Um procedimento cirúrgico para ressecção do mouse Rib: Um Modelo de Grande Escala Repair longo osso

Abstract

Este protocolo introduz investigadores para um novo modelo de grande escala reparação óssea utilizando a costela mouse. O procedimento detalha o seguinte: preparação do animal para a cirurgia, a abertura da parede torácica corpo, expondo a costela desejado a partir dos músculos intercostais circundantes, extirpando a seção desejada da costela sem induzir um pneumotórax, e fechar as incisões. Em comparação com os ossos do esqueleto apendicular, as nervuras são altamente acessível. Além disso, não fixador interno ou externo é necessário uma vez que as nervuras adjacentes proporcionam uma fixação natural. A cirurgia utiliza comercialmente fornecimentos disponíveis, é fácil de aprender, e bem tolerado pelo animal. O procedimento pode ser realizado com ou sem a remoção do periósteo circundante, e, por conseguinte, a contribuição do periósteo ao reparo pode ser avaliada. Os resultados indicam que, se o periósteo é retida, reparação robusta ocorre em 1-2 meses. Esperamos que o uso deste protocoloestimular a pesquisa em reparação de costela e que os resultados irão facilitar o desenvolvimento de novas formas de estimular a reparação óssea em outras localidades ao redor do corpo.

Introduction

Debilitante lesão esquelética, artrose crônica, e os graves problemas associados com a cirurgia reconstrutiva impactar a produtividade econômica, o bem-estar da família e qualidade de vida. Enquanto pequenas pausas e lesões podem curar razoavelmente bem, os seres humanos não são capazes de reparar defeitos grandes e, portanto, deve contar com procedimentos reconstrutivos para restaurar a estrutura e função. Reconstrução pode envolver transplante alogênico ou heterogeneic, osso morcellized, andaimes implantados, ou distração osteogênica. Infelizmente, não só existem fatores de morbidade persistentes associados a esses tratamentos, mas a força original do osso reparado é raramente alcançada. Assim, são necessárias novas abordagens clínicas.

One-way para desenvolver métodos inovadores para o tratamento de defeitos segmentares é estudar as situações em que o reparo em grande escala ocorre naturalmente. Anfíbios famosa pode regenerar elementos esqueléticos, enquanto os mamíferos são considerados limitados em thé a capacidade. No entanto, desde o início do ^século 20, alguns relatos de regeneração na costela humana foram publicados sugerindo que os humanos não podem ser tão limitado ^1-4. Atualmente este fenômeno é mais conhecido por cirurgiões plásticos que utilizam material de costela para queixo, rosto e orelha de reconstrução, mas não é mais amplamente apreciada ^5. Para estudar este reparo em mais detalhes, nós desenvolvemos um modelo cirúrgico usando o mouse. Usando este protocolo, os pesquisadores podem identificar os fatores inatos envolvidos e usar essa informação para facilitar a cicatrização óssea em outras localidades.

Há muitas vantagens em usar as costelas como um modelo para o estudo de reparação óssea. Em primeiro lugar, as nervuras circundantes proporcionar um fixador naturais (como comparado a ressecção do fémur ^6,7). Isso diminui o risco de morbidade de fixadores internos e externos e simplifica o procedimento cirúrgico. Em segundo lugar, as camadas musculares finas dos wa peitovai fornecer para fácil acesso e excelente visibilidade que fazer o ensaio comparável à conveniência de ressecções calota craniana ^8. Em terceiro lugar, em contraste com a calvárias que formam por ossificação intramembranosa, a forma de nervuras ossificação endocondral e crescer em comprimento por meio de extensão em placas de crescimento localizadas em cada extremidade de uma diáfise central. Portanto, a reparação das costelas pode ser mais comparável ao reparo dos ossos longos do esqueleto apendicular. Além disso, verificou-se que em comparação com o fémur, no periósteo da nervura é mais espessa e pode ser mais facilmente manipulado. Assim, os investigadores que desejam para ensaiar a reparação óssea com a finalidade de estudar o periósteo ou testar terapias celulares, agentes farmacológicos, e / ou suportes de tecido podem encontrar este modelo cirúrgico útil. Em resumo, este modelo de ressecção de costela fornece um contexto no qual a estudar reparação óssea em grande escala natural em mamíferos como existe tal modelo em uso geral existe atualmente.

Protocol

NOTA: Todos os procedimentos estão em conformidade com um protocolo de animais aprovado pelo cuidado e uso Comitê de animal Institucional (IACUC) da Universidade do Sul da Califórnia.

1. Preparação para a cirurgia

1. Separe as ferramentas e suprimentos cirúrgicos necessários (esterilizado, itens 1-18 na lista de materiais) e organizar um microscópio de dissecação e uma fibra óptica trans-iluminador em uma capa ou em uma mesa de corrente descendente.
2. Coloque um rato sexualmente maduros (20-30 g, 1-3 meses de idade) em uma câmara de indução com 4% de isoflurano para induzir a anestesia.
3. Confirme a anestesia com uma pata e / ou teste de cauda pitada.
4. Aplicar pomada para os olhos do rato para evitar o ressecamento do olho durante a cirurgia.
5. Mova o rato para o estágio do microscópio. Posicione o mouse para dentro do cone do nariz da mangueira de manutenção e posicionar lateralmente. Proporcionar uma bolsa de aquecimento adjacente ao animal para ajudar a manter a temperatura corporal.
   NÃOE:. Posição do rato é dependente de preferência pessoal e / ou destreza manual do cirurgião, do lado esquerdo ou direito está bem.
6. Ajuste isoflurano a 2 - 3% para manutenção, e assistir a freqüência respiratória.
7. Injectar buprenorfina (0,05 mg / kg) subcutaneamente (flanco lateral da perna) para a dor pós-operatória com uma agulha 25 G. A perna pode contorcer-se que é uma resposta normal.

Incision 2. Abertura

1. Detectar a costela desejado por palpação, e limpar a área de cabelo com uma máquina de barbear.
   NOTA: Reforços 8-10 são recomendados desde costelas 1-7 estão mais próximos dos pulmões e 11-13 são consideravelmente mais curto. Contando as costelas deve começar com a costela mais rostral como número 1.
2. Preparar a área alternando com povidona-iodo e de isopropanol (70%) raspagem (3x é frequentemente recomendada pelos protocolos de utilização de animais).
3. Corte de 2 cm da incisão através da pele, directamente por cima e paralela à nervura desejado com uma tesoura de microcirurgia e média dimensão. IncÉe através das camadas musculares e adiposas subjacentes.
4. Coloque todos os três camadas (pele, músculo, gordura) em um retractor para expor o local cirúrgico, minimizando o tamanho da incisão.

3. excisão do Rib

1. Corte através dos músculos intercostais que recobrem a seção desejada da costela com um bisturi 5,0 milímetros. Posição esta incisão de cerca de 5 mm proximal à articulação do condrocostais como este é onde a costela não é tão altamente curvado. Separe cuidadosamente o músculo do osso com uma pinça de ponta fina.
2. Para criar uma ressecção, mantendo o periósteo no animal, por meio de corte do periósteo, ao longo do comprimento da nervura com um bisturi 5,0 milímetros. Separe cuidadosamente o periósteo do osso subjacente lateralmente com uma pinça de ponta fina. Proceda com cuidado, como o periósteo é muito delicada e tem uma consistência gelatinosa.
3. Em seguida, faça um corte transversal através do osso numa extremidade com micro-tesouras finas. Se necessário, medir a ressecção comum retículo no microscópio ou um medidor tipo régua. Em seguida, levantar cuidadosamente o osso para fora do periósteo e cortar na outra extremidade.
   NOTA: Proceda com cuidado. Esta é a etapa mais delicada, como puxar para cima sem excisão do costela abaixo vai rasgar a membrana pleural e resultar em um pneumotórax. Se a membrana pleural é rasgada este será facilmente evidente como o interior da cavidade torácica, tornam-se visíveis.
4. Se o sangramento ocorre como um resultado de corte do osso, aplicar pressão na extremidade de corte com um cotonete para 4-5 segundos para parar a hemorragia.
   NOTA: Nas raras ocasiões em que o sangramento continua, pode ser necessário parar e sacrificar o animal a perda de sangue tão significativa comprometerá recuperação (sem reposição de líquidos, o volume máximo de sangue que pode ser seguramente ser perdido é de 10% do volume total de sangue ou 7.7 -. 8 mL / g para 25 g um rato, isso é equivalente a cerca de 180-200 mL ^9).
5. Colocar imediatamente a nervura removido emPFA 4% para análise futura.
   NOTA: Se a ressecção de ambos os ossos e do periósteo é para ser realizada, omitir o periósteo incisão e separação (passo 3.2). Desde o periósteo é muito bem ligado à membrana pleural proceder com cautela, provocando a costela longe da membrana pleural com uma pinça para evitar rasgos.

4. fechar a incisão

1. Suturar os músculos intercostais ao longo do topo da manga periosteal remanescente com 9-0 suturas (2 suturas são geralmente suficiente). Coloque as suturas diretamente acima das extremidades cortadas do costela, para atuar como indicadores para o local da cirurgia.
2. Remover o afastador. Suturar o músculo e gordura sobreposta com 9-0 suturas (3-4 suturas são normalmente suficientes). Em ratinhos com camadas particularmente espessas de músculo e / ou a gordura, suturar cada camada em separado (por exemplo, uma camada de fios de sutura para a camada muscular e uma camada de suturas para a camada de gordura).
3. Feche opele com 7-0 (4-5 suturas são normalmente suficientes).
4. Fixe a incisão com cola de sutura, apertando as bordas junto com grandes fórceps.
5. Lentamente desmamar o mouse para fora isoflurano ajustando primeiro a 1% por alguns minutos e, em seguida, desligue.
6. Posicione o mouse sob uma lâmpada de fogo e deixe até que a consciência é recuperada, 5 - 10 min. Depois de consciência é recuperada e durante todo o período de cicatrização, o rato deve mover-se e deambular normalmente e não mostram sinais de angústia.

5. Recuperação e Análise

1. Fornecer o manejo da dor pós-operatória, incluindo a administração de buprenorfina de forma oral de gelatina a 0,5 mg / kg a cada 12 horas para 48 horas. A administração oral não necessita de prender o animal que pode causar dor na região torácica.
2. Manter o rato em uma gaiola com livre acesso a comida e água durante o período de cicatrização. Após a incisão é seca, as fêmeas podem ser co-macho alojados enquantos deve permanecer isolada para evitar lutas.
3. Após o período de cicatrização, siga o procedimento aprovado para a eutanásia. Retire a caixa torácica para fixação e análise.

Representative Results

Animais tipicamente recuperar rapidamente a partir deste procedimento, a incisão cura bem, e os animais exibem comportamento normal. O procedimento utiliza fontes comercialmente disponíveis e após a prática, pode ser concluído em menos de 1 hora. Antes de usar este procedimento para gerar os dados experimentais, é importante analisar a ressecção no dia 0 ponto de tempo para determinar se os fragmentos de ossos grandes pode permanecer na zona de ressecção. Uma forma de avaliar o procedimento adequado é avaliar os animais por raios-X ou imagem microCT no pós-operatório, embora isso tipicamente requer autorizações especiais de segurança radiológica. Em vez disso, outra avaliação simples pode ser concluído através da realização de uma preparação coloração esquelético, como ilustrado na Figura 1A. Isso envolve a coleta de caixa torácica, fixando-a em EtOH, e coloração com vermelho de alizarina usando um protocolo padrão ^{de 11.} Pode ser útil para omitir o hidróxido de potássio (utilizado para digerir longe dos tecidos moles), de modo that ainda a amostra pode ser utilizada depois para análise histológica, se assim for desejado. A amostra ainda pode ser visualizado sem os passos de hidróxido de potássio, limpando em glicerol a 80% porque a camada muscular da parede do corpo sobrejacente é fina. Ou, alternativamente, estes músculos pode ser removido manualmente antes da fixação / coloração como é mostrado (Figura 1A).

A porção de osso removido também podem ser analisados. Se o objectivo era manter o periósteo no animal, a porção de osso deve ter uma superfície lisa como visualizado por microscopia óptica e análise histológica (Figura 1B, B '). Uma porção de osso removido com o periósteo deve ter uma superfície irregular e distintamente mediante exame histológico tem uma camada de periósteo sobrejacente intacto, que tem as características de um tecido conjuntivo irregular denso (Figura 1C, C ').

Dependendo do objectivo do ensaio, a cura pode seravaliada em diferentes pontos de tempo. As observações indicam que 3 mm em que as ressecções do periósteo é retida no animal tipicamente curar completamente dentro de 1 - 2 meses. Reparação ocorre através da formação de um calo mole e duro, e de remodelação. Um exemplo de reparação completa em 2 meses é mostrado na Figura 2A, A '; reparação pode ser avaliada pela preparação do esqueleto (Figura 2A) e análise histológica (Figura 2A). Se o periósteo também é removido, a abertura ressecção nunca é preenchida. A Figura 2B mostra um exemplo em que alguma reparação ocorreu em uma extremidade, no entanto, é mais típico observar extremidades cegas. Após a análise histológica, a zona de ressecção é preenchido com adiposo, tecido de granulação, e músculo (Figura 2B).

(A) Ilustração de uma ressecção de costela (4.5 mm) recolhidos imediatamente após a cirurgia. Não há fragmentos de ossos são deixados para trás. A amostra foi corada com vermelho de alizarina (utilizando um protocolo padrão, mas omitindo quaisquer passos com hidróxido de potássio para preservar a amostra para futura análise histológica) e aclarado em 80% de glicerol. As setas indicam a localização das extremidades cortadas. (B) porção de costela Removido da caixa torácica representado na (A) sem o periósteo anexado. (B ') Corte histológico mostrando periósteo mínimo fixados ao osso (setas amarelas, à esquerda) e sem periósteo para a direita (seção transversal, coradas com HE). O asterisco indica o amarelo cavidade da medula óssea. Rato costelas não tem extensa trabeculae. (C) porção de costela Removido mostrando o periósteo ainda ligado. (C ') histológica seção shoasa do periósteo intacto que recobre o osso indicado por uma faixa amarela (seção longitudinal, corado com HE). Um asterisco amarelo indica a cavidade da medula óssea. Barras de escala: A, B, C = 1 mm; B ', C' = 100 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. reparação Rib pós-cura em ressecções com e sem o periósteo. (A) a preparação do esqueleto seguinte ~ 2 meses de cicatrização após a ressecção, mantendo intacto o periósteo no interior do rato (preparado tal como na Figura 1A). Correção total da região podem ser observadas. Corte histológico de B mostrando uma restauração das paredes e do osso lamelar (A ')cavidade da medula óssea (hematoxilina e eosina). (B) a preparação Skeletal (alizarin vermelhos) após ~ 3 meses de cicatrização após a remoção de ambos uma porção de costela e do periósteo circundante. Houve apenas reparação mínima na extremidade de corte mostrado no lado esquerdo do painel. A ponta de seta amarela aponta para a articulação condrocostais. (B ') Corte histológico de B mostrando tecido de granulação, adiposo e células musculares de enchimento no local da ressecção (HE). Barras de escala: A, B = 1 mm; B '= 500 mm; C '= 200 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Quando aprendendo este protocolo, determinando onde localizar a incisão inicial pode ser um desafio. No entanto, a prática em ratos sacrificados ajuda o cirurgião saber onde colocar a incisão inicial e expor a costela desejado a ser ressecado. Trabalhando em cadáveres também melhora as habilidades motoras fine-necessárias para remover a porção de costela com ou sem o periósteo. Além disso, alguém novo para este procedimento pode encontrar manipular as ferramentas finas e suturas finas para ser difícil. Enquanto amarração, o excesso de puxar a sutura pode rasgar os tecidos. Assim, de alguma prática de sutura também em cadáveres poderia ser útil. Finalmente, se o cirurgião é novo para procedimentos cirúrgicos com roedores, pode ser útil ter uma outra pessoa contribuir para a monitorização e ajuste da anestesia durante as primeiras cirurgias.

A etapa mais importante deste protocolo é extirpar o osso sem induzir um pneumotórax (um acúmulo anormal de ar no spa pleuralce), que é difícil de tratar no rato uma vez que a membrana pleural é demasiado fina para fechar cirurgicamente. A camada de músculo e pleura parietal inferior ao da nervura é muito fina e delicada; Assim, movimentos precisos são necessários para evitar uma punção na membrana pleural, que se situa abaixo da área de ressecção. Isso ocorre mais comumente nos passos 3.1 e 3.3. No passo 3.1 (separando o osso dos músculos intercostais circundantes), o bisturi afiado e fórceps facilmente perfurar a camada pleural se o ponto não é mantido superficial. No passo 3.3 (excisão do osso com micro-tesouras finas), a colocação da tesoura sob o osso pode superar a resistência à tracção da membrana pleural, ou a acção de quebrar o osso pode causar a extremidade do fragmento de osso para perfurar a membrana pleural. Nós descobrimos que a utilização de micro-tesouras finas que têm uma ponta curvada é benéfico. Além disso, como acima, pode também ser útil para a prática do protocolo primeiro em ratinhos submetidos a eutanásia. Ultidamente, no entanto, descobrimos que este problema pode ser facilmente superados com paciência e prática.

Embora a nervura é um osso endocondral, pode haver algumas diferenças potencialmente importantes entre o esqueleto de reforço e os ossos longos do esqueleto apendicular. Do ponto de vista embriológico, o esqueleto nervura é derivado a partir de um compartimento diferente mesodérmica (somitos) do que o esqueleto apendicular (lateral mesoderme) ^12. Assim, é possível que existam propriedades que são exclusivas para as costelas do esqueleto progenitores que refletem essa diferença na história do desenvolvimento. Por isso, no longo prazo, pode ser necessário para determinar o que estas propriedades únicas são e, em seguida, usar essas informações para incentivar os progenitores no esqueleto do membro para mediar o reparo com a mesma facilidade como visto na costela.

Outro aspecto que entra em jogo diz respeito à localização das nervuras em relação ao sistema respiratório. Alembora as costelas de acompanhamento proporcionar estabilidade suficiente à volta da ressecção tal que nenhum fixador externo é necessário, a zona de reparação está em constante movimento e tensão de pulmão inflação / deflação. Tem sido reconhecido que, durante a reparação óssea, muito movimento pode ser inibitória para a cura, enquanto algum movimento parece ser importante para a geração de um intermediário de cartilagem ^13,14. Neste momento, não é claro, no entanto, é possível que a formação de um intermediário de cartilagem pode ser um passo-chave para a reparação eficaz em grande escala. Assim, o movimento das nervuras durante a respiração pode facilitar a reparação (quando o periósteo é deixado para trás no animal). Uma vez que o movimento pode ser particularmente importante no presente contexto, o desenvolvimento de um método para colocar um fixador pode ser útil para estudar as influências biomecânicas em reparação no futuro.

Através da realização de um teste de reparação costela no rato, pode-se tirar proveito de poderosas ferramentas genéticas que foram desenvolvido. Por exemplo, usando marcas transgénicos, a origem das células de reparação pode ser avaliada. Repórteres transgénicos para a formação de osso (novas ferramentas interessantes no desenvolvimento de Gazit et ai. ^15,16), o processo endocondral, e a leitura dos importantes vias de transdução de sinal pode ser utilizada ^12,17. Além disso, os ratinhos portadores de alelos de perda de função pode ser usada para determinar as vias de sinalização necessárias. Actualmente, nenhum outro modelo de organismo vertebrado permite uma grande variedade de técnicas genéticas, para sondar a biologia subjacente básico deste processo.

Além disso, enquanto outros modelos excelentes para a reparação óssea foram desenvolvidos e estão em uso há algum tempo, um outro contexto para testar andaimes, compostos, e as terapias celulares, considerando as características de reparação costela pode ser benéfica. O estabelecimento de um modelo de reparação costela padrão complementa modelos existentes como as costelas não são obrigados a suportar o corpo e reparaçãoocorre sem estabilização. Além disso, a contribuição do periósteo a reparação pode ser facilmente avaliada. Futhermore, porque a nervura tem tanto cartilagem e segmentos ósseos, as comparações entre a cura destes tipos de tecidos diferentes, mas relacionadas, podem identificar uma característica comum de reparação eficaz ^18.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medium sized micro-dissection scissors (Vannas-Tübingen Spring Scissors 5 mm)	Fine Science Tools	15003-08
Fine micro-dissection scissors (Vannas Spring Scissors - 2mm Cutting Edge)	Fine Science Tools	15000-04	curved tip is beneficial
Micro-scalpel 5.0 mm	Fine Science Tools	10315-12	other fine scalpels can be substituted
Dumont 55 forceps	Fine Science Tools	11295-51
Retractor	Fine Science Tools	17004-05	adjustability is convenient
Micro-needle holders	Fine Science Tools	12060-01
9.0 nylon sutures (Ethilon), taper point best	Ethicon	2819G or similar	taper point best but reverse cutting is also good
7.0 prolene sutures (Prolene)	Ethicon	8700H or similar	6-0 can be used too, needle point can vary
Large forceps (Adson Forceps)	Fine Science Tools	11006-12	other brands are fine
Lubricant Eye Ointment (Akwa Tears)	Akorn	17478-062-35
Suture glue (GLUture Topical Tissue Adhesive)	Abbot	32046-01	has excellent working time
Shaver	Wahl	9918-6171 or similar
Clamp lamp	Zoo Med	LF-5
Infrared Bulb, 75W	Zoo Med	RS-75
RC2 Rodent Anesthesia System	VetEquip	922100
IsoFlo (Isoflurane)	Abbot	05260-05
Buprenorphine (Buprenex)	Reckitt Benckiser	12496-0757-1
Betadine	Purdue Frederick	67618015017
Flavored Gelatin, raspberry	Jell-O	B000E1FYL0	made up firm, to the consistency of 'jigglers'