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Medicine

마우스 리브를 절제하는 수술 : 대규모 긴 뼈 수리에 대한 모델

doi: 10.3791/52375 Published: January 21, 2015
* These authors contributed equally

Abstract

이 프로토콜은 마우스 리브를 이용하여 대규모 뼈 수리에 대한 새로운 모델 연구원을 소개합니다. 주변 늑간근에서 원하는 리브 노출 흉추 원통 벽을 개방 기흉 유도없이 리브의 원하는 부분을 절개하고, 절개 폐쇄 수술에 대한 동물의 제조 : 절차는 다음과 같은 세부. 팔다리 뼈대의 뼈에 비해 매우 리브 접근 가능하다. 인접한 리브 자연 고정을 제공하기 때문에 또한, 더 내부 또는 외부 고정 장치는 필요하지 않습니다. 수술은 시판 공급 장치를 사용 배우기 간단하고, 동물에 의해 잘 용납입니다. 절차 또는 주변 골막을 제거하지 않고 수행 할 수 있기 때문에 보수 골막에의 기여가 평가 될 수있다. 2 개월 - 결과는 골막이 유지되는 경우, 강력한 수리 (1)에서 발생하는 것을 나타냅니다. 우리는 것이 프로토콜의 사용을 기대리브 수리에 대한 연구를 자극하고 결과는 몸 주위에 다른 위치에서 뼈 수리를 자극 할 수있는 새로운 방법의 개발을 촉진됩니다.

Introduction

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골격 손상, 만성 관절염을 쇠약하게하고, 재건 수술과 관련된 심각한 문제는 경제 생산성, 가족 복지, 삶의 질에 영향을. 작은 휴식과 병변이 상당히 잘 치유 할 수 있지만, 인간의 구조와 기능을 복원 재건 절차에 의존해야하므로 큰 결함을 수리하고 할 수 없습니다. 재건은 동종 또는 heterogeneic 이식, morcellized 뼈 이식 비계, 또는 사지 연장술을 포함 할 수있다. 불행하게도,뿐만 아니라 이러한 치료하지만 수리 뼈의 원래 강도가 거의 달성하지 않습니다와 관련된들이 지속적인 병적 요인이있다. 따라서, 새로운 임상 적 접근 방법이 필요하다.

분절 결함을 치료하는 혁신적인 방법을 개발 일방향 대규모 수리 자연스럽게 발생하는 상황을 연구하는 것이다. 포유 동물이 일에 제한 간주하는 동안 양서류는 유명 골격 요소를 재생성 할 수 있습니다능력이다. 그러나, 20 세기 초반 이후, 인간의 리브의 재생의보고는 적다 인간 그렇게 1-4 한정되지 않을 수 있음을 제안 발표되었다. 현재 이러한 현상은 제일 턱, 얼굴 및 귀 재건 리브 재료를 사용하여 성형 외과 의사에 의해 공지되어 있지만, 5보다 폭넓게 이해되지 않는다. 더 자세하게 수리를 연구하기 위해, 우리는 마우스를 사용하여 외과 적 모델을 개발 하였다. 이러한 프로토콜을 사용하여, 연구자들은 관련된 선천적 요인을 파악하고 다른 위치에서 골격 치유를 촉진하기 위해이 정보를 사용할 수있다.

수리 골격을 연구 모델로서 리브를 사용하는 많은 장점이있다. (6,7 대퇴골의 절제에 비해) 우선, 주변 리브 천연 고정구를 제공한다. 이것은 내부 및 외고정의 이환율의 위험을 감소하고 수술을 단순화합니다. 가슴 워싱턴의 두 번째로, 얇은 근육 층쉽게 액세스 및 두개골 절제술 (8)의 편의에 대한 분석은 비교할 수 있도록 우수한 가시성을 제공 할 것이다. 셋째, intramembranous 골화, 연골 골화에 의한 리브 형태로 구성하고 중앙 골간의 양쪽 끝에있는 성장판의 확장을 통해 길이 성장 calvariae 대조적으로. 따라서, 리브의 수리는 사지 골격의 긴 뼈의 수리에 더 비교 될 수있다. 더욱이, 우리는 대퇴골에 비해, 리브의 골막가 두껍고보다 쉽게​​ 조작 할 수 있음을 발견 하였다. 따라서, 골막을 공부하거나 세포 치료, 약리 에이전트를 테스트 및 / 또는 조직 비계의 목적을 위해 뼈 수리를 분석하고자하는 연구자들은이 수술 모델이 유용 할 수 있습니다. 요약하면,이 리브 절제 모델은 일반적으로 사용하는 이러한 모델은 현재 존재하지 않기 때문에 포유 동물에서 자연 대규모 뼈 수리를 공부하는 내에서 컨텍스트를 제공합니다.

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Protocol

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참고 : 모든 절차가 남부 캘리포니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인 동물 프로토콜에 따라 있습니다.

수술 1. 준비

  1. 필요한 수술 도구 및 소모품의 레이아웃 (1 항목 살균 - 재료 목록 18)과 해부 현미경 및 후드 또는 하강 기류 테이블에 광섬유 트랜스 조명을 정렬합니다.
  2. 마취를 유도하기 위해 4 % 이소 플루 란과 유도 챔버 (3 개월 - - 30 G, 1 ~ 20) 성적으로 성숙한 마우스를 놓습니다.
  3. 발 및 / 또는 꼬리 핀치 테스트 마취를 확인합니다.
  4. 수술 중 안구 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 연고를 적용합니다.
  5. 현미경 단계로 마우스를 이동합니다. 유지 보수 호스의 코 콘에 마우스를 놓고 옆에 위치. 체온을 유지하는 데 도움 동물에 인접한 온난화 파우치를 제공합니다.
    하지E :. 마우스의 위치는 개인 취향 및 / 또는 외과 의사의 손 방향에 따라 달라집니다, 왼쪽 또는 오른쪽 중 어느 쪽이 괜찮습니다.
  6. 유지 보수를 위해 3 %, 그리고 속도를 호흡 시계 - 2 이소 플루 란을 조정합니다.
  7. 25 G 바늘 수술 후 통증 부 프레 노르 핀 (0.05 ㎎ / ㎏) 피하 (다리의 측면 측면)를 주입한다. 다리는 정상 응답 인 트 수 있습니다.

2. 열기 절개

  1. 촉진하여 원하는 리브를 감지하고, 면도기로 머리의 영역을 취소합니다.
    참고 : 갈비뼈 1-7 폐에 근접하고 11-13 상당히 짧은 때문에 갈비 8-10 권장합니다. 갈비뼈를 계산하는 숫자 1과 가장 주동이의 리브와 함께 시작해야한다.
  2. (3 배는 종종 동물 사용 프로토콜에 의해 권장) 포비돈 - 요오드 및 이소프로판올 (70 %) 보라고 번갈아 영역을 준비합니다.
  3. 바로 위에, 피부를 통해 2cm 절개를 잘라 중간 크기의 미세 가위로 원하는 리브 평행. Incis기본 근육과 지방 레이어를 통해 전자.
  4. 절개의 크기를 최소화하면서 수술 영역을 노출 트랙터에 3 층 (피부, 근육, 지방)을 놓습니다.

3. 리브를 절개

  1. 5.0 mm 메스와 리브의 원하는 부분을 덮는 늑간 근육을 잘라. 리브와 같은 높은 곡선 아닌 경우이 같은 chondrocostal 관절 위치 5mm 근위 약이 절개입니다. 조심스럽게 좋은 팁 집게로 뼈에서 근육을 분리합니다.
  2. 동물의 골막을 유지하면서 절제를 만들려면 5.0 mm 메스와 리브의 길이를 따라, 골막을 통해 잘라. 조심스럽게 좋은 팁 집게 옆으로 기본 뼈에서 골막을 분리합니다. 골막은 매우 섬세하고 젤라틴 일관성을 가지고 있으므로주의를 진행합니다.
  3. 다음에 미세한 마이크로 가위 일단 뼈 통한 단면을 만든다. 필요한 경우와 절제를 측정현미경 또는 통치자 형 게이지 레티클. 그런 다음 조심스럽게 골막에서 뼈를 들어 올려 다른 쪽 끝을 잘라.
    참고 :주의를 진행합니다. 이 흉막 막을 찢고 기흉 발생합니다 아래 리브를 절개하지 않고 잡아 당겨 같은 가장 섬세한 작업이다. 흉막 막이 찢어진 경우 흉강의 내부가 보이는 될 것 같은이 쉽게 알 수있을 것입니다.
  4. 출혈을 멈추게하기 위해 5 초 - 출혈이 뼈를 절단의 결과로 발생하는 경우, 4 면봉을 잘라 끝에서 압력을 적용합니다.
    참고 : 드문 경우에 출혈이 계속, 그것은 중지하고 동물 회복이 손상 될 상당한 혈액 손실을 안락사 할 필요가있다 (유체 교체없이, 안전하게 손실 될 수있는 최대 혈액량은 전체 혈액량의 10 % 7.7 -.) 200 μL 9 - 8 μL / g는 25g 마우스의 경우, 이것은 180에 해당합니다.
  5. 즉시로 제거 리브를 배치향후 분석을 위해 4 % PFA.
    주 : 뼈와 골막 모두 절제 행하는 것이라면, 골막 절개 박리 (단계 3.2)을 생략합니다. 골막은 매우 밀접하게 흉막 막에 부착되어 있기 때문에 눈물을 방지하기 위해 집게와 떨어져 흉막 막에서 리브를 괴롭 히고, 조심스럽게 진행합니다.

4. 절개 닫기

  1. 9-0 봉합 (2 봉합은 일반적으로 충분하다)와 나머지 골막 슬리브의 맨 위에 늑간 근육을 봉합. 수술 위치에 대한 지표 역할을 직접 리브의 절단 끝 위의 봉합을 놓습니다.
  2. 견인기를 제거합니다. (- 4 봉합 충분하다 3) 9-0 봉합과 상부의 근육과 지방을 봉합. 근육 및 / 또는 지방 특히 두꺼운 층 쥐에서 별도로 각 레이어를 봉합 (예를 들어, 근육 층의 봉합의 1 층과 지방층을위한 봉합의 1 층).
  3. 닫기(- 5 봉합 충분하다 4) 7-0 봉합사로 피부.
  4. 큰 집게와 함께 가장자리를 곤란, 봉합 접착제 절개를 고정합니다.
  5. 천천히 처음 몇 분 동안 1 %로 조정하여 오프 이소 플루 란 마우스를 탈피하고 전원을 껐다 켜십시오.
  6. 가열 램프 아래에 마우스를 놓고 의식이, 5 회복 될 때까지 남겨 - 10 분. 의식이 회복 된 후 치유 기간 동안, 마우스를 이동하고 일반적으로 ambulate과 고통의 흔적을 보여주지해야한다.

5. 복구 및 분석

  1. 0.5 MG에서 경구 용 젤라틴 형태의 부 프레 노르 핀의 관리를 포함하여 수술 후 통증 관리를 제공 / 48 시간 동안 매 12 시간을 kg. 경구 투여는 흉부 지역에 통증이 발생할 수 있습니다 동물을 억제 할 필요가 없습니다.
  2. 치료 기간 동안 음식과 물을 무료로 액세스 할 수있는 케이지에 마우스를 유지한다. 절개 부위가 건조 후, 여성 동물 남성 동안 공동 수용 할 수있다의 싸움을 방지하기 위해 절연되어 있어야합니다.
  3. 치유 기간이 지나면 안락사에 대한 승인 절차를 따르십시오. 고정 및 분석을 위해 갈비뼈를 제거합니다.

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Representative Results

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동물은 일반적으로 절개가 잘 치유,이 과정에서 신속하게 복구하고, 동물은 정상적인 동작을 나타낸다. 절차는 시판 공급 장치를 사용하고 실시 후, 1 시간에 따라 완성 될 수있다. 실험 데이터를 생성하는 절차를 사용하기 전에, 어떤 큰 뼈 조각이 절제 영역 내에 남아있을 수 있는지 확인 일 0 시점 절제술을 분석하는 것이 중요하다. 이것은 전형적으로 특별한 방사선 안전 승인을 필요로하더라도 적절한 절차를 평가하는 한 가지 방법은, 수술 후 X 선 또는 microCT 촬상 의해 동물을 평가하는 것이다. 대신, 또 다른 간단한 평가는도 1a에 도시 된 바와 같이 골격 염색 준비 수행함으로써 완성 될 수있다. 이것은을 EtOH에 고정, 흉곽를 수집 포함하고, 알리자린 레드 염색 표준 프로토콜 11을 사용. 그것은 그쪽 때문에 (부드러운 조직을 멀리 소화하는 데 사용) 수산화 칼륨을 생략하는 것이 유용 할 수 있습니다원한다면 여전히 표본 t 조직학 분석을 위해 나중에 사용될 수있다. 샘플은 여전히​​ 상부 몸체 벽 근육층 얇기 때문에 80 % 글리세롤 지워서 수산화 칼륨 단계없이 가시화 될 수있다. 여기에 도시 된 (도 1A)는 또는 대안 적으로, 이러한 근육은 고정 / 염색 전에 수동으로 제거 될 수있다.

제거 된 뼈의 부분은 분석 될 수있다. 목표는 동물에서 골막을 유지했다면 광학 현미경 조직 학적 분석 (도 1B, B ')에 의해 같은 시각, 뼈 부분은 매끄러운 표면을 가져야한다. 뚜렷하게 비정형 표면 및 조직 학적 검사에 있어야 골막 뼈 제거 부는 치밀한 결합 조직이 불규칙 (도 1C, C ')의 특성을 갖는 본래 상부 골막 층을 갖는다.

실험의 목적에 따라, 치유 될 수있다상이한 시점에서 평가 하였다. 2 개월 - 관찰 골막은 동물에 유지되는 3mm 절제술은 일반적으로 1에서 완전히 치유 나타냅니다. 수리는 소프트 및 하드 가골의 형성 및 리모델링을 통해 발생합니다. 2개월에서 완전한 복구의 예는도 2a, A '에 도시되어있다; 수리는 골격 준비 (그림 2A) 및 조직 학적 분석 (그림 2A ')에 의해 평가 될 수있다. 골막도 제거되면 절제 갭이 충전되지 않는다.도 2b는 어떤 수리가 일단 발생 된 예를 도시하지만, 평활 말단을 관찰하는 것이 더 일반적이다. 조직 학적 분석에, 절제 영역은 지방, 육아 조직, 근육 (그림 2B ')으로 가득합니다.

그림 1
(A) 그림에서 절제 그림 1. 예제 이미지. 어떤 뼈 조각이 남아 있지 않습니다. 샘플은 80 % 글리세롤에서 클리어 (미래의 조직학 분석을 위해 샘플을 보존하기 위해 수산화 칼륨 모든 단계를 표준 프로토콜을 사용하지만 생략) 알리자린 레드로 염색 하였다. 화살촉은 절단 끝의 위치를​​ 나타냅니다. 부착 된 골막없이 (A)에 도시 흉곽에서 (B) 제거 리브 부분. (B ') 조직 학적 섹션 뼈에 부착 최소한의 골막 (노란색 화살촉, 왼쪽)과 오른쪽없이 골막 (단면를 헤 마톡 실린 및 에오신으로 염색)를 표시합니다. 황색 별표 골 수강을 나타낸다. 마우스 갈비 광범위한 trabeculae이 없습니다. (C) 골막을 보여주는 제거 리브 부분은 여전히 붙어 있습니다. (C ') 조직 학적 섹션 우날개 황색 브래킷 (종단면, 헤 마톡 실린 및 에오신으로 염색)로 나타낸 뼈를 덮는 그대로 골막. 노란색 별표 골 수강을 나타낸다. 스케일 바 : A, B, C는 = 1mm; B ', C'= 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
와 골막없이 절제 그림 2. 립 수리 후 치유. (도 1A에서와 같이 제조) 마우스 내부 골막 그대로 유지 (A)의 치유 절제 후의 1 ~ 2 개월의 골격 제제. 영역의 완벽한 보수가 관찰 될 수있다. (A ') 라멜라 뼈 벽과의 회복을 보여주는 B의 조직 학적 섹션골 수강​​ (헤 마톡 실린 및 에오신). (B) 골격 제제 (알리자린 레드)의 리브 부 및 주변 골막을 모두 제거한 후에 치유의 2 ~ 3 개월 다음. 패널의 왼쪽에 보이는 잘라 끝에서 최소한의 수리가 있었다. chondrocostal 관절에 노란색 화살표를 가리 킵니다. (B ') B 보여주는 육아 조직, 지방, 및 절제 (헤 마톡 실린 및 에오신)의 사이트에서 작성 근육 세포의 조직 학적 섹션. 스케일 바 : A, B는 = 1mm; B '= 500 μm의; C '= 200 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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처음이 프로토콜을 학습 할 때, 어디에서 문제가 될 수있는 초기 절개를 찾을 수 결정. 그러나 안락사 마우스에 연습 외과 의사가 초기 절개를 배치하고 절제 할 원하는 리브 노출 위치를 배울 수 있습니다. 시체에서 작업도 또는 골막없이 리브 부분을 제거하는 데 필요한 미세 운동 능력을 향상시킨다. 또한,이 절차에 새로운 사람이 훌륭한 도구와 얇은 봉합을 조작하는 것은 어려운 할 수없는 경우도 있습니다. 오프 묶는 동안, 초과 봉합에 당기는 조직을 찢어 수 있습니다. 따라서, 시체에 일부 연습 봉합 도움이 될 수 있습니다. 외과 의사가 설치류와 수술에 새로운 마지막 경우, 그것은 다른 사람이 처음 몇 수술 중 감시 및 마취 조정을 지원하는 것이 유용 할 수있다.

이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 흉막 스파 (기흉을 유발하지 않고 공기의 이상 수집을 뼈를 절제한다흉막 막 수술 닫 너무 얇은 때문에 어려운 CE)는 마우스에 치료하는. 리브 열등 근육과 정수리 늑막의 층은 매우 얇고 섬세; 따라서, 정확한 움직임은 절제 영역 아래에 놓여 흉막 막에 구멍을 방지하기 위해 필요합니다. 이 단계 3.1 및 3.3에서 가장 일반적으로 발생합니다. 포인트가 피상적 유지되지 않은 경우 3.1 단계 (주변 늑간 근육에서 뼈를 분리)에 날카로운 메스와 집게 쉽게 흉막 층을 관통 할 수 있습니다. 단계 3.3 (미세 마이크로 가위 골 절제)에서, 흉막 공막의 인장 강도, 또는 뼈 파괴의 작용을 극복 할 수있다 뼈 아래 위 배치를 천공하는 뼈 조각의 단부를 일으킬 수도 흉막 막. 우리는 곡선 끝이 유익이 미세 마이크로 가위를 사용하는 것을 발견했다. 또한, 전술 한 바와 같이, 또한 안락사 쥐 프로토콜 제 연습 유용 할 수있다. ULTI후면부로, 그러나 우리는이 문제가 쉽게 인내와 연습을 극복 할 수 있다는 것을 발견했다.

리브 연골 내 골이지만, 리브 골격 팔다리 뼈대의 긴 뼈 사이에 잠재적으로 중요한 차이가있을 수있다. 발생 학적 관점에서, 리브 골격은 사지 골격 (측면 판 중배엽) (12)는 다른 중배엽 함 (체절)에서 파생됩니다. 그러므로 그것은 개발 역사의 차이를 반영 리브 골격 전구 세포에 고유 한 특성이있을 가능성이 있습니다. 따라서, 장기에, 이러한 독특한 특성이 무엇인지를 결정하고, 리브에서 본 것과 같은 설비가 복구를 중재 사지 골격 전구 세포를 유도하기 위해이 정보를 사용하는 것이 필요할 수있다.

플레이하게된다 또 다른 태양은 호흡기 관련 리브의 위치에 관한 것이다. 알플 랭킹 리브 더 외고정가 필요하지 않도록 충분히 주위 절제술 안정성을 제공하지만, 수리 영역은 폐 팽창 / 수축의 일정한 움직임 및 변형을 받고있다. 그것은 몇 가지 운동은 연골 중간 (13, 14)를 생성하는 중요한 것으로 표시되어있는 동안 뼈 수리하는 동안, 너무 많은 운동이 치료에 억제 할 수 있다는 인식되어왔다. 이때,이 것은 중간 연골의 형성이 효과적으로 대규모 수리 중요한 단계 일 수있다, 분명하지 않다. (골막은 동물에 남아있는 경우) 따라서, 호흡하는 동안 갈비뼈의 움직임은 보수를 용이하게 할 수 있습니다. 이동이 컨텍스트에서 특히 중요 할 수 있기 때문에, 미래의 수리에 영향을 생체 역학적 연구에 유용 할 수있는 고정 장치를 배치하는 현상 방법.

마우스에 리브 수리 분석을 행함으로써, 하나에는 Deve왔다 강력한 유전 적 도구를 활용할 수loped. 예를 들어, 트랜스 제닉 마크를 사용하여 복구 세포의 기원은 평가 될 수있다. 골 형성 (흥미로운 새로운 도구 개발 Gazit 등. 15, 16)에서, 연골 내 프로세스, 중요한 신호 전달 경로의 판독 용 제닉 리포터 12,17을 이용할 수있다. 또한, 기능 상실 대립 유전자를 운반하는 마우스는 필요한 신호 전달 경로를 결정하는 데 사용될 수있다. 현재, 다른 척추 동물 모델 생물이 프로세스의 기본적인 기초 생물학을 프로빙 유전 기술 등 다양한 수 없다.

골격 수리 다른 우수한 모델이 개발되었으며, 얼마 동안 사용되었지만, 또한 다른 컨텍스트는 유리할 수있다 리브 수리의 특징을 고려하여 비계, 화합물 및 세포 치료를 테스트한다. 리브는 바디 및 수리를 지원하지 않아도되므로 표준 리브 수리 모델의 확립은 기존의 모델들을 보완안정화없이 발생합니다. 또한, 수리에 골막의 기여는 쉽게 평가 될 수있다. 리브 연골 및 뼈의 세그먼트 모두를 갖기 때문에 Futhermore, 이러한 상이하지만 관련된 조직 유형의 치료 효과 사이의 비교 (18)의 수리 공통적 인 특징을 식별 할 수있다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medium sized micro-dissection scissors (Vannas-Tübingen Spring Scissors 5 mm) Fine Science Tools 15003-08
Fine micro-dissection scissors (Vannas Spring Scissors - 2mm Cutting Edge) Fine Science Tools 15000-04 curved tip is beneficial
Micro-scalpel 5.0 mm Fine Science Tools 10315-12 other fine scalpels can be substituted
Dumont 55 forceps Fine Science Tools 11295-51
Retractor  Fine Science Tools 17004-05 adjustability is convenient
Micro-needle holders Fine Science Tools 12060-01
9.0 nylon sutures (Ethilon), taper point best Ethicon 2819G or similar taper point best but reverse cutting is also good
7.0 prolene sutures (Prolene) Ethicon 8700H or similar 6-0 can be used too, needle point can vary
Large forceps (Adson Forceps) Fine Science Tools 11006-12 other brands are fine
Lubricant Eye Ointment (Akwa Tears) Akorn 17478-062-35
Suture glue (GLUture Topical Tissue Adhesive) Abbot 32046-01 has excellent working time
Shaver Wahl 9918-6171 or similar
Clamp lamp Zoo Med LF-5
Infrared Bulb, 75W Zoo Med RS-75
RC2 Rodent Anesthesia System VetEquip  922100
IsoFlo (Isoflurane) Abbot 05260-05
Buprenorphine (Buprenex) Reckitt Benckiser 12496-0757-1
Betadine Purdue Frederick 67618015017
Flavored Gelatin, raspberry Jell-O B000E1FYL0 made up firm, to the consistency of 'jigglers'

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References

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마우스 리브를 절제하는 수술 : 대규모 긴 뼈 수리에 대한 모델
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Cite this Article

Tripuraneni, N., Srour, M. K., Funnell, J. W., Thein, T. Z. T., Mariani, F. V. A Surgical Procedure for Resecting the Mouse Rib: A Model for Large-Scale Long Bone Repair. J. Vis. Exp. (95), e52375, doi:10.3791/52375 (2015).More

Tripuraneni, N., Srour, M. K., Funnell, J. W., Thein, T. Z. T., Mariani, F. V. A Surgical Procedure for Resecting the Mouse Rib: A Model for Large-Scale Long Bone Repair. J. Vis. Exp. (95), e52375, doi:10.3791/52375 (2015).

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