Abstract
For at forbedre den terapeutiske effektivitet celle transplantation blev en transplantation-system af genetisk modificerede, injicerbare sphæroider udvikles. Celle sfæroider fremstilles i et dyrkningssystem på mikromønstrede plader belagt med en varmefølsom polymer. Dannes en række sfæroider på pladerne, der svarer til de celleadhæsion områder af 100 um diameter, som jævnligt array i en todimensional måde, omgivet af ikke-klæbende områder, der er belagt med en polyethylenglycol (PEG) matrix. Sfæroiderne kan let udvindes som en flydende suspension ved at sænke temperaturen af pladerne, og deres struktur er godt vedligeholdt ved at lede dem gennem injektionsnåle med en tilstrækkelig stor kaliber (over 27 G). Genetisk modifikation opnås ved gentransfektion bruge den oprindelige ikke-virale gen bærer, Polyplex nanomicelle, som er i stand til at indføre gener i celler uden at forstyrre klumpformet struktur. For pændære hepatocyt sfæroider transficeret med en luciferase-udtrykkende gen, er luciferasen bæredygtigt opnået i transplanterede dyr, sammen med konserverede hepatocyt-funktion, som angivet ved albumin-ekspression. Dette system kan anvendes til en række forskellige celletyper, herunder mesenkymale stamceller.
Introduction
Celle transplantation terapi har tiltrukket stor opmærksomhed til behandling af forskellige genstridige sygdomme. Aktiviteten og halveringstiden af bioaktive faktorer, der udskilles af de transplanterede celler er afgørende for forbedret terapeutisk effektivitet af en celle transplantation system. Genetisk modifikation af cellerne forud for transplantation er en gavnlig teknik til at regulere og manipulere cellulære funktioner, herunder udskillelsen af de bioaktive faktorer. Det er også vigtigt at opretholde en gunstig mikromiljø for cellerne til at undgå celledød eller tab af celleaktivitet. Tredimensionale (3D) klumpformet cellekultur, hvori celle-til-celle-interaktioner er velbevarede, er lovende til dette formål, for eksempel til forbedring albuminsekretion fra primære hepatocytter og fremme multi-slægt differentiering af mesenchymale stamceller (MSC'er ) 1-7.
I denne undersøgelse en ny kombination system spheroid kultur og gen transfektion bruges til at tjene som en platform for genetisk modificeret celle transplantation. Til oprettelse sfæroide celler, er en sfæroid dyrkningssystem på mikromønstrede dyrkningsplader anvendes. På disse plader er celleadhæsion områder af 100 um diameter regelmæssigt opstillet i et todimensionalt måde og er omgivet af ikke-klæbende områder belagt med en PEG-matrix 3. Ved podning et tilstrækkeligt antal celler, er arrays af 3D sfæroider af 100 um i diameter dannet svarende til den mikromønstrede kultur sengen.
Sfæroiderne udvindes uden at forstyrre deres 3D-struktur ved hjælp af varmefølsom celle-dyrkningsplader, der blev overtrukket med en varmefølsom polymer, poly (iso-propylacrylamid) (PIPAAm) 8-10. Den mikromønstrede arkitektur er opbygget på termosensitive plader (specialbyggede). Ved blot at sænke temperaturen af pladerne er de sfæroider løsrevet fra kulturen seng og dispergered i phosphatbufret saltvand (PBS). Således kan et stort antal sfæroider med en ensartet størrelse på 100 um opnås i form af en injicerbar suspension.
Figur 1. Skematisk repræsentation af klumpformet dyrkningssystem på en mikromønstrede plade. Genetisk modifikation opnås ved gentransfektion bruge den oprindelige ikke-virale gen bærer, Polyplex nanomicelle. Det består af plasmid-DNA (pDNA) og polyethylenglycol (PEG) -polycation blokcopolymerer 11. Disse har en karakteristisk kerne-shell struktur, der består af en PEG skal og en indre kerne af kondenseret pDNA, så introduktion sikker og effektiv gen i celler til terapeutiske formål 11. Klik her for at se en større version af this figur.
Figur 2. Struktur af Polyplex nanomicelle dannet ved kompleks af nukleinsyrer og PEG-blok-polykation blokcopolymerer. I denne undersøgelse er den primære fordel ved denne teknik er, at klumpformet struktur ikke ødelægges under gentransfektion af nanomicelles. Efter nanomicelle-medierede transfektioner af rotte primære hepatocyt sfæroider, forlænges transgenekspression opnået for mere end en måned med kontinuerlig albuminsekretion fra hepatocytter på et niveau, der kan sammenlignes med ikke-transficerede sfæroider 12. Den transgen ekspression og albumin udskillelse fra spheroids er også opretholdt efter helbredelse fra varmefølsomme plader. Det er klart, nanomicelles trygt kan lette genindførsel uden at svække de medfødte funktioner hepatocytes. Kombinationen af kugleformede celler dyrket på termosensitive mikromønstrede plader med gen-introduktion hjælp nanomicelles er en lovende platform for genetisk modificerede celle transplantation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle undersøgelser af dyr blev gennemført med godkendelse af Animal Care og brug Udvalg fra University of Tokyo, Tokyo, Japan.
1. Cell Fremstilling
- For primære hepatocytter, følg protokol for hepatocyt isolering fra rotte med en modificeret totrins collagenasefordøjelse proces 13,14.
- Bedøver Sprague Dawley (SD) rotter (mandlige, 5 uger) under indånding anæstesi med isofluran. Placer en rotte i et kammer forbundet til et anæstesiapparat at tilvejebringe isofluran til kammeret. Tag rotten efter falder i søvn, og sæt den på operationsbordet med ventilation ved hjælp af en maske. Styr isofluran flyde omtrent på 0,4-0,7 l / min ved at kontrollere betingelserne for rotten. Perfundere Lever af Sprague Dawley (SD) rotter (hanner, 5 uger gamle) fra portårevenen med en speciel opløsning bestående af 8 g / l natriumchlorid (NaCl), 400 mg / l kaliumchlorid (KCl), 78 mg / Lnatriumdihydrogenphosphatdihydrat (NaH 2 PO 4 · 2H 2 O), 151 mg / l dinatriumhydrogenphosphat dodecahydrat (Na 2 HPO 4 · 12H 2 O), 2,38 g / l 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1 piperazinyl] ethansulfonsyre (HEPES), 190 mg / l ethylenglycol tetraeddikesyre (EGTA), 350 mg / L natriumhydrogencarbonat (NaHCO3), og 900 mg / l glucose.
- Cirkulere collagenaseopløsning gennem leveren.
BEMÆRK: Opløsningen er sammensat af 500 mg / l collagenase, 9,8 g / l Hanks bufferet salt, 2,38 g / ml HEPES, 556 mg / ml calciumchlorid hydrat (CaCl2 · H2O), 350 mg / L NaHCO3, og 50 mg / l trypsininhibitor, med pH justeret til 7,2. - Fjern leveren omhyggeligt, og hakkekød det forsigtigt på et fad under anvendelse af en skalpel, tilføje Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og filtreres cellesuspensionen gennem en 100 umnylon mesh. For at fjerne yderligere snavs, centrifugeres cellesuspensionen ved 20 × g i 1 min. I dette trin hepatocytter er i supernatanten.
- Der centrifugeres trin to gange (i alt tre centrifugeringer). Endelig centrifugeres hepatocytterne ved 50 x g i 3 min at gendanne dem i form af en pellet.
- Resuspender hepatocytter til en koncentration på 4 x 10 5 celler / ml i en særlig dyrkningsmedium sammensat af DMEM suppleret med 10% FBS, 1% Pen-Strep-Glut (PSQ), 1% dimethylsulfoxid (DMSO), 0,1 pmol / l dexamethason, 0,5 ug / ml insulin, 10 mmol / l nikotinamid, 0,2 mmol / l phosphoryleret ascorbat (ASC-2P), og 10 ng / ml human epidermal vækstfaktor (hEGF) 15. Denne specielle medium er obligatorisk for at bevare den hepatiske funktion under in vitro betingelser.
- Til opnåelse rotte MSC'er, aflive Sprague Dawley (SD) rotter (hanner, 5 uger) ved overdreven administration af isoflurane. Resecere lårben og skinneben, og indsamle knoglemarv ved at indsætte en 22 G nål ind i skakten af knoglen til at skylle det ud med 10 ml DMEM suppleret med 10% FBS. Indsamle cellerne ved filtrering gennem et 100 um nylonnet.
- Pode celler på 10 cm dyrkningsskåle ved hjælp DMEM indeholdende 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin. For sfæroiden eksperimenter bruge MSC inden for 5 passager.
2. Udarbejdelse af 3D Cell Sfæroider
- Kommercielt få mikromønstrede dyrkningsplader, på hvilken celle klæbende områder regelmæssigt array på 100 um diameter i en to-dimensional måde, omgivet af ikke-klæbende områder belagt med PEG matrix.
BEMÆRK: celle transplantation, er nødvendigt at tillade celle løsrivelse ved afkøling af pladerne en ekstra belægning med den varmefølsomme polymer PIPAAm (se trin 5.1). Temperatursvingninger kan inducere ændringer i kemien af denne polymer8-10. Ved 37 ° C, PIPAAm er lidt hydrofob, hvilket tillader, at cellerne dyrkes under normale forhold. Et fald i temperaturen under 32 ° C resulterer i hurtig hydratisering af polymeren, hvilket fører til den spontane frigørelse af cellerne. - Seed hepatocytterne eller MSC'er på 12-brønds mikromønstrede plader ved en densitet på 4 x 10 5 celler / brønd andincubate dem ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO2. Cellerne vil akkumulere på mikromønstrede vedhæftning områder og efterhånden danne runde sfæroider i 2 dage.
BEMÆRK: Til fremstilling af kontrolceller i et monolag kultur, bruge de normale 12-brønds plader og frø cellerne ved en identisk densitet efter en lignende fremgangsmåde som beskrevet ovenfor.
3. Udarbejdelse af Polyplex Nanomicelles
- Syntetisere et blokcopolymer, PEG-PASP (DET) (poly [N '- [N - (2-aminoethyl) -2-aminoethyl] aspartamid]) (PEG Mw = 12,000, polymerisationsgrad (DP) på PASP (DET) segment = 59), og en homopolymer, som er sammensat af kun den kationiske segment [PASP (DET)] (DP = 55), efter de tidligere beskrevne, som forfatterne 11 procedurer, 16, 17.
- Der fremstilles en blandet opløsning af PEG-PASP (DET) blokcopolymer og PASP (DET) homopolymer ved et lige molforhold af resterende aminogrupper i 10 mM HEPES-buffer (pH 7,3) ved at justere koncentrationen af polymeren til 33,3 pg / ml og 19.1 pg / ml.
BEMÆRK: polymerkoncentrationer beskrevet ovenfor, er repræsentative værdier til fremstilling nanomicelles med en resterende molforhold af de totale aminogrupper i de to polymerer til phosphatgrupperne i pDNA (N / P-forhold) på 10. N / P-forholdet kan variere afhængig af celletype og formålet (for detaljer, se Diskussion). Den kombinerede anvendelse af de to polymerer kan opnå både effektiv PEG afskærmning og funktion PASP (DET) at øge endosomaltundslippe (for detaljer, se Diskussion) 18. - Forbered pDNA koder Gaussia luciferase, GL4 luciferase eller erythropoietin ved kloning af segmentet udtrykker de respektive gener i pCAG-GS-plasmidet (http://www.cdb.riken.jp/pcs/protocol/vector/map/m36.html ) for at opnå ekspression under CAG promotor / enhancer anvendelse af et kommercielt kit ifølge producentens protokol. Amplificere pDNA i en kompetent Escherichia coli stamme og rense det ved hjælp et endotoksin-frit plasmid DNA oprensning system. Bestem pDNA koncentration ved en absorbans på 260 nm til opnåelse af en opløsning / ml 150 ug i 10 mM HEPES-buffer (pH 7,3).
- Til fremstilling af de Polyplex nanomicelles, blandes grundigt pDNA opløsning (150 ug / ml i 10 mM HEPES-buffer) og forblandet opløsning af de to polymerer i et forhold på 2: 1 (efter volumen).
4. Gene transfektion i Sfæroider
- Inkubere cellerne (hepatocyttereller MSC'er) i 72 timer efter podning onto mikromønstrede plader at tillade dannelsen af modne sfæroider. For gentransfektion, tilsættes 100 pi af Polyplex nanomicelle opløsning (indeholdende 10 ug pDNA) til hver brønd efter udskiftning af dyrkningsmediet med 1 ml frisk medium. Fortsætte inkubationen med nanomicelle opløsning i 24 timer.
- For en kontrol under anvendelse af et lipid-baseret transfektionsreagens, bland pDNA løsninger med reagenset ved et vægtforhold reagens / pDNA af 3. Juster endelige dosis af pDNA at være den samme for både den lipidbaserede reagens og nanomicelle metoder.
5. Inddrivelse og transplantation af Cell Sfæroider
- Erstatte dyrkningsmediet med 200 pi PBS kølet og placere pladerne på is.
BEMÆRK: Generelt kan sfæroiderne løsne i ca 15 min og kan genvindes i form af en suspension til transplantation. - Forsigtigt aspireres cellerne i 200 pisuspension under anvendelse af en sprøjte med en 23 G eller 27 G nål til in vivo injektioner.
6. Evaluering af transgenekspression
- Til in vitro-vurdering af ekspressionen af Gaussia luciferase udskilles i dyrkningsmediet, indsamle 50-100 pi af mediet netop 24 timer efter udskiftning med frisk medium. Estimere luciferaseekspressionen anvendelse af et kommercielt renilla luciferase assay system og en luminometer ifølge producentens protokol.
BEMÆRK: Gaussia luciferase forbliver stabil i dyrkningsmediet i mere end en uge. For således at vurdere den tidstro effektivitet transgenekspression, udskifte mediet med frisk før opsamling af prøven medium. Timingen af mediet ændring kan være fleksibel. - Til in vivo evaluering af transgen ekspression hos værtsdyr efter celletransplantation, bedøver BALB / c nøgne mus (hunner; 7 ugergamle) under indånding anæstesi med isofluran.
- Placer en mus i et kammer forbundet til et anæstesiapparat at tilvejebringe isofluran til kammeret. Tag musen efter falder i søvn, og sæt den på operationsbordet med ventilation ved hjælp af en maske. Styr isofluran flyde omtrent på 0,2-0,5 l / min ved at kontrollere betingelserne for musen.
- Injicer 200 pi af cellesuspensionen indeholdende sfæroider transficeret med de GL4 luciferase-udtrykkende pDNA (som beskrevet i 4.1) i det subkutane væv af den abdominale region.
- Umiddelbart efter injektion af D-luciferin (150 mg / kg; intravenøse vej), måling af luciferase-ekspression under anvendelse IVIS imaging system ifølge producentens protokol.
- For evaluering af de terapeutiske virkninger af celletransplantation, injicere 200 pi af cellesuspensionen indeholdende sfæroider transficeret med erythropoietin-kodende pDNA ind isubkutane væv af den abdominale region.
- Saml blodprøver ved submandibulære blødning at opnå ca. 200 ul blod 19. Måle hæmoglobin og hæmatokrit under anvendelse af en blodprøve analysatoren.
BEMÆRK: celleantal til transplantation er reguleret med antallet podet på pladerne. Desværre er det svært at fastslå den nøjagtige celle nummer, fordi der ikke kan måles antallet inde sphæroider.
- Saml blodprøver ved submandibulære blødning at opnå ca. 200 ul blod 19. Måle hæmoglobin og hæmatokrit under anvendelse af en blodprøve analysatoren.
- Efter eksperimenter placere mus på en varmepude forbundet med en temperaturregulator indtil vågne fra bedøvelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gen transfektion af Gaussia luciferase-udtrykkende pDNA blev udført i sfæroiderne dannet af hepatocytter eller MSC'er under anvendelse Polyplex nanomicelles eller kontrol lipidbaserede transfektionsreagens 12. De nanomicelles inducerede næsten ingen ændring i klumpformet struktur sammenlignet med ikke-transficerede sphæroider på mikromønstrede plader, mens kontrolgruppen reagens forstyrret betydeligt strukturen en dag efter transfektion (figur 3). Efter transfektion ved hjælp af nanomicelles, konsistent albumin sekretion og transgen (Gaussia luciferase) udtryk var godt vedligeholdt i næsten en måned. Men når styringen reagens blev anvendt, blev ingen albuminsekretion iagttaget, selv om graden af transgenekspression var svarede til den opnåede fra nanomicelles (figur 4) 12.
Under klumpformet opsving ved hjælp af de termosensitive mikromønstrede plader, 3D sSTRUKTUR af sfæroider blev godt bevaret for både de primære hepatocytter og MSC'er i suspension efter indsamling fra de afkølede plader (figur 5). Strukturen blev også godt vedligeholdt efter passage sfæroiderne gennem injektionsnåle med en tilstrækkelig stor kaliber, såsom 23 (400 um) og 27 g (220 um) nåle.
Efter subkutane injektioner af de udvundne hepatocyt sfæroider blev luciferase-ekspression påvist i dyr i mere end et par uger (figur 6) 20. Albumin ekspression fra transplanterede hepatocytter blev observeret i værtsvævet 20, hvilket tyder på, at cellefunktion blev bevaret gennem processen med klumpformet genvinding og transplantation. For at teste deres potentiale til terapeutiske anvendelser, blev hepatocyt sfæroider også transficeret med erythropoietin-kodende pDNA. Efter subkutan transplantation af sfæroiderne udtrykker erythropoietin, en signifikant hæmatopoietisk virkning blev opnået i dyrene i en måned (figur 7) 20.
Figur 3. Mikroskopiske billeder af hepatocyt spheroids (A, B) og MSC sfæroider (C, D) på en mikromønstrede plade en dag efter gentransfektion, hjælp Polyplex nanomicelles (A, C) eller lipid-baserede reagens (B, D). Målestok:. 100 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. (A) Transgenekspression af Gaussia luciferase efter transfektion af hepatocyt sfæroider. (B) albumin udskillelse frahepatocyt sfæroider eller hepatocytter i et monolag kultur efter transfektion. Sfæroider blev transficeret under anvendelse nanomicelle (●) eller kontrol lipidbaseret transfektionsreagens (○) eller nøgen pDNA (▲). Albumin udskillelsen fra kontrol (utransficerede) hepatocytter (i sfæroider (△) eller enkeltlagskultur (×)) er også vist. Resultaterne er repræsenteret som middelværdi ± SEM; n = 4 for monolagskultur og n = 6 til sfæroider. (Gengivet med tilladelse fra henvisning 12). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Mikroskopiske billeder af hepatocyt spheroids i suspension efter passerer dem gennem (A) 23- eller (B) 27 g injektionsnåle Scale bar:. 100 um.
Figur 6. Luciferaseekspression i værten mus efter hepatocyttransplantation. Efter 24 timer efter transfektion med luciferase (GL4) -kodende pDNA, hepatocyt sfæroider og enkelt-cellesuspension fra monolagskulturer blev transplanteret ind i det subkutane væv af den abdominale region. Den luciferaseekspression i værten mus blev vurderet ved hjælp af en IVIS Imaging System (Genoptrykt med tilladelse fra henvisning 20). Klik her for at se en større version af dette tal.
igur 7 "src =" / files / ftp_upload / 52384 / 52384fig7.jpg "/>
Figur 7. Hæmatopoiese efter transplantation af erythropoietin-udtrykkende hepatocytter. Hepatocytter i sfæroide og monolagskulturer blev transficeret med erythropoietin-kodende pDNA. Efter 24 timers transfektion blev sfæroider og enkelt-cellesuspensioner fra monolagskulturer subkutant transplanteret i musen maven. Ved 22 og 28 dage efter transplantation blev (A) hæmoglobin og (B) hæmatokritværdier målt fra blodprøverne. Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM; n = 12 for sfæroid og monolag grupper, og n = 6 for ubehandlede kontroller. Statistisk signifikans blev bestemt ved en 2-tailed t-test (Genoptrykt med tilladelse fra henvisning 20). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol, er det afgørende at opretholde 3D-strukturen af sfæroider under trinnene genindførsel og klumpformet nyttiggørelse. Det er vigtigt at opretholde en gunstig mikromiljøer for cellerne at undgå celledød eller tab af celleaktivitet. For eksempel albumin sekretion, en repræsentativ medfødte funktion af hepatocytter, er velbevaret i hepatocyt sfæroider, mens hepatocytterne i den konventionelle monolayerkultur hurtigt mister deres sekretorisk kapacitet få dage efter podning 12. For MSC'er, sfæroiderne væsentlig grad at øge deres effektivitet af differentiering til adipocyter eller osteoblaster, med forøgede ekspressionsniveauer af gener involveret i adipogenese og osteogenese og nedregulering af gener, der opretholder MSC selvfornyelse fænotype 4.
For genindførsel, havde forskellige transfektionsreagenser blevet testet tidligere, herunder lipidbaserede dem (figur 3, 4) ogpolymerbaserede dem, såsom polyethylenimin. Desværre er der ingen af reagenserne billede vellykket genindførsel uden at ødelægge klumpformet struktur. Især, lipid-baserede reagenser tendens til at inducere fuldstændig sprængning af sfæroider, selvom transgenekspression er effektiv, selv i de resterende celler på de mikromønstrede plader. Det er sandsynligt, at de lipidbaserede reagenser inducere signifikant membran destabilisering, hvilket fører til høj transgenekspression, men forstyrre sfæroider ved at gøre de celle-til-celle-interaktioner ustabil.
I modsætning hertil den kationiske polymer forstyrret sfæroiderne i mindre grad end de lipider, især i betingelserne for lave N / P-forhold, for at danne polyplekser. Standardprotokollen her viste bruger Polyplex nanomicelles der besidder PEG afskærmning. Alternativt kan polyplekser med kationiske homopolymerer, såsom polyethylenimin, også anvendes til genindførsel i sfæroiderne. Ja, cationic polyplekser uden PEG overflade generelt giver høj transgen ekspression i in vitro transfektioner, og er attraktive muligheder, afhængigt af celletypen og formålet med klumpformet transplantation.
Et karakteristisk træk ved denne protokol er brugen af mikromønstrede dyrkningsplader overtrukket med en varmefølsom polymer. De mikromønstrede arrays kan producere et stort antal af celle sfæroider med en ensartet diameter. Denne protokol bruger 100 um arrays diameter, men dette aspekt er fleksibel; imidlertid meget store diametre, såsom 500 um, ofte forårsager celle nekrose i kernen af de sfæroider (upublicerede data). Ved blot at køle pladerne på is, kan sfæroiderne opnås i form af en injicerbar suspension ved forsigtig aspiration med en sprøjte. En potentiel begrænsning ved denne teknik er størrelsen af den nål, der anvendes til at injicere sfæroiderne. Det blev bekræftet, at en 27-G kanyle kan sikkert bruges til spheroids med 100 um diameter. Men kan ikke anvendes smalle nåle for disse sphæroider. Da en 27-G kanyle er for stor, især for omplantning sfæroider i muse rygmarv, et muligt alternativ er at bruge stilladser til at fastholde celler inde i dem.
Denne protokol kan potentielt anvendes til flere formål på celle transplantation. Sammenlignet med suspensionen klumpformet dyrkningssystem, de mikromønstrede plader har den fordel, at et tilstrækkeligt antal sfæroider med ensartet diameter kan let opnås. Selvom metoden til genindførsel kan være fleksibel, som tidligere nævnt, Polyplex nanomicelles med PEG afskærmning er særligt effektive til at undgå klumpformet forstyrrelser. Forhåbentlig vil dette system forbedrer de terapeutiske virkninger af transplanterede celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi dybt værdsætter Dr. Takeshi Ikeya og teknisk personale i Toyo Gosei, Tokyo, Japan for at give varmefølsom mikromønstrede dyrkningsplader samt videnskabelig rådgivning. Vi takker også Ms. Satomi Ogura, Ms Sae Suzuki, Ms. Asuka Miyoshi og Ms. Katsue Morii til teknisk bistand med dyreforsøg. Dette arbejde blev støttet delvist af JSP'er KAKENHI Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning, Center for Innovation (COI) Program og S- innovationsprogram fra Japan Science and Technology Agency (JST) og JSP'er kerne- til-Core Program, A. Advanced Research Networks.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pen-Strep-Glut | GIBCO | ||
| Dexamethasone | Wako Pure Chemical Industries | 041-18861 | |
| Nicotinamide | Wako Pure Chemical Industries | 141-01202 | |
| Hank’s buffered salt and L-ascorbic acid 2-phosphate (Asc-2P) | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Human epidermal growth factor (hEGF) | Toyobo | PT10015 | |
| Cell-able multi-well plates | Toyo Gosei | PP-12 | |
| Thermosensitive cell culture plates (Upcell) | CellSeed Inc | The micropatterned architecture is constructed on the thermosensitive plates (custom-built by Toyo Gosei) | |
| Lipid-based transfection reagent (FuGENE HD) | Promega | E2311 | |
| Renilla Luciferase Assay System | Promega | E2810 | |
| pGL4 Luciferase Reporter Vector | Promega | E6651 | |
| pDNA expressing Gaussia luciferase | New England BioLabs | N8082S | |
| Mouse erhthropoietin-expressing vector | Origene | MC208445 | |
| pCAG-GS | Kindly provided by Laboratory for Pluripotent Cell Studies, Center for Developmental Biology, RIKEN | ||
| Escherichia coli DH5α competent cells | Takara | 9057 | |
| Endotoxin-free plasmid DNA purification system | Nippon Genetics | NucleoBond Xtra EF | |
| Collagenase | Wako Pure Chemical Industries | 639-00951 | |
| Trypsin inhibitor | GIBCO | R-007-100 | |
| Luminometer | Promega | GloMax™ 96 Microplate Luminometer | |
| IVIS Imaging System | Xenogen Corp. | Xenogen IVIS Spectrum in vivo imaging system | |
| Blood sample analyzer | Sysmex | pocH-100i Automated Hematology Analyzer |
References
- Landry, J., Bernier, D., Ouellet, C., Goyette, R., Marceau, N. Spheroidal aggregate culture of rat liver cells: histotypic reorganization, biomatrix deposition, and maintenance of functional activities. J Cell Biol. 101 (3), 914-923 (1985).
- Yuasa, C., Tomita, Y., Shono, M., Ishimura, K., Ichihara, A. Importance of cell aggregation for expression of liver functions and regeneration demonstrated with primary cultured hepatocytes. J Cell Physiol. 156 (3), 522-530 (1993).
- Otsuka, H., et al. Two-dimensional multiarray formation of hepatocyte spheroids on a microfabricated PEG-brush surface. Chembiochem. 5 (6), 850-855 (2004).
- Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Eng Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Nakasone, Y., Yamamoto, M., Tateishi, T., Otsuka, H. Hepatocyte spheroids underlayered with nonparenchymal cells for biomedical applications. IEICE Transactions on Electronics. E94, 176-180 (2011).
- Nishida, K., et al. Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. N Engl J Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
- Ohashi, K., et al. Engineering functional two- and three-dimensional liver systems in vivo using hepatic tissue sheets. Nat Med. 13 (7), 880-885 (2007).
- Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Eng Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
- Itaka, K., Kataoka, K. Progress and prospects of polyplex nanomicelles for plasmid DNA delivery. Curr Gene Ther. 11 (6), 457-465 (2011).
- Endo, T., Itaka, K., Shioyama, M., Uchida, S., Kataoka, K. Gene transfection to spheroid culture system on micropatterned culture plate by polyplex nanomicelle: a novel platform of genetically-modified cell transplantation. Drug Deliv and Transl Res. 2 (5), 398-405 (2012).
- Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J Cell Biol. 43 (3), 506-520 (1969).
- Tateno, C., Yoshizato, K. Long-term cultivation of adult rat hepatocytes that undergo multiple cell divisions and express normal parenchymal phenotypes. Am J Pathol. 148 (2), 383-392 (1996).
- Kanayama, N., et al. A PEG-based biocompatible block catiomer with high buffering capacity for the construction of polyplex micelles showing efficient gene transfer toward primary cells. ChemMedChem. 1 (4), 439-444 (2006).
- Itaka, K., Ishii, T., Hasegawa, Y., Kataoka, K. Biodegradable polyamino acid-based polycations as safe and effective gene carrier minimizing cumulative toxicity. Biomaterials. 31 (13), 3707-3714 (2010).
- Uchida, S., et al. PEGylated Polyplex With Optimized PEG Shielding Enhances Gene Introduction in Lungs by Minimizing Inflammatory Responses. Mol Ther. 20 (6), 1196-1203 (2012).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34, 39-43 (2005).
- Uchida, S., et al. An injectable spheroid system with genetic modification for cell transplantation therapy. Biomaterials. 35 (8), 2499-2506 (2014).
