The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.
Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.
Glioblastoma (GBM) en sık görülen habis beyin tümörü ve daima ölümcüldür. Bakım kemoterapi ve radyoterapi non-spesifik standart ile birleştiğinde cerrahi rezeksiyon tamamen bu hastalığı 1 olan hastalarda en az 15 ay kasvetli prognoz sonuçlanan malign hücreleri ortadan kaldırmak için başarısız olur. Bunun aksine, immüno spesifik olarak tümör hücrelerini hedef alan için kesin bir yaklaşım sunmaktadır ve bu nedenle yan toksisite 2-4 riskinin azalması ile, yüksek ölçüde etkili bir tedavi platformu olarak hizmet etme potansiyeline sahiptir. T hücreleri kimerik antijen reseptörleri (arabaların) tümör immünoterapi için çok yönlü bir strateji sunmak ifade ex vivo mühendislik. Arabaların kompleks, tam uzunlukta, başlıca doku uyumu yerine, bir ya da daha fazla hücre içi T hücresi sinyal molekül (ler) ile bir antikorun hücre dışı değişken bölgesini füzyon tarafından üretilen (MHC) bir T hücresi reseptörü 5 -restricted. Antikor benzeri antijen Tanıma ve ödüller Bu modreaktif antijen spesifik T hücreleri tanımak ve MHC olmadığı halde tümör antijenlerine yanıt ve hemen hemen sonsuz bir antijen repertuar için uyarlanabilir edilmesi için, izin verir.
Tümör antijenlerinin çeşitli karşı tasarlanmış ARAÇ T hücreleri klinikte 6-9 preklinik etkinliğini ve üstün söz göstermiştir. Özellikle, GBM kapsamında, bir ARAÇ T hücresi platformu hedefleme epidermal büyüme faktörü reseptörü varyantı III (EGFRvIII), tümöre özel bir mutasyon hücre yüzeyi 10 üzerinde eksprese, gliom taşıyan farelere 11 ömrünü uzattığı gösterilmiştir. Çeşitlilikleri rağmen, ARAÇ adoptif tedavi klinik yarar tamamen bağlı tümör bağlantılı bağışıklık bastırma ve bağışıklık kaçırma 12-16 olarak oluşturulması ve in vivo olarak antijen-spesifik T hücrelerinin korunmasında zorluklar kısmen fark edilmemiştir. Immünoterapi ile bakım (SOC) standardını yararlanan potansiyel bu l birkaç üstesinden gelebilirtaklidi, hem klinik öncesi ve klinik ortamda gelişmiş etkinlik ile sonuçlanmaktadır.
Sonrası rezeksiyon GBM için SOC yüksek doz temozolomide (TMZ), bir DNA alkilleyici ajan 17, ve tüm beyin ışınlaması (TBI) oluşur 1. Bu tedaviler, tümör MHC ekspresyonunun 18-20 yukarı regülasyonu ve ölü tümör hücreleri 17,19,21,22 ile antijen dökülme ile tümör aşıları ile sinerji olduğu kabul edilir. Nitekim, klinik öncesi ortamda bağışıklık temelli tedaviler geliştirilmiş antitümör etkinliğine TMZ 20,23 veya 18,24 WBI potansiyel eklenmesi. Ayrıca, birçok non-spesifik sitotoksik kemoterapötik gibi, TMZ evlatlık tedavi platformları 27-29 host-klima aracı olarak kaldıraçlı olabilir sistemik lenfopeni 25,26, neden olduğu bilinmektedir. TMZ aracılı lymphodepletion bir ADOP artan etkinliğine yol açan antijen-spesifik T hücrelerinin frekansı ve fonksiyonunu artırmak için gösterilmiştirintrakranial tümörlere karşı 30 tif tedavi platformu. ARAÇ tedavisi bağlamında, lymphodepletion hem böylece anti-tümör aktivitesi 11,34 artırılması, endojen bastırıcı T hücreleri 31 sayısını azaltır ve sitokinlerin 33 için daha az rekabet ettirilerek homeostatik proliferasyonu 32 uyararak konakçı klima bir araç olarak hizmet eder. SOC bağlamında yeni evlat edinen tedaviler ve aşı platformları değerlendirilmesi etkinliğine ilişkin anlamlı sonuçlar çizim için kritik GBM SOC ve immünoterapi platformlar arasında sinerjik bir ilişki göz önüne alındığında.
Bu protokol, EGFRvIII pozitif tutan tümörler (tedavi zaman çizelgesi için bakınız Şekil 1) taşıyan farelerde TMZ ve WBI birlikte sıçangil EGFRvIII özgü ARAÇ T hücrelerinin üretimi ve damar içine uygulama için bir yöntem özetlemektedir. Kısaca, ARAÇ T hücreleri retroviral transdüksiyon tarafından ex vivo yapılır. İnsan embriyonik böbrek (HEK) 293T Hücreler daha sonra hasat edilmiş ve paralel olarak kültürlenir aktif sıçangil splenositlerin nakletmek için kullanılan virüs üretmek için (ARAÇ vektör ve PCL-Çevre plazmidleri içeren) bir DNA / lipid kompleksi kullanılarak transfekte edilir. ARAÇ üretimi sırasında, EGFRvIII pozitif intrakraniyal tümörleri taşıyan sıçangil ana klinik SOC kıyaslanabilir dozlarda parçalanmış tüm beyin X-ışını radyasyon ve sistemik TMZ tedavisi uygulanır. ARAÇ T hücreleri daha sonra lymphodepleted bilgisayarlar intravenöz teslim edilir.
Aşağıdaki prosedür, yedi ayrı haldeki evreler içinde tarif edilmektedir: Tümör taşıyan, Tümör taşıyan fareler (2) tüm beyin ışınlama, fareler (3) Transfeksiyonu için temozolomid (1) Uygulama (4) splenektomi ve T hücre hazırlanması, (5 Tümör taşıyan fareler için (6) CAR T hücre Kültür ve Hasat ve (7) CAR T hücre yönetimi) İletimi. Bu aşamalar 6-7 güne yayılan ve aynı anda yapılmaktadır birkaç adım oluşmaktadır.
Burada anlatılan tedavi çizelgesi bakım, klinik standart modeli ve ARAÇ evlat edinen tedavisi için etkisini kaldıraç için tasarlanmıştır. ARAÇ T hücresi doz TMZ rejimleri ve radyoterapi uygulama vivo T hücre aktivitesi, lymphodepletion ve tümör öldürülmesi geliştirmek için modifiye edilebilir. TMZ rejimleri ana miyeloablasyon ile adoptif transfer hücreler 30 artmış genişleme elde etmek için arttırılabilir. Böylece SOC tümörisidal özelliklerini engellemeyi, – (…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge Dr. Laura Johnson and Dr. Richard Morgan for providing the CAR retroviral construct. The authors also thank Giao Ngyuen for her assistance with dosimetry for whole brain irradiation. This work was supported by an NIH NCI grant 1R01CA177476-01.
Name of Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector | Imgenex | 10045P | Helper vector for generating CAR retrovirus |
Concanavalin A | Sigma Aldrich | C2010 | Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction |
Retronectin | ClonTech/Takara | T100B | Facilitates retroviral transduction of T cells |
Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Transfection reagent |
DMEM, high glucose, pyruvate | Life technologies | 11995-065 | HEK293 culture media |
RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | T cell culture media |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life technologies | 11058-021 | Transfection media |
200 mM L-Glutamine | Life technologies | 25030-081 | T cell culture media supplement |
100 mM Sodium Pyruvate | Life technologies | 11360-070 | T cell culture media supplement |
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life technologies | 11140-050 | T cell culture media supplement |
55 mM 2-Mercaptoethanol | Life technologies | 21985-023 | Reducing agent to remove free radicals |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life technologies | 15140-122 | T cell culture media supplement |
Gentamicin (50 mg/mL) | Life technologies | 15750-060 | T cell culture media supplement |
GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum | Gemini Bio Products | 100-500 | Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth |
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Standard Grade | Gemini Bio Products | 700-100P | Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates |
Pharm Lyse (10X concentrate) | BD Biosciences | 555899 | Lyses red blood cells during splenocyte processing |
70 µm Sterile Cell Strainers | Corning | 352350 | Filters away large tissue particles during splenocyte processing |
100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine | Corning | 356469 | Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection |
Temozolomide | Best Pharmatech | N/A | Lyophilized powder prepared on the day of administration |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma Life Sciences | D2650 | Necessary for complete dissolution of temozolomide |
Saline | Hospira | IM 0132 (5/04) | Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine |
Ketathesia HCl | Henry Schein Animal Health | 11695-0701-1 | Ketamine solution |
AnaSed | Lloyd Inc | N/A | Xylazine sterile solution 100 mg/mL |