Protocol
Alle dieren werden behandeld volgens de National Institutes of Health richtlijnen. De Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Alabama in Birmingham goedgekeurde gebruik van dieren.
1. Het verkrijgen van RNA en DNA van een verrijkte astrocyten Bevolking met behulp van TL Activated Cell Sorting (FACS) van Astrocyten van Whole Brain Tissue
- Bezadigd dier met CO 2 gedurende 1 minuut en vervolgens snel onthoofden. Ontleden cortex zoals beschreven in Albuquerque et al, 26.; Het is niet noodzakelijk hersenvliezen verwijderd.
Opmerking: Transgene ratten uitdrukken eGFP onder de S100β (een astrocyten marker) promotor werden gegenereerd door Itakura et al 27 en gebruikt voor FACS sorteren van astrocyten.. - Bereid hele hersenhomogenaat met een papaïne dissociatie kit onder niet-steriele omstandigheden volgens het protocol van de fabrikant. Heat activeren papaïne bij 37 ° C in een waterbad gedurende 10 min. Let op:Papaïne oplossing wordt geleverd door fabrikant en bevat L-cysteïne en EDTA (Zie tabel van Materialen).
- Snij of dremel een opening in de top van een 50 ml conische buis te laten uitvoeren buizenstelsel 95% O2: 5% CO 2 wordt toegevoerd aan een gesloten conische buis (figuur 1A). Plaats ontleed cortex in 10 mm kweekschaal met dissociatie medium (MEM gesupplementeerd met 20 mM glucose en penicilline / streptomycine (500 U / ml) en geëquilibreerd met 95% O2: 5% CO 2) en gebruik een schoon scheermesje om weefsel te vermalen in 1 x 1 mm 2 stuks.
- Overdracht weefsel met behulp van 10 ml handmatige pipetman met 50 ml conische buis met papaïne oplossing. Sta weefsel om zich te vestigen op bodem van transferpipet alvorens af te voeren om de hoeveelheid dissociatie media overgedragen minimaliseren. Houd papaïne oplossing geëquilibreerd met 95% O2: 5% CO 2 via oppervlakte gasuitwisseling voor de duur van de incubatie. Niet bubble papaine solutiop. Incubeer weefsel voor 20 min in 37 ° C waterbad.
- Na incubatie in papaïne oplossing, vermaal weefsel 10 keer met een 10 ml transferpipet bij lage snelheid. Centrifuge bewolkte celsuspensie bij 1000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Equilibreer DNase / albumine-remmer oplossing (geleverd door de fabrikant) via oppervlak gasuitwisseling en resuspendeer gepelleteerde cellen in 3 ml DNase / albumine-remmer oplossing. Bereid commerciële gradiënt discontinue dichtheid volgende instructies van de fabrikant.
- Spin discontinue gradiënt dichtheid bij 1000 xg gedurende 6 min. Isoleer gedissocieerde cellen van de bodem van de buis zuigen bodem pellet met behulp van een pipet.
- Resuspendeer gedissocieerde cellen in 2-3 ml van DPBS met 0,02% runderserumalbumine en 1 mg / ml DNase of gewenste HEPES gebufferd kweekmedium. Passeren 40 urn filter vóór FACS (Figuur 2A). Houd cellen op ijs tot het sorteren.
- Voeren FACS 28. </ li>
- Pellet cellen in 1,5 ml centrifugebuizen bij 2000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
Opmerking: Gepelleteerd astrocyten kan onmiddellijk worden gebruikt of -80 ° C bewaard totdat DNA-extractie.
- Extract RNA en DNA met aangewezen isolatie methode 29 30. Beoordelen RNA en DNA-concentratie en kwaliteit via de spectrofotometer en bioanalyzer 31.
Opmerking: Gebruik alleen hoge kwaliteit RNA en DNA in de daaropvolgende stappen, 260/280 = 2,0-2,2 en 1,8-1,9, respectievelijk. Bioanalyzer analyse is essentieel om na afbraak van RNA of DNA fragmentatie. RNA of DNA kan direct worden gebruikt of opgeslagen in -80 ° C of -20 ° C, respectievelijk latere studies.
2. Het beoordelen van DNA methylatie status van een gen met methylatie-gevoelige met hoge resolutie Melt Analyse (MS-HRMA)
- Voer gen sequentie van belang in de voorkeur online methylatie mapping software om elke CpG eilanden in gen te identificerenvan belang 32.
- Ontwerp van primers tegen bisulfiet omgezet DNA-sequentie 33 en versterken met behulp van geprefereerde DNA polymerase volgens het protocol van de fabrikant. Controleer Amplified productgrootte worden uitgevoerd door een 1% agarose gel van DNA bij 100 V gedurende 45 min. WINKEL primers op voorraad concentratie van 20 uM bij -20 ° C.
- Bisulfiet omgezet 500-1000 ng DNA van elk monster en gemethyleerd DNA standaarden variërend van 0-100% van dezelfde diersoort 34. Elueer monsters tot een concentratie van 20 ng / ul verschaffen. Controleer de concentratie van bisulfiet geconverteerde DNA via spectrofotometer 31.
- Setup 20 gl reacties voor MS-HRM amplificatie met gewenste DNA polymerase en primers aan 5 uM concentratie overeenkomstig tabel 1 en 2. Uitvoeren alle monsters, inclusief FACS DNA en gemethyleerde standaarden in drievoud.
- Afhankelijk analysesoftware, vastgesteld voor en na de start en stop parametersrond de overgangen van de smelt curve. Set pre-melt start en pre-smelt stop parameters, zodat het verschil tussen beide is 0,2-0,5 ° C. Set post-smelt start en post-smelt stoppen op vergelijkbare wijze. Extract piek temperatuurverschil gegevens voor elk monster.
- Met behulp procent gemethyleerde standaarden (y-waarde) en de bijbehorende gemiddelde piek temperatuurverschillen (x-value) genereren van een lineaire regressievergelijking (figuur 3A-B, tabel 3-4). Gebruik deze lineaire regressie vergelijking om methylatie status van onbekende monsters 35 schatten.
3. Het beoordelen van Hyper-gemethyleerd promotor activiteit via Gebruik van Luciferase Assay
- Identificeer CpG eilanden van target-gen (Stap 2.1). PCR versterken regio's van belang 36 en kloon stroomopwaarts van de luc2 Firefly luciferasereportergen om CpG-eiland-luc2 plasmiden 37 te produceren.
- Lineariseren 30 ug CpG-eiland-luc2 plasmide via beperkingenzymdigestie 38. Controleer voor restrictie digest en voorkoming van dubbele sneden met favoriete mes software 38. Heat-enzymen inactiveren bij geschikte temperatuur en tijdsduur na digestie volgens het protocol van de fabrikant. Minimaal verlies van DNA optreedt tijdens de linearisatie stap.
- Methylaat gelineariseerde plasmiden met CpG methylase (M.Sssl) O / N bij 30 ° C of laat onbehandeld volgende fabrikant protocol, behalve voor de volgende aanpassingen.
- Voer 50 pi reacties.
- Gebruik 5 eenheden van CpG methylase tot 700 ng gelineariseerde plasmide methyleren.
- Run reacties O / N voor 13-19 uur.
- Na CpG methylase reactie uitgevoerd met behulp van standaard DNA opruimen handel verkrijgbare silicagel membraan schoonmaken kit volgens protocol van de fabrikant. Aanzienlijke verliezen van DNA optreden na CpG methylase reactie, 30-60% verlies.
- Controleer methylering van plasmiden via een Hpa II restrictiedigest. Neem 1 ug van gemethyleerd of niet-gemethyleerd DNA en restrictie digest met Hpa II gedurende 1 uur bij 37 ° C. Gebruik 5-10 eenheden van Hpa II voor elk ug DNA. Na Hpa II vertering uitvoeren DNA opruimen behulp voorkeur, in de handel verkrijgbaar silicagel membraan schoonmaken kit. Run zowel CpG gemethyleerd en niet-gemethyleerd plasmiden op 1% agarose gel in TAE-DNA of TBE buffer bij 100 V gedurende 45 min voor het zichtbaar (Figuur 4B).
- Betreft zowel gemethyleerde en niet-gemethyleerde plasmiden dubbele digestie met geschikte restrictie-enzymen om full-length luc 2 (vector) en CpG eiland (insert) fragmenten 38 vrijgeven. Voeren dubbele ontsluiting O / N op de juiste temperatuur en warmte-inactiveren enzymen volgende spijsvertering volgens het protocol van de fabrikant. Minimaal verlies van DNA-concentratie optreedt tijdens dubbele restrictiedigest.
- Run double verteerd plasmiden op 1% DNA agarosegel bij 100 V gedurende 1 uur toe te staan voor de scheiding of vector en plaats (Figuur 4C). Voorzichtigheid. Het dragen van beschermende UV-gezichtsbescherming, plaatsen DNA-gel op een tafelblad zwart licht aan banden te visualiseren. Op basis van grootte, accijnzen gemethyleerde en niet-gemethyleerde insert en niet-gemethyleerde vector met een schone chirurgische mes.
- Gel extract DNA met verzadigd fenol, pH 6,6. In het kort, wegen DNA gel met vector of insert. Gebruik 100 ul fenol per 0,1 gram DNA gel. Homogeniseren DNA gel in fenol met behulp van glas Dounce homogenisator.
- Chloroform (met 1/5 van fenol volume) toe en schud monsters voor 20 sec. Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende 2-3 min. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij maximale snelheid (16,1 x 1.000 x g) bij 4 ° C.
- Verwijder waterige oplossing en voeg 0,1X volume van 3 M natriumacetaat en 2,5 maal volume ethanol. Incubeer de monsters gedurende 1 uur bij -80 ° C. Na incubatie verwijderen ethanol en resuspendeer DNA in 30 ui buffer voorkeur. Aanzienlijk verlies van DNA optreedt na isolatie van inserts en vectoren, 30-50% loss.
- Opnieuw Ligeer gemethyleerde en niet-gemethyleerde inzetstukken voor niet-gemethyleerd vector met behulp van T4 DNA-ligase 38. Met een 1: 4 verhouding van vector in te voegen voor ligatiereacties. Setup reactie volgens instructies van de fabrikant. Gebruik een totaal volume van 50 pi voor reacties en geïncubeerd O / N bij -20 ° C of op ijs met deksel over ijs emmer.
- Na ligatie uitgevoerd DNA opruimen behulp voorkeur, in de handel verkrijgbaar silicagel membraan schoonmaken kit. Aanzienlijk verlies van DNA optreden na ligatiereactie, bij benadering 30-50% verlies van DNA. Controleer opnieuw ligatie door lopen op 1% agarose gel van DNA bij 100 V gedurende 45 minuten en evalueren concentratie van het opnieuw geligeerde plasmiden (figuur 4D).
- Transfecteren gemethyleerd of niet-gemethyleerd plasmiden in D54-cellen onder toepassing van een commercieel transfectie reagens volgens het protocol van de fabrikant. Seed D54 cellen op 12-well plaat op een 0,14 x 10 6 cellen / well.
- Na 24 uur, transfecteren cellen with gelijke concentraties van ofwel (1) niet methyated CpG-luc2 plasmide + Renilla of andere controle-luciferase vector of (2) gemethyleerde CpG-luc2 plasmide + Renilla of andere controle-luciferase vector.
- Laat cellen te transfecteren voor 24 uur voordat duale luciferasetest. Voer bepaling volgens instructies van de fabrikant. Voer metingen met behulp van een luminometer. Lees elk putje in drievoud.
- Bereken verhouding firefly luciferase activiteit Renilla of andere controle-luciferaseactiviteit. Normaliseren gemethyleerde Firefly: controle luciferase activiteit niet-gemethyleerd Firefly: controle luciferase activiteit met gemethyleerd luciferasewerkzaamheid delen door niet-gemethyleerd luciferaseactiviteit
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een verrijkte populatie van astrocyten werd verworven via FACS sortering van eGFP-S100β transgene dieren 27. Door afnemende kwaliteit van cellen en moleculair molecules die uit dieren ouder dan postnatale dag 50 (p50), dieren p0-p40 ouder zijn optimaal voor dergelijke experimenten. Corticaal weefsel werd gebruikt voor deze experimenten. Cortex vanaf 2 om 6 dieren werden samengevoegd. FACS werd uitgevoerd bij UAB Comprehensive flowcytometrie Core faciliteit. Sorteren werd uitgevoerd op Becton Dickinson FACSAria II. eGFP excitatie werd verkregen met 488 nm laser; geen compensatie nodig was. Een gated bevolking was gericht op basis van voorwaartse en zijwaartse verstrooiing (Figuur 1B). Een live-cel populatie werd bepaald met behulp van een ethidiumbromide dode cel indicator en gated (figuur 1C). Twee verschillende populaties waargenomen gebaseerd op de eGFP profiel (figuur 1D). Door empirische testen, de celpopulatie met hogere eGFPprofiel werd geïdentificeerd als het eGFP-positieve celpopulatie (Figuur 1F-F '). Visueel onderzoek van de tweede populatie met een lager profiel eGFP geopenbaard celfragmenten EGFP, maar zonder kernen, die waarschijnlijk vuil van astrocytische processen (figuur 1 G-G ''). Representatieve beelden van gedissocieerde eGFP positieve astrocyten na dissociatie maar voorafgaand aan het sorteren (Figuur 2A) en na sortering (figuur 2B) getoond. Geïsoleerde eGFP positieve celpopulatie toonden een 40-voudige toename van mRNA ALDH1L1 een astrocytische specifieke marker 39 (figuur 2C). Bovendien, ondanks gezamenlijke expressie van S100β in NG2 + OPC's en astrocyten 39, zagen we een 4-voudige verlaging van NG2 mRNA, een merker voor oligodendrocyt voorloper cellen 39, wijst isoleren van een verrijkte astrocytaire celpopulatie (figuur 2C-D). RNAen DNA geïsoleerd van FACS gesorteerd astrocyten waren voldoende kwaliteit en kwantiteit te worden gebruikt voor verdere studies methylering. Totaal RNA en DNA geïsoleerd van verschillende leeftijden en het aantal dieren wordt genoemd als een referentie voor de verwachte opbrengst van moleculair molecules volgende FACS (Tabel 5). Opgemerkt wordt dat de opbrengst eveneens variëren afhankelijk van het aantal gebruikte dieren, incubatietijd en ervaring onderzoeker. Tabel 6 toont de variabiliteit van gebeurtenissen verworven afhankelijk van het aantal gebruikte dieren en incubatieperioden.
Voor methylatie studies, te beginnen met een hoge kwaliteit en voldoende hoeveelheden DNA is essentieel voor een succesvolle downstream-toepassingen. Om voldoende afbraak van het weefsel zorgen voor RNA of DNA-extractie, alle homogenisering van weefsels of cellen werd gevolgd door trituratie met behulp van een 23G naald 7x, zorg om te voorkomen dat schuimvorming tijdens lysis. Zodra hoge kwaliteit DNA wordt gewonnen en bisulfiet bekeerlinged, regio's van belang kan worden gericht voor MS-HRMA. Merk op dat bij de beoordeling van de kwaliteit en de concentratie van bisulfiet geconverteerde DNA, spectrofotometer moet worden ingesteld om te lezen op een OD factor 33 als bisulfiet omgezet DNA enkelstrengs. De 260/280-waarden voor bisulfiet geconverteerde DNA varieerde 2,20-2,70.
Voor het begin methylering studies, is het essentieel om passend te selecteren en te kalibreren een thermische cycler voor MS-HRMA studies. Bovendien moet men bepalen hoe ruwe data gegenereerd uit MS-HRMA exporteren en gebruiken. Applied Biosystems met hoge resolutie Smelten de slag werd gebruikt om te helpen bij het kalibreren van de 7900HT thermocycler. Uiteindelijk werd de gegevens gehaald en in HRM analyse software voor verdere data-analyse geïmporteerd. Zoals beschreven in het protocol, voor en na de start en stop parameters werden ingesteld in de buurt van de overgangen van de smelt curve. Piektemperatuur verschillen werden gebruikt om de methylatie status van onbekende sa extrapolerenmples. Geschatte methylatie data verkregen van MS-HRMA nauw overeen met methylatie data gegenereerd uit Pyrosequencing (pyrosequencing data gegenereerd in huis met behulp van primers gericht dezelfde regio's als MS-HRM primers) (figuur 3C) 15.
Een dubbele luciferase-assay werd gebruikt om de transcriptionele activiteit van hyper-gemethyleerde gebieden van het gen van belang (figuur 4A) beoordelen. Elk CpG-eiland-luc2 plasmide werd gelineariseerd en vervolgens gemethyleerd. Omdat zowel het inzetstuk (CpG island) en vector (luc2) worden gemethyleerd tijdens de reactie, moet men de gemethyleerde insert uitsnijden en opnieuw ligeren aan een niet gemethyleerd vector. Als gevolg van uitgebreide manipulatie van het plasmide, aanzienlijke verliezen optreden en men moet beginnen voldoende uitgangsmateriaal. HpaII digestie werd gebruikt om de methylatiestatus van elke plasmide te verifiëren en HpaII verteert alleen niet-gemethyleerd DNA (Figuur 4B). Opgemerkt wordt datAls O / N methylering onvoldoende, mogelijk extra 1x SAM en 1x CpG methylase wordt toegevoegd na 1 uur incubatie bij 30 ° C. Doorgaan O / N incubatie na toevoeging van aanvullende SAM en CpG methylase. Generatie van gemethyleerde en niet-gemethyleerde CpG-eiland-luc2 plasmide zorgt voor directe beoordeling van de veranderingen tussen DNA-methylatie en transcriptie-activiteit via de meting van de luciferaseactiviteit.
Figuur 1. FACS sortering isoleert eGFP + cel popoulation. (A) het gebruik van een 50 ml conische buis met gat gesneden op de bovenkant zorgt voor een oppervlakte gasuitwisseling tijdens papaïnedigestie. (B) Gesorteerd cellen werden gated op basis van voorwaartse en zijwaartse verstrooiing percelen. (C) Een ethidiumbromide gebaseerd dode cel indicator werd gebruikt om de poort van een levende cellen populatie (rood). (D) Levende cell bevolking toonde twee populaties - één met een hoog eGFP profile (groen) en een lage eGFP profiel (paars). Voor alle grafieken, y-as geeft zijwaartse verstrooiing area (SSC-A); x-as geeft voorwaartse verstrooiing area (FSC-A), groene fluorescent eiwit omgeving (GFP-A) of ethidiumbromide (EtBr). (EG) gedissocieerde cellen werden geïncubeerd met Hoechst en 20 pl cellen werd gescheiden op dekglaasje geplaatst en afgebeeld. (EE) eGFP + astrocyten, met uitgebreide processen gevisualiseerd vóór sortering (NS). (FF '') Na het sorteren, hoge eGFP + populatie (POS) tonen eGFP + cel soma, die co-lokaliseren met Hoechst kleuring. (GG ') Lage eGFP bevolking demonstreert eGFP + vlekken die niet samen lokaliseren met Hoechst kleuring, waarschijnlijk neerkomt astrocytische puin (voor alle beelden, schaal = 20 pm). Gelieveklik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. FACS sortering van eGFP-S100 β transgene dieren biedt verrijkte populatie van astrocyten. (A) 20 gl van gedissocieerde cellen voor FACS (NS) getoond, processen intact blijven (schaal = 50 pm). (B) representatief beeld post-FACS (FACS) cellen worden getoond; astrocytische processen worden verwijderd en cel soma overblijfselen (schaal = 20 pm). (C) qPCR gegevens tonen een 40-voudige toename van ALDH1L1 mRNA in FACS gesorteerde cellen (FACS) in vergelijking met niet gesorteerd populatie (NS). (D) NG2 mRNA wordt verminderd met 4-voudig in FACS gesorteerde cellen in vergelijking met niet gesorteerd bevolking (NS). Klik hier om bekijk een grotere versie van deze figuur.
Figuur 3. Sample data en analyse voor MS-HRM studies. (A) Voorbeeld van temperatuurverschil percelen gegenereerd op basis van methylatie normen. Overeenkomstige procent methylering bestemd is voor elke curve (B) Voorbeeld lineaire regressievergelijking gegenereerd rat gemethyleerde standaarden. (C) Vergelijking van het percentage methylatie verworven van pyrosequencing (pyroseq, groene balken) en MS-HRMA (grijze balken) toont een vergelijkbaar niveau van methylering voor uiteenlopende gebieden van KCNJ10. Pyrosequencing gegevens gegenereerd in huis met behulp van primers gericht dezelfde regio's als MS-HRM analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Dual luciferasetest zorgt voor een evaluatie van de transcriptie-activiteit van differentieel gemethyleerde genen regio's. (A) Schematische weergave van luciferase transcriptieactiviteit test toont de workflow van het protocol. (B) DNA gel displays verschillen in gemethyleerde versus niet-gemethyleerd plasmiden volgende Hpall spijsvertering. Niet-gemethyleerd DNA wordt gemakkelijk gedigereerd volgende HpaII digestie opzichte van gemethyleerd DNA, demonstreren succesvolle methylering van DNA plasmide. (C) DNA-gel toont scheiding van vector van insert volgende dubbele ontsluiting. Volgende DNA scheiding, vector en insert zijn gel gewonnen. (D) DNA-gel toont succesvolle re-ligatie van de vector en insert. Re-geligeerde plasmide bezit vergelijkbaar moleculair gewicht als onbehandelde plasmide (uNTx). NM, non-methylated; M, gemethyleerde; RL, opnieuw geligeerd; uNTx, onbehandeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| . | Volume (pl) | x3 + 10% overmaat | x # monsters |
| MeltDoc MM | 10 gl | 33 ul | |
| Primer 1 | 1,2 pl | 3,96 pi | |
| Primer 2 | 1,2 pl | 3,96 pi | |
| gDNA | 1 gl | --- | |
| dH 2 0 | 6,6 pl | 21.78 pi |
Tabel 1. Rekenvoorbeeld van MeltDoctor Mastermix. Voer elke MS-HRM reaActies in drievoud met 10% overmaat compenseren pipetteerfout. Laatste kolom geeft berekeningen die nodig zijn voor meerdere nummers van monsters. Totale volume van elke reactie wordt 20 pl.
| Cyclus | Temp (° C) | (Sec) | Ramp-tarief (%) |
| 95 ° C | : 15 | 100 | |
| 40x | 95 ° C | : 15 | 100 |
| 60 ° C | : 60 | 100 | |
| Smelten parameters | 95 ° C | : 10 | 100 |
| 60 ° C | : 60 | 100 | |
| 95 ° C | : 15 | 1 | |
| 60 ° C | : 15 | 100 | |
| Houden | 4 76; C |
Tabel 2:. Monsterprotocol voor amplificatie Denatureren monsters bij 95 ° C gedurende 10 min, gevolgd door 40 cycli van amplificatie en productie van smelt curve. Smelten parameters worden weergegeven in tabel. Opmerking verandering in oprit tarief die het mogelijk maakt voor de aankoop van een hoge resolutie smelttemperatuur.
| Procent Methylatie (Rat Standard) | Peak Temperatuur Verschil |
| y | X |
| 0 | 5.670116 |
| 5 | 10,70448 |
| 10 | 15,5044 |
| 25 | 25,52295 |
| 50 | 34,43047 |
| 75 | 43,80894 |
| 100 | 53,88717 |
| Peak Temp Verschil | Geschatte methylatie |
| X | Y |
| Monster 1 (n = 4) | |
| 47,450 | 81,115 |
| 46,292 | 78,657 |
| 41,694 | 68,894 |
| 47,292 | 80,779 |
| Monster 2 (n = 4) | |
| 29,925 | 43,904 |
| 24,269 | 31,894 |
| 25,061 | 33,575 |
| 25,389 | 34,272 |
Tabel 4. Voorbeeld berekende geschatte percentage methylatie. Extra temperatuurverschil van monsters van onbekende methyleringsstatus wordt gebruikt voor het schatten procent methylering met behulp van een lineaire regressievergelijking. Representatieve gegevens uit twee verschillende omstandigheden, Monster 1 en Voorbeeld 2 worden getoond; n = 4 voor elke conditie.
| Leeftijd | Aantal dieren | Totaal RNA (ng) | Totaal DNA (ng) |
| p4-p10 | 3-6 | 455-868 | 265-1523 |
| p19-p22 | 1-2 | 220-680 | 583-1483 |
| p40-p50 | 3-4 | 198-260 | 578-1700 |
Tabel 5. Totaal RNA en DNA overgenomen van FACS gesorteerde cellen. Leeftijd en het aantal gebruikte dieren in de FACS experimenten worden weergegeven. Let werden beide cortices gebruikt voor elke N. Totaal RNA en DNA wordt opgenomen als referentie voor verwachte opbrengst.
| Leeftijd | Aantal dieren | Pos Evenementen | Neg Evenementen | Incubatietijd (bij 37 ° C) |
| P26 | 1 | 2.18X10 ^ 6 | 1.15X10 ^ 6 | 20:00 min |
| P26 | 2 | 4.4X10 ^ 6 | 2.78X10 ^ 6 | 20:00 min |
| P26 | 2 | 9.2X10 ^ 6 | 3.3X10 ^ 6 | 30:00 min |
Tabel 6. Aantal gebeurtenissen verworven van FACS op postnatale dag 26. p26 aantal positieve (eGFP +) events en negatieve gebeurtenissen varieert afhankelijk van het aantal gebruikte dieren en incubatietijd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| Methyl Primer | Applied Biosystems | online | software to localize CpG Islands |
| EZ DNA methylation Kit | Zymo Research | D5001 | |
| Rat Premixed Calibration Standard | EpiGenDx | 80-8060R-Premix | |
| CpG Methylase (M.Sssl) | Zymo Research | E2010 | |
| QIAquick Gel Extraction | QIagen | 28704 | Used for gel extraction and DNA cleanup |
| Restriction enzymes | New England BioLabs | ||
| NEB cutter | New England BioLabs | online | verify restriction digest sites |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Luc2 vector, pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| renilla vector, pGL4.74 | Promega | E2241 | |
| TD-20/20 Luminometer | Turner Designs | ||
| Lipofectamine LTX and Plus Reagent | Life Technologies | A12621 | |
| Phenol, saturated pH 6.6/6.9 | Fisher Scientific | BP 17501-100 | |
| Nanodrop 2000/2000c Spectrophtometer | ThermoScientific | ||
| MeltDoctor Master Mix | Life Technologies | 4415440 | |
| High Resolution Melt (HRM) Software v2.0 | Life Technologies | 4397808 | |
| AB SDS software v2.3 | Life Technologies | online | |
| AB High Resolution Melting Getting Started Guide | Life Technologies | online | |
| AB 7900HT Fast Real-Time System | Life Technologies |
References
- Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16 (1), 6-21 (2002).
- Deaton, A. M., Bird, A. CpG islands and the regulation of transcription. Genes Dev. 25, 1010-1022 (2011).
- Lorincz, M. C., Dickerson, D. R., Schmitt, M. Intragenic DNA methylation alters chromatin structure and elongation efficiency in mammalian cells. Nat Struct. Mol Biol. 11 (11), 1068-1075 (2004).
- Moore, L. D., Le, T. DNA methylation and its basic function. Neuropsychopharmacol. 38, 23-38 (2013).
- Santos, K. F., Mazzola, T. N. The prima donna of epigenetics: the regulation of gene expression by DNA methylation. Braz.J.Med.Biol.Res. 38 (10), 1531-1541 (2005).
- Day, J. J., Sweatt, J. D. Cognitive neuroepigenetics: a role for epigenetic mechanisms in learning and memory. Neurobiol. Learn.Mem. 96, 2-12 (2011).
- Denk, F., McMahon, S. B. Chronic pain: emerging evidence for the involvement of epigenetics. Neuron. 73, 435-444 (2012).
- Endres, M., et al. DNA methyltransferase contributes to delayed ischemic brain injury. J. Neuroscience. 20 (9), 3175-3181 (2000).
- Qureshi, I. A., Mehler, M. F. Emerging role of epigenetics in stroke: part 1: DNA methylation and chromatin modifications. Arch.Neurol. 67, 1316-1322 (2010).
- Tian, R., et al. disease mutant glial fibrillary acidic protein compromises glutamate transport in astrocytes. J Neuropathol. Exp Neurol. 69, 335-345 (2010).
- Perisic, T., Holsboer, F., Rein, T. The CpG island shore of the GLT-1 gene acts as a methylation-sensitive enhancer. Glia. 60 (9), 1345-1355 (2012).
- Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
- Poopalasundaram, S., et al. Glial heterogeneity in expression of the inwardly rectifying K+ channel, Kir4.1, in adult rat CNS. Glia. 30, 362-372 (2000).
- Hibino, H., Fujita, A., Iwai, K., Yamada, M. Differential assembly of inwardly rectifying K+ channel subunits. Kir4.1 and Kir5.1, in brain astrocytes. 279, 44065-44073 (2004).
- Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
- Li, L., Head, V. Identification of an inward rectifier potassium channel gene expressed in mouse cortical astrocytes. Glia. 33, 57-71 (2001).
- Kucheryavykh, Y. V., et al. Downregulation of Kir4.1 inward rectifying potassium channel subunits by RNAi impairs potassium transfer and glutamate uptake by cultured cortical astrocytes. Glia. 55 (3), 274-281 (2007).
- Djukic, B., Casper, K. B., Philpot, B. D., Chin, L. S. Conditional knock-out of Kir4.1 leads to glial membrane depolarization, inhibition of potassium and glutamate uptake, and enhanced short-term synaptic potentiation. J. Neuroscience. 27, 11354-11365 (2007).
- Fujita, A., et al. Clustering of Kir4.1 at specialized compartments of the lateral membrane in ependymal cells of rat brain. Cell Tissue Res. 359 (2), 627-634 (2015).
- MacFarlane, S. N., Sontheimer, H. Electrophysiological changes that accompany reactive gliosis in vitro. J Neuroscience. 17 (19), 7316-7329 (1997).
- Ambrosio, R., Maris, D. O., Grady, M. S., Winn, H. R. Impaired K(+) homeostasis and altered electrophysiological properties of post-traumatic hippocampal glia. J. Neuroscience. 19 (18), 8152-8162 (1999).
- Anderova, M., et al. Voltage-dependent potassium currents in hypertrophied rat astrocytes after a cortical stab wound. Glia. 48 (4), 311-326 (2004).
- Olsen, M. L., Campbell, S. C., McFerrin, M. B., Floyd, C. L. Spinal cord injury causes a wide-spread, persistent loss of Kir4.1 and glutamate transporter 1: benefit of 17 beta-oestradiol treatment. Brain. 133, 1013-1025 (2010).
- Koller, H., Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Time course of inwardly rectifying K(+) current reduction in glial cells surrounding ischemic brain lesions. Brain Res. 872, 1-2 (2000).
- Bordey, A., Lyons, S. A., Hablitz, J. J. Electrophysiological characteristics of reactive astrocytes in experimental cortical dysplasia. J Neurophysiol. 85 (4), 1719-1731 (2001).
- Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P. plating, and maintenance of cortical astrocyte cultures. 8, Cold Spring. 10-1101 (2009).
- Itakura, E., et al. Generation of transgenic rats expressing green fluorescent protein in S-100beta-producing pituitary folliculo-stellate cells and brain astrocytes. Endocrinology. 148, 1518-1523 (2007).
- Foo, L. C. Purification of astrocytes from transgenic rodents by fluorescence-activated cell sorting. Cold Spring Harb.Protoc. 2013, 551-560 (2013).
- Smith, C., Otto, P., Bitner, R. A silica membrane-based method for the isolation of genomic DNA from tissues and cultured cells. CSH. Protoc. 2006, 2006-201 (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. A Single-step Method for the Simultaneous Preparation. of DNA, RNA, and Protein from Cells and. 1, 2006-201 (2006).
- Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K. Quantitation of DNA and. , (2007).
- Zhao, Z., Han, L. CpG islands: algorithms and applications in methylation studies. Biochem. Biophys. Res. Commun. 382, 643-645 (2009).
- Srivastava, G. P., Guo, J., Shi, H. PRIMEGENS-v2: genome-wide primer design for analyzing DNA methylation patterns of CpG islands. Bioinformatics. 24, 1837-1842 (2008).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J.Vis.Exp.(56), doi:3170 [pii];10.3791/3170. , (2011).
- Drummond, G. B., Vowler, S. L. Categorized or continuous? Strength of an association-and linear regression. Adv.Physiol Educ. 36, 89-92 (2012).
- Sambrook, J., Russell, D. W. The basic polymerase chain reaction. CSH.Protoc. 1, (2006).
- Arpa, P. Strategies for cloning PCR products. Cold Spring Harb.Protoc. 8, (2009).
- Makovets, S. Basic DNA electrophoresis in molecular cloning: a comprehensive guide for beginners. Methods Mol.Biol. 1054, 11-43 (2013).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neuroscience. 28, 264-278 (2008).
- Maldonado, P. P., Velez-Fort, M., Levavasseur, F. Oligodendrocyte precursor cells are accurate sensors of local K+ in mature gray matter. J Neuroscience. 33, 2432-2442 (2013).
- Kalsi, A. S., Greenwood, K., Wilkin, G. Kir4.1 expression by astrocytes and oligodendrocytes in CNS white matter: a developmental study in the rat optic nerve. J.Anat. 204, 475-485 (2004).
- Higashi, K., et al. An inwardly rectifying K(+) channel, Kir4.1, expressed in astrocytes surrounds synapses and blood vessels in brain. Am.J.Physiol Cell Physiol. 281 (3), (2001).
- Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
- Neusch, C., Rozengurt, N., Jacobs, R. E., Lester, H. A. Kir4.1 Potassium Channel Subunit Is Crucial for Oligodendrocyte Development and In Vivo Myelination. J. Neuroscience. 21 (15), 5429-5438 (2001).
- Kofuji, P., et al. Genetic Inactivation of an Inwardly Rectifying Potassium Channel (Kir4.1 Subunit) in Mice: Phenotypic Impact in Retina. J. Neuroscience. 20 (15), 5733-5740 (2000).
- Kofuji, P., Connors, N. C. Molecular substrates of potassium spatial buffering in glial cells. Mol.Neurobiol. 28, 195-208 (2003).
- Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
- Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high-resolution melting. Nat.Protoc. 3, 1903-1908 (2008).
- Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation. Nucleic Acids Res. 35, 10-1093 (2007).
- Laird, P. W. Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis. Nat.Rev.Genet. 11, 191-203 (2010).
