Abstract
For å forbedre den terapeutiske effektiviteten av celletransplantasjon, ble et system transplantasjon av genetisk modifiserte, injiserbare sfæroider utviklet. Celle sfæroider fremstilles i et kultursystem på micropatterned plater belagt med et thermo polymer. Et antall kuler er dannet på platene, som svarer til de områder av celle adhesjon 100 um diameter som er regelmessig stod i en todimensjonal måte, omgitt av ikke-klebende områder som er belagt med en polyetylenglykol (PEG) matrise. Sfæroidene kan lett utvinnes som en flytende suspensjon ved å senke temperaturen av platene, og deres struktur er godt vedlikeholdt ved å føre dem gjennom kanyler med en tilstrekkelig stor kaliber (over 27 G). Genetisk modifikasjon blir oppnådd ved transfeksjon gen hjelp av den opprinnelige ikke-virale gen bærer, POLYPLEX nanomicelle, som er i stand til å innføre gener i celler uten å forstyrre den sfæroide strukturen. For primAry hepatocytter sfæroider transfektert med luciferase-uttrykkende gen er luciferase bærekraftig oppnådd i transplanterte dyr, sammen med bevart hepatocytter funksjon, som angitt ved albumin uttrykk. Dette systemet kan brukes på en rekke celletyper, inkludert stamceller.
Introduction
Celletransplantasjon terapi har fått stor oppmerksomhet for behandling av ulike problematiske sykdommer. Aktiviteten og halveringstid av bioaktive faktorer som utskilles av de transplanterte cellene er viktig for forbedret terapeutisk effekt av et celletransplantasjon system. Genetisk modifikasjon av cellene før transplantasjonen er en fordelaktig teknikk for å regulere og manipulere cellulære funksjoner, inkludert sekresjon av bioaktive faktorer. Det er også viktig å opprettholde en gunstig mikromiljø for cellene for å unngå celledød eller tap av celleaktivitet. Tre-dimensjonale (3D) sfæroide cellekulturen, hvori celle-til-celle interaksjoner er godt bevart, er lovende for dette formål, for eksempel for forbedring av albumin sekresjon fra primære hepatocytter og fremme multilineær differensiering av stamceller (MSC ) 1-7.
I denne studien ble en ny kombinasjon system av spheroid kultur og genet transfeksjon blir brukt til å tjene som en plattform for genetisk modifisert celle transplantasjon. For å lage sfæroide celler, er en sfæroide kultursystem på micropatterned kulturplater brukt. På disse plater, blir celle adhesjon områder av 100 um diameter regelmessig oppstilt i en todimensjonal måte og er omgitt av ikke-klebende områder belagt med en matrise 3-PEG. Ved poding et tilstrekkelig antall celler, er rekker av 3D-sfæroider av 100 pm i diameter dannet svarende til micropatterned kulturen sengen.
Sfæroidene gjenvinnes uten å forstyrre deres 3D-struktur ved hjelp av termocellekulturplater, som var belagt med et termosensitivt polymer, poly (iso-propylacrylamide) (PIPAAm) 8-10. Den micropatterned arkitekturen er bygget på de termo plater (custom-bygget). Ved ganske enkelt å senke temperaturen av platene, blir sfæroidene løsrevet fra dyrkningsseng og spred i fosfatbufret saltvann (PBS). Således kan man få et stort antall sfæroider med ensartet størrelse på 100 um i form av en injiserbar suspensjon.
Figur 1. Skjematisk fremstilling av den sfæroide kultursystemet på en micropatterned plate. Genetisk modifikasjon blir oppnådd ved transfeksjon gen hjelp av den opprinnelige ikke-virale gen bærer, POLYPLEX nanomicelle. Det er sammensatt av plasmid DNA (pDNA) og polyetylenglykol (PEG) -polycation blokk-kopolymerer 11. Disse har en karakteristisk kjerne-skall struktur bestående av en PEG skall og en indre kjerne av kondensert pDNA, slik at sikker og effektiv genet innføring i celler for terapeutiske formål 11. Klikk her for å se en større versjon av this figur.
Figur 2. Oppbygging av POLYPLEX nanomicelle dannet ved kompleks av nukleinsyrer og PEG-blokk-polykation-blokk-kopolymerer. I denne studien, er den primære fordelen med denne teknikk at den sfæroide strukturen ikke blir forstyrret under genet transfeksjon av nanomicelles. Etter nanomicelle-mediert trans av rotte primære hepatocytter kuler, er langvarig transgene uttrykk innhentet for mer enn en måned med sammenhengende albumin sekret fra hepatocytter på et nivå som kan sammenlignes med utransfekterte kuler 12. Transgenet uttrykk og albumin sekresjon fra kulene er også opprettholdt etter at utvinningen fra termoplater. Det er åpenbart at nanomicelles trygt kan lette innføringen genet uten å svekke de medfødte funksjonene til hepatocytes. Dermed kombinasjonen av sfæroide celler dyrket på termo micropatterned plater med gen innføring bruker nanomicelles er en lovende plattform for genmodifiserte celletransplantasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrestudier ble gjennomført med godkjenning av Animal Care og bruk komité ved University of Tokyo, Tokyo, Japan.
1. Cell Forberedelse
- For primære hepatocytter, følger protokoll for hepatocytter isolasjon fra rotte av en modifisert to-trinns collagenase fordøyelsen 13,14.
- Bedøve Sprague Dawley (SD) rotter (mannlige, 5 uker gamle) under innånding anestesi med isofluran. Plasser en rotte i et kammer forbundet med en maskin for å tilveiebringe anestesi isofluran for kammeret. Ta ut rotte etter å ha falt i søvn, og sett den på operasjonsbordet med ventilasjon ved hjelp av en maske. Styr isofluran flyte omtrent på 0,4 til 0,7 l / min ved å sjekke forholdene i rotte. Perfuse leveren hos Sprague Dawley (SD) rotter (hann, 5 uker gamle) fra den hepatiske portalvenen med en spesiell oppløsning bestående av 8 g / l natriumklorid (NaCl), 400 mg / l kaliumklorid (KCl), 78 mg / lnatriumdihydrogenfosfat-dihydrat (NaH 2PO 4 · 2H 2 O), 151 mg / l dinatriumhydrogenfosfat-dodekahydrat (Na 2 HPO 4 · 12 H 2 O), 2,38 g / l 2- [4- (2-hydroksyetyl) -1 -piperazinyl] etansulfonsyre (HEPES), 190 mg / l etylenglykol-tetraeddiksyre (EGTA), 350 mg / l natriumhydrogenkarbonat (NaHCO3), og 900 mg / l glukose.
- Sirkulere kollagenaseoppløsning gjennom leveren.
MERK: Oppløsningen består av 500 mg / l kollagenase, 9,8 g / l Hanks bufret salt, 2,38 g / ml HEPES, 556 mg / ml kalsiumklorid-hydrat (CaCl2 · H 2 O), 350 mg / l NaHCO3, og 50 mg / l trypsin inhibitor, med pH justert til 7,2. - Fjern omhyggelig leveren, og hakke det forsiktig på en tallerken ved hjelp av et skalpellblad, tilsett Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), og filtrere cellesuspensjonen gjennom en 100 umnylon mesh. Å fjerne ytterligere rusk, sentrifuger cellesuspensjonen ved 20 × g for 1 min. På dette trinnet er hepatocytter i supernatanten.
- Gjenta sentrifugeringstrinn to ganger (totalt tre sentrifugeringer). Til slutt, sentrifuger hepatocytter ved 50 x g i 3 minutter for å utvinne dem i form av en pellet.
- Re-suspen hepatocyttene til en konsentrasjon på 4 x 10 5 celler / ml i et spesielt kulturmedium bestående av DMEM supplert med 10% FBS, 1% Pen-Strep-Glut (PSQ), 1% dimetylsulfoksid (DMSO), 0,1 umol / L deksametason, 0,5 ug / ml insulin, 10 mmol / l nikotinamid, 0,2 mmol / L fosforylert askorbat (ASC-2P), og 10 ng / ml human epidermal vekstfaktor (hEGF) 15. Denne spesielle medium er obligatorisk for å bevare leverfunksjon under in vitro forhold.
- For å få rotte MSC, avlive Sprague Dawley (SD) rotter (mannlige, 5 uker gammel) ved overdreven bruk av isoflurane. Resect lårben og tibias, og samle benmarger ved å sette inn en 22 G nål inn i skaftet på benet for å skylle den med 10 ml av DMEM supplert med 10% FBS. Samle cellene ved filtrering gjennom en 100 pm nylonnett.
- Seed cellene bort på 10 cm kultur retter med DMEM inneholder 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin. For de sfæroide eksperimenter, bruke MSC innen 5 passasjer.
2. Utarbeidelse av 3D-Cell Spheroids
- Kommersielt oppnå micropatterned kulturplater, på hvilke celleklebeområdene blir regelmessig kledd på 100 mikrometer i diameter i en todimensjonal måte, er omgitt av ikke-klebende områder belagt med PEG matrisen.
NB: For celletransplantasjon, er nødvendig for å tillate celle løsgjøring ved avkjøling platene et ekstra belegg med termo polymer PIPAAm (se trinn 5.1). Temperatursvingninger kan indusere endringer i kjemi av denne polymeren8-10. Ved 37 ° C, er PIPAAm svakt hydrofobt, slik at cellene som skal dyrkes under normale forhold. En reduksjon i temperaturen under 32 ° C resulterer i rask hydratisering av polymeren, som fører til spontan avløsning av cellene. - Seed hepatocytter eller MSC på 12-brønners micropatterned plater i en tetthet på 4 x 10 5 celler / brønn andincubate dem ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO2. Cellene vil samle seg på de micropatterned vedheft områder og etter hvert danne runde kuler i to dager.
NB: For fremstilling av kontrollceller i en monolagskultur, bruke vanlige 12-brønners plater og frø cellene ved en identisk tetthet, etter en lignende fremgangsmåte som beskrevet ovenfor.
3. Utarbeidelse av POLYPLEX Nanomicelles
- Syntetisere en blokk-kopolymer, PEG-PASP (DET) (poly [N '- [N - (2-aminoetyl) -2-aminoetyl] aspartamide]) (PEG Mw = 12,000, polymerisasjonsgrad (DP) på PASP (DET) segment = 59), og en homopolymer som er sammensatt av bare den kationiske segment [PASP (DET)] (DP = 55), ifølge fremgangsmåtene som tidligere er beskrevet av forfatterne 11, 16, 17.
- Tilbered en blandet løsning av PEG-PASP (DET) blokk-kopolymer og den PASP (DET) homopolymer ved en lik molforhold av gjenværende aminogrupper i 10 mM HEPES-buffer (pH 7,3) ved å regulere polymerkonsentrasjonen til 33,3 ug / ml og 19,1 ug / ml, henholdsvis.
MERK: polymerkonsentrasjoner som er beskrevet ovenfor, er representative verdier for fremstilling nanomicelles med en rest molart forhold mellom den totale aminogrupper i de to polymerene til fosfatgruppene i pDNA (N / P-forhold) av 10. N / P-forholdet kan variere avhengig av celletype og formålet (for detaljer, se diskusjon). Kombinert bruk av de to polymerer kan oppnå både effektive PEG skjerming og funksjon av PASP (DET) for å forbedre endosomalerømme (for detaljer, se diskusjon) 18. - Klargjør pDNA koder Gaussia luciferase, GL4 luciferase, eller erytropoietin ved kloning segmentet uttrykker de respektive gener inn i pCAG-GS plasmid (http://www.cdb.riken.jp/pcs/protocol/vector/map/m36.html ) for å oppnå ekspresjon under CAG promoter / enhancer anvendelse av et kommersielt kit ifølge produsentens protokoll. Forsterke pDNA på en kompetent Escherichia coli stamme og rense den ved hjelp av en endotoksin-free plasmid DNA rensing system. Bestem pDNA-konsentrasjonen ved en absorbans på 260 nm for å oppnå en 150 ug / ml løsning i 10 mM HEPES-buffer (pH 7,3).
- For å fremstille POLYPLEX nanomicelles, Bland pDNA-oppløsning (150 ug / ml i 10 mM HEPES-buffer) og forblandet løsning av de to polymerer i et forhold på 2: 1 (i volum).
4. Gene Transfeksjon inn Spheroids
- Inkuber cellene (hepatocyttereller MSC) i 72 timer etter utsåing på de micropatterned platene for å tillate dannelsen av modne sfæroider. For genet transfeksjon tilsettes 100 ul av POLYPLEX nanomicelle oppløsning (inneholdende 10 ug av pDNA) til hver brønn etter utskiftning av kulturmediet med 1 ml friskt medium. Fortsett inkubasjonen med nanomicelle løsningen i 24 timer.
- For en kontroll ved hjelp av en lipid-basert transfeksjon reagens, blande pDNA løsninger med reagenset i et vektforhold reagens / pDNA av 3. Juster den endelige dosen av pDNA å være lik for både lipid-baserte reagens og nanomicelle metoder.
5. Recovery og Transplantasjon av Cell Spheroids
- Erstatte kultur medium med 200 ul kjølt PBS og legg platene på is.
MERK: Generelt kan sfæroidene løsne i ca 15 minutter, og kan utvinnes i form av en suspensjon for transplantasjon. - Forsiktig aspireres cellene i 200 ulsuspensjonen ved hjelp av en sprøyte med en 23 G-27 eller G nål for in vivo injeksjon.
6. Evaluering av transgene uttrykk
- For in vitro evaluering av ekspresjonen av luciferase Gaussia utskilt i kulturmediet, samle 50-100 ul av mediet nøyaktig 24 timer etter å ha erstattet med friskt medium. Estimer luciferaseekspresjon ved hjelp av et kommersielt Renilla luciferase assay system og et luminometer i henhold til produsentens protokoll.
MERK: Gaussia luciferase forblir stabil i kulturmediet for mer enn en uke. Derfor, for å evaluere sanntids effektiviteten av transgene uttrykk, erstatte det med friskt medium én forut for oppsamling av prøvemediet. Tidspunktet for medium endringen kan være fleksibel. - For in vivo-evaluering av transgene ekspresjon i verts-dyr følgende celletransplantasjon, bedøve BALB / c nakne mus (hunn, 7 ukergamle) under innånding anestesi med isofluran.
- Plasser en mus i et kammer forbundet med en maskin for å tilveiebringe anestesi isofluran for kammeret. Ta ut musa etter å ha falt i søvn, og sett den på operasjonsbordet med ventilasjon ved hjelp av en maske. Styr isofluran flyte omtrent på 0,2 til 0,5 l / min ved å sjekke forholdene i musen.
- Injisere 200 ul av cellesuspensjonen som inneholder sfæroidene transfektert med GL4 luciferase-uttrykk pDNA (som beskrevet under 4.1) inn i det subkutane vev i mageregionen.
- Umiddelbart etter injeksjon av D-luciferin (150 mg / kg, intravenøst), måle luciferase-ekspresjon ved hjelp av IVIS avbildningssystem i henhold til produsentens protokoll.
- For evaluering av den terapeutiske effekten av den celletransplantasjon, injisere 200 ul av cellesuspensjonen som inneholder sfæroidene transfektert med erytropoietin-kodende pDNA inn isubcutaneous vev av mageregionen.
- Samle blodprøver av submandibular blødning å få ca 200 mL av blod 19. Måle hemoglobin og hematokrit ved hjelp av en blodprøve analysator.
MERK: mobilnummer for transplantasjon er regulert med antall seedet på platene. Dessverre er det vanskelig å fastslå den nøyaktige celletallet fordi antall inne kuler ikke kan måles.
- Samle blodprøver av submandibular blødning å få ca 200 mL av blod 19. Måle hemoglobin og hematokrit ved hjelp av en blodprøve analysator.
- Etter eksperimenter, plasser mus på en varmepute forbundet med en temperaturregulator til oppvåkning fra anestesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gene transfeksjon av Gaussia luciferase-uttrykk pDNA ble utført på kulene som dannes av hepatocyttene eller MSC ved hjelp POLYPLEX nanomicelles eller kontroll lipid-basert reagens 12 transfeksjon. De nanomicelles indusert nesten ingen endring i den sfæroide struktur sammenlignet med ikke-transfiserte klumper på micropatterned platene, mens styre reagenset vesentlig forstyrret strukturen en dag etter transfeksjon (figur 3). Etter transfeksjon med de nanomicelles, konsekvent albumin sekresjon og transgenet (Gaussia luciferase) uttrykk var godt vedlikeholdt i nesten en måned. Men når styre reagenset ble brukt, ble det ikke albumin sekresjon observert, selv om graden av transgenet ekspresjonen var lik den som er oppnådd fra nanomicelles (figur 4) 12.
Under spheroid utvinning ved hjelp av termo micropatterned plater, 3D-structure av kulene var godt bevart for både primære hepatocytter og MSC i suspensjon etter utvinning fra de avkjølte plater (Figur 5). Strukturen ble også godt vedlikeholdt etter å ha passert kulene gjennom kanyler med et tilstrekkelig stort kaliber, så som 23 (400 um) og 27 g (220 um) nåler.
Etter subkutane injeksjoner av de gjen hepatocytter kulene, ble luciferase-ekspresjon detektert i dyrene i mer enn noen få uker (figur 6) 20. Albumin ekspresjon fra transplanterte hepatocytter ble observert i vertsvevet 20, noe som tyder på at cellefunksjon ble bevart gjennom prosessen for sfæroiden utvinning og transplantasjon. For å teste deres potensial for terapeutiske anvendelser ble hepatocytter sfæroidene også tilført med erytropoietin-koding pDNA. Etter subkutan transplantasjon av kulene uttrykker erythropoietin, en signifikant hematopoetisk effekt ble oppnådd hos de dyrene for en måned (figur 7) 20.
Figur 3. mikroskopiske bilder av hepatocytter kuler (A, B) og MSC kuler (C, D) på en micropatterned plate en dag etter at genet transfeksjon, bruker POLYPLEX nanomicelles (A, C) eller lipidbasert reagens (B, D). Skala:. 100 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. (A) Transgene uttrykk for Gaussia luciferase etter trans de hepatocytter kuler. (B) Albumin sekresjon frade hepatocytter kuler eller hepatocytter i en monokultur etter transfeksjon. Spheroids ble transfektert hjelp nanomicelle (●) eller kontrollere lipid-baserte transfeksjon reagens (○), eller naken pDNA (▲). Albumin sekresjon fra kontrollen (ikke-transfekterte) hepatocytter (i sfæroider (△) eller monolagskultur (x)) er også vist. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SEM; n = 4 til monolagskultur og n = 6 for sfæroidene. (Gjengitt med tillatelse fra referanse 12). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. mikroskopiske bilder av hepatocytter kulene i suspensjon etter å føre dem gjennom (A) 23-, eller (B) 27 g injeksjonsnåler Skala:. 100 um.
Figur 6. Luciferase uttrykk i vertmus etter hepatocytter transplantasjon. Etter 24 timer etter transfeksjon med luciferase (GL4) kodende pDNA, de hepatocytter sfæroidene og encellet suspensjon fra monolagkulturer ble transplantert inn i subcutaneous vev av mageregionen. Luciferase uttrykk i vertmus ble evaluert ved hjelp av en IVIS Imaging System (Gjengitt med tillatelse fra referanse 20). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
igur 7 "src =" / files / ftp_upload / 52384 / 52384fig7.jpg "/>
Figur 7. hematopoesen etter transplantasjon av erytropoietin-uttrykk hepatocytter. Hepatocytter i den sfæroide og monolagskulturer ble transfektert med erytropoietin-koding pDNA. Etter 24 timers transfeksjon ble sfæroidene og enkeltcellesuspensjoner fra monolagskulturer subkutant transplantert inn i mus abdomen. Ved 22 og 28 dager etter transplantasjonen, ble (A) og hemoglobin (B) hematokrit-verdier målt fra blodprøvene. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM; n = 12 for sfæroide og monolags grupper, og n = 6 for ubehandlede kontroller. Statistisk signifikans ble bestemt av en to-tailed t-test (Gjengitt med tillatelse fra referanse 20). Klikk her for å se en større versjon av denne figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen, er det viktig å opprettholde den 3D-strukturen til sfæroidene i løpet av trinnene med genet innføring og sfæroide utvinning. Det er viktig å opprettholde en gunstig mikromiljøer for cellene å unngå celledød eller tap av celleaktivitet. For eksempel albumin sekresjon, en representant medfødt funksjon av hepatocytter, er godt bevart i hepatocytter kuler, mens hepatocytter i den konvensjonelle enlagskultur raskt miste sin sekretorisk kapasitet et par dager etter såing 12. For MSC, sfæroidene i betydelig grad forbedre effektiviteten av differensiering til adipocytter eller osteoblaster, med økt ekspresjon nivåer av gener involvert i adipogenese og osteogenesis, og nedregulering av gener som opprett MSC selvfornyelse fenotype 4.
For genet innledning, hadde forskjellige transfeksjonsteknikker reagenser blitt testet tidligere, omfattende lipid-baserte seg (figur 3, 4), ogpolymer-baserte seg, slik som polyetylenimin. Dessverre er ingen av de reagenser tilgjengelig vellykket innføring gen uten å forstyrre den sfæroide strukturen. Spesielt, lipid-baserte reagenser har en tendens til å indusere fullstendig avbrudd av kulene, selv om transgene uttrykk er effektive, selv i de resterende cellene på micropatterned platene. Det er sannsynlig at det lipid-baserte reagenser indusere signifikant membran destabilisering, som fører til høy ekspresjon transgenet, men hindrer at kulene ved å utføre de nevnte celle-til-celle-interaksjoner ustabil.
I motsetning til dette, den kationiske polymer avbrutt sfæroidene i mindre grad enn de lipider, særlig i forhold med lav N / P-forhold, for å danne de polyplexes. Standard protokoll vises her bruker POLYPLEX nanomicelles som besitter PEG skjerming. Alternativt kan polyplexes med kationiske homopolymerer, så som polyetylenimin, også anvendes for gene innføring i kulene. Faktisk cationic polyplexes uten PEG overflaten generelt gi høy transgene uttrykk i in vitro transfections, og er attraktive alternativer avhengig av celletype og formålet med spheroid transplantasjon.
Et karakteristisk trekk ved denne protokollen er bruk av micropatterned kulturplater belagt med en thermo polymer. De micropatterned arrays kan produsere et stort antall celle sfæroider med ensartet diameter. Denne protokollen bruker 100 mikrometer i diameter matriser, men dette aspektet er fleksibel; imidlertid svært store diametre, for eksempel 500 um, ofte føre til celle-nekrose i kjernen av kulene (upubliserte data). Ved ganske enkelt avkjøling av platene på is, kan kulene bli oppnådd i form av en injiserbar suspensjon ved forsiktig aspirasjon med en sprøyte. En potensiell begrensning av denne teknikk er størrelsen av nålen brukes til å injisere sfæroidene. Det ble bekreftet at en 27-G kanyle trygt kan brukes for kuler med 100 mikrometer diameter. Imidlertid kan smale nåler ikke brukes for disse kulene. Siden en 27-G kanyle er for stor, spesielt for transplantere kuler i mus ryggmargen, er et mulig alternativ til å bruke stillaser å beholde cellene inni dem.
Denne protokollen kan potensielt brukes til flere formål av celletransplantasjon. Sammenlignet med suspensjonskultur sfæroide system, micropatterned platene har den fordel at et tilstrekkelig antall sfæroider med ensartet diameter kan lett skaffes. Selv om fremgangsmåten for innføring genet kan være fleksibel, som tidligere nevnt, POLYPLEX nanomicelles med PEG skjerming er spesielt effektive for å unngå avbrudd sfæroide. Forhåpentligvis vil dette systemet forbedre den terapeutiske effekten av transplanterte celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi setter stor pris på Dr. Takeshi Ikeya og teknisk personale i Toyo Gosei, Tokyo, Japan for å gi termo micropatterned kulturplater samt vitenskapelige råd. Vi takker også Ms Satomi Ogura, Ms. Sae Suzuki, Ms. Asuka Miyoshi og Ms. Katsue Morii for teknisk assistanse med dyreforsøk. Dette arbeidet ble finansiert delvis av JSP KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research, Senter for innovasjon (COI) Program og S- innovasjonsprogram fra Japan Science and Technology Agency (JST), og JSP kjerne- to-kjerne program, A. Advanced Research Networks.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pen-Strep-Glut | GIBCO | ||
| Dexamethasone | Wako Pure Chemical Industries | 041-18861 | |
| Nicotinamide | Wako Pure Chemical Industries | 141-01202 | |
| Hank’s buffered salt and L-ascorbic acid 2-phosphate (Asc-2P) | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Human epidermal growth factor (hEGF) | Toyobo | PT10015 | |
| Cell-able multi-well plates | Toyo Gosei | PP-12 | |
| Thermosensitive cell culture plates (Upcell) | CellSeed Inc | The micropatterned architecture is constructed on the thermosensitive plates (custom-built by Toyo Gosei) | |
| Lipid-based transfection reagent (FuGENE HD) | Promega | E2311 | |
| Renilla Luciferase Assay System | Promega | E2810 | |
| pGL4 Luciferase Reporter Vector | Promega | E6651 | |
| pDNA expressing Gaussia luciferase | New England BioLabs | N8082S | |
| Mouse erhthropoietin-expressing vector | Origene | MC208445 | |
| pCAG-GS | Kindly provided by Laboratory for Pluripotent Cell Studies, Center for Developmental Biology, RIKEN | ||
| Escherichia coli DH5α competent cells | Takara | 9057 | |
| Endotoxin-free plasmid DNA purification system | Nippon Genetics | NucleoBond Xtra EF | |
| Collagenase | Wako Pure Chemical Industries | 639-00951 | |
| Trypsin inhibitor | GIBCO | R-007-100 | |
| Luminometer | Promega | GloMax™ 96 Microplate Luminometer | |
| IVIS Imaging System | Xenogen Corp. | Xenogen IVIS Spectrum in vivo imaging system | |
| Blood sample analyzer | Sysmex | pocH-100i Automated Hematology Analyzer |
References
- Landry, J., Bernier, D., Ouellet, C., Goyette, R., Marceau, N. Spheroidal aggregate culture of rat liver cells: histotypic reorganization, biomatrix deposition, and maintenance of functional activities. J Cell Biol. 101 (3), 914-923 (1985).
- Yuasa, C., Tomita, Y., Shono, M., Ishimura, K., Ichihara, A. Importance of cell aggregation for expression of liver functions and regeneration demonstrated with primary cultured hepatocytes. J Cell Physiol. 156 (3), 522-530 (1993).
- Otsuka, H., et al. Two-dimensional multiarray formation of hepatocyte spheroids on a microfabricated PEG-brush surface. Chembiochem. 5 (6), 850-855 (2004).
- Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Eng Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Nakasone, Y., Yamamoto, M., Tateishi, T., Otsuka, H. Hepatocyte spheroids underlayered with nonparenchymal cells for biomedical applications. IEICE Transactions on Electronics. E94, 176-180 (2011).
- Nishida, K., et al. Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. N Engl J Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
- Ohashi, K., et al. Engineering functional two- and three-dimensional liver systems in vivo using hepatic tissue sheets. Nat Med. 13 (7), 880-885 (2007).
- Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Eng Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
- Itaka, K., Kataoka, K. Progress and prospects of polyplex nanomicelles for plasmid DNA delivery. Curr Gene Ther. 11 (6), 457-465 (2011).
- Endo, T., Itaka, K., Shioyama, M., Uchida, S., Kataoka, K. Gene transfection to spheroid culture system on micropatterned culture plate by polyplex nanomicelle: a novel platform of genetically-modified cell transplantation. Drug Deliv and Transl Res. 2 (5), 398-405 (2012).
- Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J Cell Biol. 43 (3), 506-520 (1969).
- Tateno, C., Yoshizato, K. Long-term cultivation of adult rat hepatocytes that undergo multiple cell divisions and express normal parenchymal phenotypes. Am J Pathol. 148 (2), 383-392 (1996).
- Kanayama, N., et al. A PEG-based biocompatible block catiomer with high buffering capacity for the construction of polyplex micelles showing efficient gene transfer toward primary cells. ChemMedChem. 1 (4), 439-444 (2006).
- Itaka, K., Ishii, T., Hasegawa, Y., Kataoka, K. Biodegradable polyamino acid-based polycations as safe and effective gene carrier minimizing cumulative toxicity. Biomaterials. 31 (13), 3707-3714 (2010).
- Uchida, S., et al. PEGylated Polyplex With Optimized PEG Shielding Enhances Gene Introduction in Lungs by Minimizing Inflammatory Responses. Mol Ther. 20 (6), 1196-1203 (2012).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34, 39-43 (2005).
- Uchida, S., et al. An injectable spheroid system with genetic modification for cell transplantation therapy. Biomaterials. 35 (8), 2499-2506 (2014).
