0.5ミリグラムの経口ゼラチン状のブプレノルフィンの投与を含む術後疼痛管理を提供/ 48時間ごとに12時間をキロ。経口投与は、胸部に痛みを引き起こす可能性が動物を拘束する必要はありません。
- 治癒期間中に食物と水を自由にケージにマウスを維持します。切開が乾燥した後、雌の動物は、雄ながら同時収容することができるsは戦いを防ぐために分離したままにします。
- 治癒期間の後、安楽死のために承認された手順に従ってください。固定および分析のために胸郭を削除します。
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Representative Results
動物は、一般的に切開がうまく癒す、このプロシージャからすぐに回復し、動物は正常な挙動を示す。手順は、市販品を使用して練習した後、1時間の下で完了させることができる。実験データを生成するために、この手順を使用する前に、任意の大きい骨片を切除ゾーン内に残っているかどうかを判断するために、0日目の時点で切除を分析することが重要である。これは、典型的には、特別な放射線安全承認を必要とするであろうが、適切な手順を評価する一つの方法は、術後X線またはマイクロCT画像化によって動物を評価することである。代わりに、別の単純な評価は、 図1Aに示されるように、骨格染色の準備を行うことによって完了することができる。これは標準的なプロトコル11を使用して、アリザリンレッドで、胸郭を収集EtOHにそれを固定し、染色が含まれます。これは、股関節のように（軟組織を離れて消化するために使用される）、水酸化カリウムを省略することが有用であり得る所望であれば、サンプルトンまだ組織学的分析のために後で使用することができる。重なる体壁筋層が薄いため、試料は、依然として80％グリセロール中にクリアすることにより水酸化カリウム工程なしに視覚化することができる。ここに示されている（ 図1A）のようにまたは代わりに、これらの筋肉は、固定/染色の前に手動で除去することができる。
除去された骨の部分も分析することができる。目標は、動物における骨膜を保持した場合には、光学顕微鏡および組織学的分析（ 図1B、B '）によって可視化されるように、骨部分は、滑らかな表面を有するべきである。骨膜を除去した骨部分が明確に不揃いな表面を有し、組織学的検査に基づいべき密集不規則な結合組織（ 図1C、C '）の特性を有する無傷の上層骨膜層を有する。
実験の目的に応じて、治癒が可能異なる時点で評価した。 2ヶ月 - 観察は骨膜が動物内に保持された3mmの切除は、典型的には、1内に完全に治癒することを示している。修理は、ソフトとハードカルスの形成、および再構築を介して生じる。 2ヵ月の時点で完全な修復の例を図2A、A 'に示されている。修復は骨格の調製（ 図2A）および組織学的分析（ 図2A '）によって評価することができる。骨膜も除去された場合、切除ギャップに充填されることはない。 図2Bは、いくつかの修復が一端で発生した例を示したが、それは、平滑末端を観察することがより典型的である。組織学的分析の際、切除ゾーンは、脂肪、肉芽組織、および筋肉（ 図2B '）が充填されている。
骨膜とない切除図2.リブ修理後の治癒 。切除後の治癒の〜2ヶ月以下の（A）は、骨格の準備、（ 図1Aのように調製）は、マウス内部にそのまま骨膜を保持。領域の完全な修復を観察することができる。 （A '）の組織学的層板骨壁の回復を示すBの部分と骨髄腔（ヘマトキシリンおよびエオシン）。リブ部と周囲の骨膜の両方を除去した後の治癒の〜3ヶ月以下の（B）は、骨格の準備（アリザリンレッド）。パネルの左に示す切断端での唯一の最小修復がありました。 chondrocostal関節に黄色の矢印のポイント。 （B '）切除（ヘマトキシリンおよびエオシン）の部位を充填する肉芽組織、脂肪および筋肉細胞を示すBの組織学的セクション。スケールバー：A、B = 1ミリメートル。 B '= 500程度。 C '=200μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
最初のこのプロトコルを学習するとき、どこに挑戦することができます最初の切開を見つけるには、決定する。しかし、安楽死させたマウスでの練習は、外科医が最初の切開を置き、切除されるべき所望のリブを公開する場所を学ぶことができます。死体に作業することも骨膜の有無にかかわらずリブ部分を除去するために必要な細かい運動能力を向上させます。また、この手順に新しい誰かが困難に細かいツールと薄い縫合糸を操作するかもしれません。オフ抱き合わせながら、余分な縫合糸を引っ張ると組織を引き裂くことができる。このように、死体にもいくつかの練習の縫合は有用である可能性があります。外科医はげっ歯類での外科的処置に新規の場合最後に、もう一人は、最初の数の手術中に麻酔を監視し、調整を支援持っていると便利な場合があります。
このプロトコルの最も重要なステップは、胸膜スパで気胸（空気の異常なコレクションを誘発することなく、骨を切除されている胸膜は、外科的に閉じることが薄すぎるので、マウスで治療が困難であるのce）。リブに劣る筋肉と壁側胸膜の層が非常に薄く、デリケートです。従って、正確な動きは、切除領域の下にある胸膜中に穿刺を防止するために必要とされる。これはステップ3.1と3.3で最も一般的に発生する。ポイントは表面的に保たれていない場合にステップ3.1（周囲の肋間筋からの骨を分離する）には、鋭いメスを鉗子を簡単に胸膜層を貫通します。ステップ3.3（細かい微細はさみで骨を切除する）、骨の下にはさみの配置は、胸膜の引張強さを克服することができる、または骨を破壊する作用は、骨片の端部が穿孔させてもよい胸膜。我々は、湾曲した先端部を有する微細なマイクロハサミを使用することが有益であることを見出した。また、上記のように、それはまた、最初に安楽死させたマウスにプロトコルを実施するのに有用であり得る。 Ultimately、しかし、我々は、この問題は簡単に忍耐と実践により克服できることを見出した。
リブは軟骨内骨ですが、リブスケルトンと四肢骨格の長骨の間にいくつかの潜在的に重要な違いがあるかもしれません。発生学的観点から、リブ骨格が体肢骨格（側板中胚葉）12とは異なる胚葉コンパートメント（体節）に由来する。したがって、進化の歴史の違いを反映しているリブの骨格前駆細胞に固有な特性があることが可能である。したがって、長期的には、これらの独特の性質が何であるかを決定し、その後、リブに見られるように、同じ施設で修復を媒介するために四肢骨格前駆細胞を奨励するために、この情報を使用する必要があるかもしれない。
場に出た別の態様は、呼吸器系に関連して、リブの位置に関係する。アル隣接するリブは、外部固定器が必要とされないように切除の周囲に十分な安定性を提供しますが、修理ゾーンは肺の膨張/収縮の一定の動きとひずみの下にある。これは、いくつかの運動は軟骨中間13,14を生成するために重要であると思われる一方、骨の修復中に、あまりにも多くの動きが治癒の阻害であり得ることが認識されている。この時点で、しかし、それは中間軟骨の形成を効果的大規模修復のための重要なステップである可能性がある、明確ではない。 （骨膜が動物に残されている場合）このように、呼吸時のリブの動きは、修理を容易にすることがあります。運動は、この文脈において特に重要であるので、固定器を配置する方法を開発することが、将来的に修復に対する生体力学的影響を研究するために有用であり得る。
マウスリブ修復アッセイを行うことにより、一DEVEれている強力な遺伝子ツールを活用することができloped。例えば、トランスジェニックマークを使用して、修復細胞の起源を評価することができる。骨形成（興味深い新たなツールの開発でGazit ら 15,16）から、軟骨内プロセス、および重要なシグナル伝達経路の読み出しのためのトランスジェニックレポーターは12,17を利用することができる。さらに、機能喪失対立遺伝子を有するマウスは、必要なシグナル伝達経路を決定するために使用することができる。現時点では、他の脊椎動物モデル生物は、このプロセスの基本的な基礎となる生物をプローブするために遺伝子技術のような多種多様なことができない。
骨修復のための他の優れたモデルが開発され、しばらくの間使用されている間に加えて、リブの補修の特徴を考慮した足場は、化合物、および細胞療法を試験するための別のコンテキストが有益であり得る。リブは、本体と、修復をサポートするために必要とされないように、標準リブ修復モデルの確立は、既存のモデルを補完安定化せずに発生します。また、修理の骨膜の寄与を容易に評価することができる。リブは、軟骨および骨の両方のセグメントを有するのでFuthermoreは、これらの異なるが関連する組織タイプの治癒の間の比較は有効な修理18の共通の特徴を識別することができる。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium sized micro-dissection scissors (Vannas-Tübingen Spring Scissors 5 mm) | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Fine micro-dissection scissors (Vannas Spring Scissors - 2mm Cutting Edge) | Fine Science Tools | 15000-04 | curved tip is beneficial |
| Micro-scalpel 5.0 mm | Fine Science Tools | 10315-12 | other fine scalpels can be substituted |
| Dumont 55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Retractor | Fine Science Tools | 17004-05 | adjustability is convenient |
| Micro-needle holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| 9.0 nylon sutures (Ethilon), taper point best | Ethicon | 2819G or similar | taper point best but reverse cutting is also good |
| 7.0 prolene sutures (Prolene) | Ethicon | 8700H or similar | 6-0 can be used too, needle point can vary |
| Large forceps (Adson Forceps) | Fine Science Tools | 11006-12 | other brands are fine |
| Lubricant Eye Ointment (Akwa Tears) | Akorn | 17478-062-35 | |
| Suture glue (GLUture Topical Tissue Adhesive) | Abbot | 32046-01 | has excellent working time |
| Shaver | Wahl | 9918-6171 or similar | |
| Clamp lamp | Zoo Med | LF-5 | |
| Infrared Bulb, 75W | Zoo Med | RS-75 | |
| RC2 Rodent Anesthesia System | VetEquip | 922100 | |
| IsoFlo (Isoflurane) | Abbot | 05260-05 | |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser | 12496-0757-1 | |
| Betadine | Purdue Frederick | 67618015017 | |
| Flavored Gelatin, raspberry | Jell-O | B000E1FYL0 | made up firm, to the consistency of 'jigglers' |
References
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