유 전적으로 변형 된 세포 이식을위한 미세 패턴 배양 플레이트에 회전 타원체 세포를 향해 유전자 형질
Summary
This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.
Abstract
세포 이식의 치료 효과를 향상시키기 위해, 유 전적으로 변형 된, 주사 타원체의 이식 시스템이 개발되었다. 셀 타원체가 열성 중합체로 코팅 미세 패턴 플레이트에 배양 시스템에서 제조된다. 구 상체의 수는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 매트릭스에 의해 피복 비 접착 영역에 의해 둘러싸여 정기적 이차원으로 배열되어 100 ㎛ 직경의 세포 접착 부분에 대응하는, 플레이트 상에 형성된다. 스페 로이드 쉽게 플레이트의 온도를 낮춤으로써 액체 현탁액으로서 회수 할 수 있고, 그 구조는 잘 (27 G 이상)를 충분히 큰 구경으로 주사 바늘을 통해 그들을 통과시킴으로써 유지된다. 유전 적 변형은 구형 구조를 방해하지 않으면 서 세포에 유전자를 도입 할 수있는 원래의 비 바이러스 성 유전자 전달체, nanomicelle 폴리 플렉스를 사용하여 유전자 형질 전환에 의해 달성된다. 꼼꼼한 들어알부민 식으로 나타낸 바와 같이 루시페라아제 발현 유전자로 형질 진 간세포 타원체는 루시퍼 라제는 지속 보존 간세포 기능과 함께 이식 된 동물에서 얻어진다. 이 시스템은 중간 엽 줄기 세포를 포함한 다양한 종류의 세포에 적용 할 수있다.
Introduction
세포 이식 치료는 다양한 난치성 질환을 치료하기 위해 널리 주목 받고있다. 이식 된 세포에 의해 분비 활성 및 생체 활성 인자의 반감기는 세포 이식 시스템의 개선 된 치료 효과에 필수적이다. 이식 이전에 세포의 유전 적 변형을 조절하고 생체 활성 인자의 분비를 포함한 세포 기능을 조작하는 유리한 기술이다. 또한 세포 사멸 또는 세포 활성의 손실을 방지하기위한 셀 유리한 미세 환경을 유지하는 것도 중요하다. 세포 간 상호 작용이 잘 보존되어있는 3 차원 (3D) 회전 타원체 세포 배양은, (일차 간세포의 알부민의 분비를 개선하고, 중간 엽 줄기 세포에서 다중 계통 분화 촉진을 위해, 예를 들어,이 목적을 위해 중간 엽 줄기 세포를 유망한 ) 1-7.
spheroi이 연구에서는, 신규 한 콤비네이션 시스템D 문화와 유전자 형질이 유전자 변형 세포 이식을위한 플랫폼 역할을하는 데 사용됩니다. 회전 타원체 세포를 만들기위한, 미세 패턴 배양 플레이트에 회전 타원체 배양 시스템이 사용된다. 이 판에, 직경 100 ㎛의 세포 접착 영역은 규칙적으로 이차원으로 배열되고, PEG 행렬 (3)에 의해 피복 된 비 접착 영역에 의해 둘러싸여있다. 세포의 적절한 수를 파종하여, 직경 100 ㎛의 3 차원 회전 타원체의 배열은 미세 패턴 문화 침대에 대응하여 형성된다.
회전 타원체는 온도 감응성 고분자, 폴리 (이소 프로필 아크릴)로 코팅 된 열성 세포 배양 플레이트를 사용하여 자신의 3D 구조 (PIPAAm) 8-10을 방해하지 않고 복구됩니다. 미세 패턴 구조는 열성 판에 구성된다 (주문 제작). 단순히 플레이트의 온도를 낮춤으로써, 타원체는 배양 베드로부터 분리되어 분산되어인산 D는 식염수 (PBS)를 버퍼. 따라서, 100 ㎛의 균일 한 크기와 타원체의 다수 주사 현탁액의 형태로 얻을 수있다.
도 1 미세 패턴 플레이트에 회전 타원체 배양 시스템의 도식 표현. 유전 적 변형이 원래 비 바이러스 유전자 전달체, nanomicelle 폴리 플렉스를 사용하여 유전자 형질 전환에 의해 달성된다. 이는 플라스미드 DNA (pDNA에) 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) -polycation 블록 공중 합체 (11)로 구성된다. 이러한 특성 코어 – 쉘 (core-shell) 구조, PEG 쉘과 농축의 pDNA의 내부 코어로 구성된 치료 목적 (11)에 대한 세포로 안전하고 효과적인 유전자 도입을 허용있다. 생의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오를의 그림입니다.
도 핵산 및 PEG-블록 폴리 양이온 블록 공중 합체의 복합체에 의해 형성된 폴리 플렉스 nanomicelle 2. 구조.이 연구에서,이 기술의 주요 장점은 회전 타원체 구조 nanomicelles 의한 유전자 형질 전환시에 파괴되지 않는다는 것이다. 일차 래트 간세포 구 상체의 nanomicelle – 매개 형질 감염 후 장기간 유전자 발현은 형질 감염되지 않은 구 상체 (12)의 것과 유사한 수준으로 간세포에서 연속 알부민 분비 개월 이상이 얻어진다. 회전 타원체에서 유전자 발현과 알부민 분비 또한 열성 판에서 회복 후 유지됩니다. 그것은 nanomicelles 안전하게 형 간염의 타고난 기능을 손상시키지 않고 유전자 도입을 용이하게 할 수 있음을 알 수있다atocytes. 따라서, 유전자 도입 nanomicelles를 사용하여 유전자 변형 세포 이식을위한 유망한 플랫폼과 열성 미세 패턴 접시에 배양 회전 타원체 세포의 결합. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서, 유전자 도입 및 회전 타원체 회복 단계 동안 회전 타원체의 3 차원 구조를 유지하는 것이 중요하다. 세포는 세포 사멸 또는 세포 활성의 손실을 방지하는 것이 유리한 미세 환경을 유지하는 것이 필수적이다. 기존의 단일 층 문화의 간세포가 급속하게 (12) 파종 후 몇 일 자신의 분비 능력을 잃게 예를 들어, 알부민 분비, 간세포의 대표 타고난 기능은 물론, 간세포 구 상체…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 깊이 열성 미세 패턴 배양 플레이트뿐만 아니라 과학적인 조언을 제공하기 위해 토요 고세, 도쿄, 일본에서 박사 타케시 Ikeya 및 기술 직원을 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 동물 실험에 대한 기술 지원을 위해 양 사토미 오구라 씨 성폭력 스즈키 씨 아스카 미요시 씨와 Katsue Morii 감사합니다. 이 작품은 재정적으로 JSP를 KAKENHI 보조금 에이드에서 과학 연구에 의해 부분적으로 지원, 혁신 (COI) 프로그램의 중심과 일본 과학 기술 진흥기구 (JST)의 S-혁신 프로그램 및 JSP를 코어 – 에 코어 프로그램, A. 고급 연구 네트워크.
Materials
| Pen-Strep-Glut | GIBCO | ||
| Dexamethasone | Wako Pure Chemical Industries | 041-18861 | |
| Nicotinamide | Wako Pure Chemical Industries | 141-01202 | |
| Hank’s buffered salt and L-ascorbic acid 2-phosphate (Asc-2P) | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Human epidermal growth factor (hEGF) | Toyobo | PT10015 | |
| Cell-able multi-well plates | Toyo Gosei | PP-12 | |
| Thermosensitive cell culture plates (Upcell) | CellSeed Inc | The micropatterned architecture is constructed on the thermosensitive plates (custom-built by Toyo Gosei) | |
| Lipid-based transfection reagent (FuGENE HD) | Promega | E2311 | |
| Renilla Luciferase Assay System | Promega | E2810 | |
| pGL4 Luciferase Reporter Vector | Promega | E6651 | |
| pDNA expressing Gaussia luciferase | New England BioLabs | N8082S | |
| Mouse erhthropoietin-expressing vector | Origene | MC208445 | |
| pCAG-GS | Kindly provided by Laboratory for Pluripotent Cell Studies, Center for Developmental Biology, RIKEN | ||
| Escherichia coli DH5α competent cells | Takara | 9057 | |
| Endotoxin-free plasmid DNA purification system | Nippon Genetics | NucleoBond Xtra EF | |
| collagenase | Wako Pure Chemical Industries | 639-00951 | |
| trypsin inhibitor | GIBCO | R-007-100 | |
| Luminometer | Promega | GloMax™ 96 Microplate Luminometer | |
| IVIS Imaging System | Xenogen Corp. | Xenogen IVIS Spectrum in vivo imaging system | |
| blood sample analyzer | Sysmex | pocH-100i Automated Hematology Analyzer |
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