Abstract
I de fleste hvirveldyr, leveren producerer galde, som er nødvendig for at emulgere absorberede fedtstoffer og muliggøre fordøjelse af lipider i tyndtarmen samt at udskille bilirubin og andre metaboliske produkter. I leveren, den eksperimentelle obstruktion af ekstrahepatisk galdeveje initierer en kompleks kaskade af patologiske begivenheder, der fører til cholestasis og inflammation resulterer i en stærk fibrotisk reaktion, der stammer fra de periportale områder. Derfor har kirurgisk ligering af den fælles galdegang blevet den mest anvendte model til at fremkalde obstruktiv kolestatisk skade hos gnavere og undersøge de molekylære og cellulære begivenheder, der ligger til grund for disse patofysiologiske mekanismer fremkaldt af uhensigtsmæssig galde flow. I de senere år har forskellige kirurgiske teknikker blevet beskrevet som enten tillader gentilslutning eller reanastomosis efter galdegang ligering (BDL), fx delvis BDL eller andre mikrokirurgiske metoder til specifikke forskningsspørgsmål. Den hyppigst anvendte model er den komplette obstruktion af den fælles galdegang, der inducerer et stærkt fibrotisk respons efter 21 til 28 dage. Dødeligheden kan være høj på grund af infektiøse komplikationer eller tekniske unøjagtigheder. Her giver vi en detaljeret kirurgisk procedure for BDL model i mus, der inducerer en meget reproducerbar fibrotisk reaktion i overensstemmelse med 3R reglen for dyrevelfærd postuleret af Russel og Burch i 1959.
Introduction
Lever fibrose er defineret som den overdrevne produktion og akkumulering af ekstracellulær matrix (ECM), der stammer fra et komplekst netværk af interaktioner af matrix-producerende hepatiske stjerneformige celler og en bred vifte af lever-resident og infiltrerende celler blodceller 1,2. Selv leverfibrose kan være forårsaget af en lang række forskellige stimuli de molekylære mekanismer, der ligger fibrose er generelt meget ens. Efter leverskade, er et stærkt orkestreret program af molekylære og cellulære forandringer initieres. I dette program opstår et tæt samspil mellem inflammatoriske signaler, monocytter / makrofager og hepatiske stjerneformige celler, der på de endelige resultater i stjerneformet celle aktivering og transdifferentiering til myofibroblaster, ECM deposition og på hinanden følgende anatomiske og funktionelle ændringer af levervæv integritet 3. Aktivering af hepatiske stjerneformige celler er især drevet af inflammatoriske signaler og interaktioner med leverenresidental makrofager (dvs. Kupffer-celler). Patogen forbundet molekylære mønstre er anerkendt af specialiserede receptorer mønstergenkendelse såsom toll-lignende receptorer, som, når det aktiveres signal gennem et komplekst netværk af forskellige veje, der udløser ekspressionen og sekretionen af et væld af inflammatoriske cytokiner og chemokiner, der driver den inflammatoriske proces 3. Den inflammatoriske reaktion, og det dannede hepatisk insult er kun midlertidig, når sygdommen-producerende faktor fjernes. I modsætning, hvis skaden fortsætter, kronisk inflammation udvikler i leveren og ekspression og akkumulering af ECM skarer i forgrunden resulterer i progressiv substitution af normal leverparenkym af arvævsdannelse.
Da nedsat fibrogenese hos mennesker er et verdensomspændende klinisk problem, har flere eksperimentelle gnavermodeller for akut og kronisk leversvigt blevet etableret i løbet af de seneste årtier. I muRine for eksempel almindelige modeller er administration af en række forskellige hepatotoxins, ligering af den fælles galdegang, induktion af immun-medieret leverskade og målrettet indførelse af gendefekter eller omvendt overekspression af transgener, der påvirker kritisk signalveje, der er involveret i patogenesen af leverfibrose 4.
Ligering af den fælles galdegang hos gnavere er udført som en eksperimentel procedure i forskning i mange år 5-8. En første meget reproducerbar protokol for langvarig galdegang ligation (BDL) i gnavere blev allerede fremlagt nu mere end tre årtier siden 9. I denne protokol både kanylering / obstruktion og ligering inducerede et højt udbytte af skrumpelever i rotter med morfologiske ændringer, der var sammenlignelig med det i human biliær cirrose 9. De respektive protokol er enkel, den kirurgiske procedure er relativt hurtigt umiddelbartOg af overlevelsesprocenten for dyrene er høj med over 95%. I den klassiske rotte kanylering / obstruktion protokollen, er en kort indsnit i 2 cm lavet lige under formet som et sværd proces. Derefter er en kanyle indsat i den proximale del af galdegangen og fikseret i sin position med silkesuturer. I et næste trin er den distale del af kanylen blokeret med 3 knob, ført gennem den nedre ende af midterlinjen indsnit og begravet subkutant i den højre nedre kvadrant 9. Ved afslutningen er maven lukket, og dyrene får lov til at komme sig. I ligering protokol rotterne underkastet dobbelt ligering af den fælles galdegang enten med eller uden dissektion af galdegangen mellem ligaturer 9.
Denne eksperimentelle model er blevet godt modtaget, og anvendes i hele verden i hundredvis af laboratorier til at fremkalde liver kolestase og fibrose. Det inducerer intrahepatisk galde epitelcelleproliferation, myofibroblastisk differentiation portal fibroblaster rundt prolifererende biliære epithelceller, hvilket resulterer i en meget reproducerbar, massiv ekspression og aflejring af ECM 10,11. Derfor er anvendelsen af denne model i rotter og mus er populær blandt forskere, der har til formål at forstå patogenesen af hepatisk inflammation og fibrose.
I vores laboratorium har vi flittigt brugt denne protokol i fortiden hos rotter i flere eksperimentelle undersøgelser har til formål at undersøge særlige molekylære og cellulære aspekter af hepatisk fibrogenese og afprøve nye antifibrotiske begreber og narkotika 12-15.
For nylig har vi tilpasset denne metode til det murine system, og fandt, at galdegang ligation kirurgi er også en attraktiv middel til at etablere tidsafhængig fibrose med lav variation og dødelighed i mus 16-18. På grund af den mindre størrelse af dyrene dog nogle vigtige ændringer med hensyn til anæstesi, kirurgisk interventionention og efterbehandling observation er nødvendige for at få pålidelige og reproducerbare resultater i denne model. Den komplette tilpasning er opsummeret i den følgende protokol og i den ledsagende video dokumentation.
Protocol
BEMÆRK: Alle forsøg blev godkendt af den officielle statslige pasning af dyr og brug udvalg (LANUV, Recklinghausen, Tyskland). Musene huses under specifik patogenfrie betingelser i henhold til retningslinjerne af Federation for forsøgsdyrsvidenskab Associations (FELASA). Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med den tyske føderale lovgivning om beskyttelse af dyr og "Vejledning til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr" (National Institutes of Health publikation 8. udgave, 2011).
1. Presurgical Forberedelse
BEMÆRK: Alle procedurer udføres under rene, men ikke-sterile forhold. Alle instrumenter og andet genanvendeligt udstyr såsom kirurgiske tænger, sakse, og Colibri retractor, der bruges til at udføre kirurgi, skal steriliseres inden brug i henhold til protokoller, der er i nøje overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer for udførelse af operationer på dyr.; For en detaljeret liste over nødvendige reagenser, materialer og udstyr, henvises til listen over specifikke materialer / udstyr.
- Under den komplette eksperimenter, holde dyret på en varmeplade ved en temperatur på 37 ° C, permanent forbundet med en anæstesi-system, og dækning af de operationelle område generelt med fluiduigennemtrængeligt, selvklæbende gardiner. Korrekt arrangere alle besætninger og løsninger, der bruges i løbet af eksperimenter inden kirurgi (Figur 1).
- Bedøver musen med inhalation af 4 vol% isofluran i 100% oxygen ved en strømningshastighed på 4 l / min til induktion af anæstesi. Dybden af bedøvelse er tilstrækkelig, når følgende vitale kriterier er nået: regelmæssig spontan vejrtrækning, ingen refleks efter indstilling af smerte stimuli mellem tæerne, og ingen reaktion på smerte.
- Barber abdominale pels af musen med en elektrisk pels barbermaskine og beskytte øjnene mod udtørring ved brug af øjet og nose salve.
- Placer musen på et 37 ° C opvarmede varmeplade, indsætte musen snude i Fluovac masken af Fluovac anæstesi-systemet, og løse ben dyret med striber af silke bånd.
- Oprethold anæstesi af musen ved inhalation af 1,5-3 vol% isofluran i 100% oxygen ved en strømningshastighed på 1 l / min og induct perioperative analgesi via intraperitoneal injektion af buprenorphin opløsning (0,1 mg / kg BW opløst i 0,9% NaCl-opløsning) .
- Steriliser barberet abdominal hud med en gaze, som er fugtet med et standard antiseptisk, klar til brug alkoholisk opløsning til præoperativ behandling af huden. Bemærk: I vores protokoller bruger vi en poly-alkohol hud antisepticum. Dette er i fuld overensstemmelse med den tyske føderale lovgivning om beskyttelse af dyr og retningslinjerne af Federation for forsøgsdyrsvidenskab Foreninger. Denne antiseptisk indeholder 70% (v / v) 2-propanol, butan-1,3.diol og spor af quinolingult og perfume.
2. Kirurgiske Procedurer
- Åbn maven med en midterlinje laparotomi af en længde på ca. 2 cm ved at skære cutis plus fascia samtidig med en 11,5 cm kirurgisk saks.
- Dissekere bindevæv oven på peritoneum ved at bruge saks som en spreder.
- Skær bughinden langs linea alba at åbne bughulen.
- Forstør hulrummet ved at indsætte en bedrift sutur i brystbenet, hæve glødetråd af suturen, og om fastsættelse af det oven på Fluovac masken.
- Spred operationsområdet ved at indsætte en Colibri retraktor i bughulen (figur 2).
- Løft leveren med en fugtet (0,9% NaCl-opløsning) vatpind, således at den ventrale side af det klæber til membranen og hilum er klart synlig.
- Frilægges galdegangen ved caudal bevægelse af tarmen (figur 3).
- Adskil forsigtigt galdegangen fraflankerende portal vene og hepatisk arterie ved hjælp af en mikro-savtakker pincet (figur 4A).
- Placer 5-0 sutur rundt galdegangen og fastgør det med to kirurgiske knuder. Når binde knuder øge trækkraften kontinuerligt at sikre en effektiv obstruktion uden overskæring galdegangen (figur 4B).
- Tilføj en anden kraniel ligering på samme måde, men ikke dissekere galdegangen mellem (figur 4C). Ellers er der en betydelig risiko for, at galde lækage hvis en knude ikke er sikker, og dyrene oplever ingen kolestase men udvikler alvorlige bughindebetændelse.
- Skær enderne af suturerne (figur 4D), lavere brystbenet, og fjern retraktoren.
- Skyl bughulen med 0,9% NaCl-opløsning og erstatte de abdominale organer til de fysiologiske stillinger.
- Luk både abdominal lag (bughinden og cutis plus instrumentpanel) med separat kørende suturer med 6-0 Mersilk.
- Skær eNDS af suturer og sterilisere operationsområdet med en gaze vædet med antiseptisk opløsning.
BEMÆRK: Når du udfører operationen for første gang, skal du udføre alle procedurer i henhold til en kirurgisk mikroskop ved en forstørrelse på 16X-20X. Dette giver en bedre erkendelse af galdegangen og klart adskiller det fra portalen vene og hepatisk arterie (figur 5 og 6). Nogle laboratorier anbefaler dissektion af galdegangen i mellem de to ligaturer. Lad galdegang intakt fordi potentielle utætheder i en af knuderne vil resultere i alvorlig akut peritonitis, ascites, og systemisk endotoxæmi når galdegangen dissekeres.
3. Postoperativ behandling og opfølgning
- Lad musen til at komme sig i et bur varmet op af en infrarød lampe indtil musen er helt vågen og aktiv.
- Bagefter flytte musen til et normalt bur og give ad libitum adgang til vand og mad.
- After operationen, overvåge dyrene med jævne mellemrum og udføre opfølgende postoperativ behandling med passende analgesi (f.eks buprenorphin løsning) efter den lokale anbefaling af det indre pasning af dyr og brug udvalg.
BEMÆRK: Udfør smertestillende behandling i 3 dage. Enhver unormal opførsel kan indikere sjældne komplikationer såsom peritonitis, sepsis eller indre blødninger, og skal håndteres som menneskelig endepunkt at afslutte eksperimentet. - Dyrene holdes med fri adgang til foder og vand ad libitum indtil slutningen af eksperimentet. Der er ikke behov for blod tegning siden løbende fibrogenese er angivet med gulsot.
- Når dyr aflives, er blod indsamles til måling af klinisk-kemiske parametre (AST, ALT, bilirubin etc.) og leveren hentes til histokemisk og biokemisk analyse.
Representative Results
I et typisk forsøg BDL blev udført i 40 C57BL / 6-vildtypemus vejer omkring 18-20 gram. Dette eksperiment blev udført for at undersøge hepatisk fibrogenese i indledningen fase (3 og 7 dage) under progression (10, 14, og 20 dage), og under langvarig (30 og 60 dage) 16. I denne model har persinusoidal fibrose allerede udviklet på dag 10 efter operationen, mens periportal fibrose der permanent øges op til afslutningen af eksperimentet var fuldt udviklet efter 20 dage. I nævnte eksperiment alle dyr, der modtog en enkelt sham-operation overlevede, og kun to af de 40 mus (5%), der modtog BDL udviklet en dårlig almentilstand og blev derfor tidligt aflivet før den planlagte slutpunkt af eksperimentet. Aktiviteten af skinopererede dyr var uden undtagelse allerede normal en dag efter laparotomi, mens de fleste af de dyr, der BDL udviste reduceret aktivitet i de første tre dage. Jaundiced hud havde været allerede tydelig i alle BDL dyr en eller to dage efter indstilling af BDL 16.
Værdierne for både alaninaminotransferase (ALT) og aspartat transaminase (AST), der repræsenterer veletablerede serum markører for leverskade hurtigt steg og toppede i dag 7 og dag 20 efter BDL (tabel 1). Derefter ALT og AST faldt støt indtil dag 30 og var stabil indtil 60 dage efter operationen. I overensstemmelse med kolestatisk skade, serumkoncentrationer af total bilirubin var støt ophøjet og nåede et plateau efter 7 dage 16. Lignende tidsforløb for ALT og AST serum aktiviteter blev også rapporteret for rotter, der undergik BDL. Det var i en nylig undersøgelse der viser, at serum AST og ALT-niveauet steg op til 5 eller 10 gange den normale ved den første uge efter BDL kirurgi og faldt efter to uger 19.
Typisk lever fra skinopererede dyr, der stadig ser Smooth ved afslutningen af forsøget, mens leverne hos dyr, der modtog BDL viser arkitektoniske ændringer, der hovedsagelig er karakteriseret ved dannelsen af ødem og fibrotiske noduler på overfladen af tilsvarende lever og hydrops i galdeblæren, der er fyldt med store mængder galde (figur 7). De karakteristiske morfologiske ændringer i leveren, der induceres af BDL kirurgi er også påviselige i standard histologisk analyse (figur 8).
I det samme sæt af eksperimenter, udvikling af leverfibrose var semi-kvantitativt vurderet baseret på leverhistologien evalueret af en blindet patolog under anvendelse af et pointsystem, hvor periportal fibrose blev afholdt 0-4 og perisinusoidal fibrose 0-2, hvilket giver en maksimal værdi, der svarede til skrumpelever 6. Som forventet, var den gennemsnitlige fibrose score i gruppen af skinopererede dyr var 0,00 ± 0,00. I modsætning hertil i den gruppe af dyr that modtaget BDL, scoren steget støt indtil dag 60 til en værdi af 4,83 ± 0,17. Det maksimum på 3 for periportal fibrose blev nået på dag 20. I alle dyr analyserede perisinusoidal fibrose var fraværende i de første 10 dage af forsøget og var først mærkbar efter to uger. Derefter steg støt indtil slutningen af eksperimentet til værdier på 1,8 ± 0,17 (tabel 1).
Også i flere andre uafhængige dyreforsøg, der blev udført, blev det observeret, at dannelsen af fibrose var meget reproducerbar viser tidsafhængig stigning i intrahepatisk collagen udtryk og deponering som følge af igangværende fibrogenese (figur 9). Tilsvarende processen løbende fibrogenese er mærkbar i forhøjet ekspression af α-glat muskel-actin (α-SMA), der repræsenterer en markering af fibroblastceller, dvs. aktiverede hepatisk stjerneformige celler og portal myofibroblaster,og hepatisk hydroxyprolin, en aminosyre rigeligt findes i collagenmatricer 18 (figur 9). Desuden er det udtryk for vimentin, der indikerer stigende mængder myofibroblaster eller fibroblaster steg efter indstilling af BDL kirurgi 20. Samtidighedsprincippet af inflammation i tilskadekomne lever yderligere til udtryk ved øget ekspression af Lipocalin 2 (LCN2), der er stærkt induceres under akut og kronisk leverskade og udvikler Lever og beskyttende effekter under akut leverskade 21,22.
Inflammatoriske celler, der infiltrerer leverne hos dyr, der modtog BDL kan påvises ved specifik farvning med et antistof, der er specifikt for CD45 (figur 10). Denne cellulære overflade markør, der også er kendt som PTPRC (proteintyrosinphosphatase, receptor type) udtrykkes specifikt i alle differentierede hæmatopoietiske celler undtagen erythrocytter og plasmaceller.
| Gang på galdegang ligering (dage) | Total bilirubin | AST (U / L) | ALT (U / L) | Portal fibrose | Perisinusoidal fibrose | Total score |
| (Mg / dl) | ||||||
| 0 (n = 3) | 0,17 ± 0,06 | 192,67 ± 30.50 | 50.33 ± 6,03 | 0,0 ± 0,0 | 0,0 ± 0,0 | 0,0 ± 0,0 |
| 3 (n = 5) | 6,85 ± 2,21 | 1159,25 ± 319,27 | 566,50 ± 335,25 | 0,0 ± 0,0 | 0,0 ± 0,0 | 0,0 ± 0,0 |
| 7 (n = 5) | <td> 14.38 ± 2,14 ±976,60 ± 477,16 | 448,20 ± 259,47 | 0,60 ± 0,25 | 0,0 ± 0,0 | 0,60 ± 0,25 | |
| 10 (n = 5) | 15.92 ± 2,60 | 1916,60 ± 868,25 | 560,40 ± 80,88 | 1,40 ± 0,25 | 0,25 ± 0,25 | 1,67 ± 0,25 |
| 14 (n = 5) | 17,90 ± 3,84 | 1088,60 ± 276,32 | 505,00 ± 96,15 ± | 2,4 ± 0,25 | 1,0 ± 0,0 | 3,40 ± 0,24 |
| 20 (n = 4) | 18.00 ± 2.12 | 1072,67 ± 364,27 | 404,00 ± 195,48 | 3,0 ± 0,0 | 1,0 ± 0,0 | 4,0 ± 0,0 |
| 30 (n = 5) | 16.04 ± 4.79 | 446,40 ± 169,75 | 260,20 ± 126,97 | 2,8 ±; 0.2 | 1,4 ± 0,25 | 4,20 ± 0,20 |
| 60 (n = 6) | 16.02 ± 1,19 | 484,67 ± 117,79 | 257,17 ± 50,97 | 3,0 ± 0,0 | 1,8 ± 0,17 | 4,83 ± 0,17 |
Forkortelser er: ALT, alaninaminotransferase; AST, aspartataminotransferase.
Tabel 1: Fibrose udføre i et repræsentativt eksperiment Dataene i denne tabel er gengivet efter en undersøgelse, hvor leverfibrose blev induceret ved galdegang ligering i C57BL / 6 mus 16.. I denne undersøgelse dødeligheden efter BDL operationen var 5% (2 af 40 dyr blev tidligt aflivet, fordi stakkels dyr betingelser udviklet).
Figur 1: Eksperimentel opsætning til udførelse af en galdekanal ligering. Dyret holdes på en varmeplade ved en temperatur på 37 ° C og den operationelle område er dækket samlet med fluiduigennemtrængeligt, selvklæbende gardiner. Under hele operationen, er dyret permanent forbundet til en anæstesi system. Alle instrumenteringer og opløsninger (analgetika, anæstetika, antiseptisk opløsning, 0,9% NaCl) er anbragt tydeligt.
Figur 2:. Fremstilling af kirurgi område Før åbning af bughulen, bør den abdominale hud blive barberet med en elektrisk barbermaskine pels og desinficeres med en antiseptisk gaze. Operationen Området er derefter dækket med fluiduigennemtrængeligt, selvklæbende gardiner. Underlivet er åbnet med en midterlinje laparotomi (~ 2 cm i længden). Hulrummet er udvidet ved at indsætte en holder sutur i brystbenet og drift område spredes vedindsætte en Colibri retraktor tillader uhindret eksperimenter under operationen.
Figur 3: Udsættelse af galdegangen. (A) for udførelse af galdegang ligering, er den ventrale side af leveren løftet, så den kan holde sig til membranen og leverens hilus bliver tydeligt. (B) For bedre at udsætte galdegang, er tarmen kaudalt flyttet med en befugtet vatpind. Galdegangen er markeret med en pil.
Figur 4: ligering af galdegangen. (A) I første omgang er galdegangen adskilt omhyggeligt fra flankerende portal vene og hepatisk arterie ved hjælp af en mikro-savtak pincet. (B) Efterfølgende en sutur placeres rundtgaldegangen og sikret med en kirurgisk knude. (C) Derefter er en anden sutur anbragt i umiddelbar nærhed af den første sutur og knuder omkring galdegang. (D) Suturen afkortes, hulrummet skyllet med 0,9% NaCI-opløsning og alle organer udskiftes for deres fysiologiske placering.
Figur 5:.. Præcis gengivelse af knuder at dokumentere placeringen af suturer og indstillingen af de to knob, der forhindrer galde flow, blev den samme metode i figur 4 dokumenteret under en kikkert (A) indespærring af galdegangen med første sutur. (B) Knotting af den første sutur. (C) indespærring af galdegangen med den anden sutur. (D) Knotting af den anden sutur. (E) Dobbelt-ligeret galde dtet efter afkortning af overskydende suturer. (E ') Dette panel viser en skitse af (E). Positionerne af højre (RL), venstre (LL) og median (ml) lapper af leveren samt galdegang, mave og duodenum er letters. I skitsen galdegangen er dobbelt ligeret med to suturer.
Figur 6:. Anatomi galdegang, portal vene og hepatisk arterie i mus For bedre anatomisk placering af den fælles galdegang, der portal vene og hepatisk arterie afbildet som en ordning. Mærket er også positionerne af højre (RL), venstre (LL) median (ml), og putamen (CL) lapper i leveren.
Figur 7: Repræsentant appearance af lever 2 uger efter fingeret operation og BDL. C57BL / 6-mus blev udsat for sham operation eller BDL kirurgi. Efter to uger visceral hulrum blev åbnet. Mens lever fra sham-opererede dyr viste ingen tegn på fibrose af lever fra dyr, der modtog ligering af galdegangen havde en uregelmæssig overfladestruktur med dannelsen af ødem og fibrotiske noduler på overfladen af tilsvarende lever.
Figur 8:. Hematoxylin og eosinfarve Lever sektioner blev fremstillet ud fra C57BL / 6-vildtypemus dyr, der var skinopereret (A) eller modtaget BDL i tre uger (B). Snittene blev farvet med hematoxylin og eosin efter standardprocedurer. Bemærk de typiske ændringer i BDL leveren, der omfatter tegn på inflammation (infiltrerende celler), parenkymalt (LeverCyte) nekrose, og spredning af galdegangene. Skalaen bar i hver figur panel udgør 50 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 9: histologiske og biokemiske udlæsninger for hepatisk fibrogenese. (A) Lever sektioner blev fremstillet fra dyr, der modtog sham operation eller BDL i 2 uger og farvet med Sirius Red (øverste panel, kollagenfibre i rødt) eller analyseret for ekspression af α-glat muskel-actin (α-SMA) (nedre panel , α-SMA-positive celler i brun) ved immunhistokemi. Skalaen bar i hver figur panel repræsenterer 100 um. (B) Protein uddrag fra lever blev udsat for Western blot og analyseret for EXPREfission af kollagen type I, α-SMA, og Vimentin der er veletablerede markører for nedsat fibrogenese. Ekspressionen af Lipocalin-2 (LCN2) indikerer den inflammatoriske reaktion, der er forbundet med løbende fibrogenese. I denne analyse blev lige protein loading demonstreret ved at probe blottene med et antistof specifikt for β-actin. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 10:. Immunologisk farvning af infiltrerende inflammatoriske celler Serielle leversnit blev fremstillet ud fra en lever af et dyr, der modtog galdegang ligering i 3 uger. Snittene blev farvet med hematoxylin og eosin (A) eller med et antistof, der er specifikt for CD45 (B). Bemærk venligst,det store antal CD45 positive celler, der omgiver galdegangene. Disse massive infiltrater der indikerer betændelse er ikke synlige i leversnit afledt fra sham-opererede dyr (ikke vist). Skalaen bar i hver figur panel repræsenterer 500 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Discussion
Cholestatisk leverskade er en af de vigtigste kausale faktorer for udvikling af leverfibrose og cirrose i patienter med kronisk leversygdom. Baseret på det faktum, at disse sygdomme producere ubestemmelighed omkostninger sundhedspleje, er det forståeligt, at mange forskere forsøger at forstå de patogene mekanismer igangværende leverfibrose. Derfor har eksperimentelle modeller blevet genereret, der efterligner forskellige aspekter af de komplekse mekanismer, der fører til nedsat inflammation, fibrose og cirrose 1.
Kirurgisk BDL er en af de mest udbredte eksperimentelle modeller, der anvendes til at inducere obstruktiv cholestatisk skade i mus og rotter 4,23,24. I de fleste af de protokoller, der er dyr bedøvet, og en midtersektion laparotomi udføres. Efterfølgende galdegangen afdækket fra bughulen og ligeret to gange ved hjælp af kirurgisk sejlgarn. Som følge heraf er de mus og rotter, der fik denne operation develop en stærk fibrøs reaktion som ved første stammer fra periportale felter 25. I årene er blevet beskrevet flere forskellige kirurgiske teknikker og modifikationer. Særlige procedurer tillader endda gentilslutning eller reanastomosis efter BDL 23. Andre teknikker er baseret på delvis BDL resulterer i betydeligt mindre nekrose dannelse og dermed hepatocytproliferation 24. Delvis BDL i kombination med efterfølgende fjernelse af galdeblæren (kolecystektomi), som forhindrer dannelsen af cholecystitis repræsenterer også en fremragende eksperimentel model for akut cholestase. Det blev foreslået at være en model, der er tættere på den menneskelige situation 24. Og ja, i oprettelsen af denne model, blev det allerede vist, at det reproducerbart forårsager kolestase med kun minimal histologisk vævsskade og undersøger ikke til kronisk kolestase 25. Derfor blev det foreslået, at denne model er ideel til at studere late virkninger af omvendt cholestasis 24. Endnu mere sofistikerede metoder er baseret på mikrokirurgi og tillade en hurtig og reproducerbar måde at påføre kolestatisk leverskade kun i udvalgte dele af leveren 26.
Selv om disse sofistikerede ændringer fra den oprindelige BDL-protokollen har vist sig meget nyttige i at undersøge konkrete forskningsspørgsmål, mange laboratorier verden over grundlæggende sigte på at ansætte den BDL-modellen som en meget reproducerbar og pålidelig model for kolestatisk liver fibrose. Dog kan mange komplikationer forekomme, at væsentlig grad kunne ændre reproducerbarhed og pålideligheden af de resultater, som denne model, hvis tekniske unøjagtigheder ikke undgås. For eksempel blødende komplikationer relateret til skade på blodkarrene ledsager galdegangen (se figur 3 - 4) kan forekomme under eller hurtigt efter operationen. Overdosering af anæstesi med efterfølgende kardiodepression eller respiratory fiasko er også undgåelige komplikationer af proceduren. Alvorlige infektioner, lige fra peritonitis til sepsis, kan forekomme i hele perioden af forsøget, hvis suturerne ikke nøjagtigt udført, og galde lækager i bughulen. Tilskadekomster til tarmen under kirurgi kan også føre til bughindebetændelse. Derfor er det indlysende, at standardiserede protokoller, der er i overensstemmelse med strenge retningslinjer håndtering er stærkt påkrævet. Denne bestemmelse blev også for nylig krævet inden for landene i Den Europæiske Union, som implementeret nye regler for dyrevelfærd i 2013 1. De respektive krav, der er forbundet med denne forordning, er ikke nye og allerede blev foreslået i 1959, da Russell og Burch foreslog en etisk ramme for udførelse af videnskabelige forsøg med dyr, der primært er baseret på en erstatning, forbedring og reducering (3R) princip 27.
Når efter outlined protokol er der kun et par komplikationer, der kan opstå som følge af tekniske unøjagtigheder. Tre specifikke spørgsmål kan opstå i temmelig lav frekvens.
Som med alle kirurgiske procedurer, overdosis af bedøvelsesmiddel er en potentiel kilde til fare for dyr, navnlig i kombination med hypotermi. Hvis kardiovaskulære komplikationer under operationen opstår, bør udbuddet af bedøvelsesmidler stoppes omgående, og operatøren skal forsøge at give mest muligt ilt til musen. Dette kan gøres ved hjælp af en lille plastsprøjte, der er fyldt med luft og pumpes ind i mundingen af Hæmmede dyr. Alternativt brug af en lille Peleusball til ventilation af det angrebne dyr er ofte nyttigt for revitalisering proces.
Problemer i sårheling
Efter BDL operation, kan mus bide deres egne ømme sømme eller de andre dyr. Hvis dette sker, bør respektive mus være særskiltbur. Dyr med åbne sår bør bedøvet området omkring såret forsigtigt steriliseret med en standard antiseptisk, og såret skal syes op igen. I løbet af de næste 3 dage, bør såret af disse dyr skal regelmæssigt (to til tre gange om dagen).
Udspilinger i maven eller dannelse af ascites er vejledende for bakterielle infektioner. Disse kan forekomme på grund af ikke-sterile bearbejdning under operationen. Alle slags infektioner skal håndteres uden undtagelse som en human endepunkt og de berørte dyr bør aflives.
Vi gav en let at følge protokollen, der tillader udførelsen af BDL i mus, der er enkel at implementere og fremkalder kun ringe Dyremortalitet kombineret med en høj reproducerbarhed. Alle kirurgiske protokoller kan hurtigt pågrebet af dygtige forskere. Under den fuldstændige eksperimenteren dyrene holdes på en varmeplade ved 37 ° C og permanent forbundettil et anæstesi-system minimerer smerte og lidelse. For kirurgi, er maven åbnes med en midterlinje laparotomi og galdegangen med dobbelt ligeret uden dissekere den. De repræsentative resultater, der blev diskuteret her viser, at de fænotypiske ændringer i forbindelse med leveren morfologi (inflammation, fibrose, cirrose) er meget reproducerbar og tillade at studere forskellige aspekter af fibrogenese (f.eks., Indledning, inflammation, progression, slutstadiet sygdom) ved definerede tidspunkter.
Vi håber, at resuméet af vores protokol vil bidrage til at forkorte indlæringskurve, der er nødvendig for at kunne etablere denne fibrose model i andre laboratorier og garantere pålidelige og reproducerbare resultater på forskellige lokaliteter. Derved mener vi, at det fremlagte protokol understøtter 3R princip, der skulle af Russell og Burch i 1959 og udgør grundlaget for nye dyrevelfærdsregler, der i øjeblikket gennemføres i mange lande witynd den europæiske referenceramme.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende den økonomiske støtte for den tyske Research Foundation (SFB / TRR57, Q3 og Q2). Forfatterne takker Mareike Schulz, Pascal Paschenda og Klaudia Warzecha for deres hjælp ved udarbejdelsen af fotografier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Shaver Favorita II | Aeskulap | GT104 | |
| Cutter head | Aeskulap | GT730 | |
| Bepanthen eye and nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Warming plate and controller | Labotect | HP 062 | |
| Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Scotch Tape | commercially available | ||
| Tissue paper | commercially available | ||
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Raucodrape OR adhesive drapes | Lohmann & Rauscher GmbH | 33013 | |
| Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Graefe forceps straight | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| 6-0 Mersilk suture | Ethicon | K889H | Silk, non-absorbable/Abdominal closure |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Colibri retractor | Fine Science Tools Inc. | 17000-03 | |
| Cotton swabs | Noba Verbandmittel | 974202 | |
| Cotton swabs | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1032238 | |
| 25mL beaker | Schott Duran | 50-1150 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Micro-serrations forceps Moria MC31 | Fine Science Tools Inc. | 11370-31 | Bile duct separation |
| 5-0 Mersilene suture | Ethicon | EH6731H | Polyester, non-absorbable/Bile duct ligation |
| 5mL syringe | BD Discardit II | 300296 | |
| 1mL syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Sterican needle 26 G x 1 | B. Braun | 4657683 | |
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
| Infrared lamp | Petra Electric | IR 11 |
References
- Liedtke, C., et al. Experimental liver fibrosis research: update on animal models, legal issues and translational aspects. Fibrogenesis Tissue Repair. 6 (1), 19 (2013).
- Aller, M. A., Arias, J. L., García-Domínguez, J., Arias, J. I., Durán, M., Arias, J. Experimental obstructive cholestasis: the wound-like inflammatory liver response. Fibrogenesis Tissue Repair. 1 (1), 6 (2008).
- Tacke, F., Weiskirchen, R. Update on hepatic stellate cells: pathogenic role in liver fibrosis and novel isolation techniques. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 6 (1), 67-80 (2012).
- Weiler-Normann, C., Herkel, J., Lohse, A. W. Mouse models of liver fibrosis. Z. Gastroenterol. 45 (1), 43-50 (2007).
- Cameron, G. R., Oakley, C. L. Ligation of the common bile duct. J. Pathol. 35 (5), 769-798 (1932).
- Cameron, G. R., Hasan, S. M. Disturbances of structure and function in the liver as the result of biliary obstruction. J. Pathol. 75 (2), 333-349 (1958).
- Accatino, L., Contreras, A., Fernańdez, S., Quintana, C. The effect of complete biliary obstruction on bile flow and bile acid excretion: postcholestatic choleresis in the rat. J Lab Clin Med. 93 (5), 706-717 (1979).
- Accatino, L., Contreras, A., Berdichevsky, E., Quintana, C. The effect of complete biliary obstruction on bile secretion. Studies on the mechanisms of postcholestatic choleresis in the rat. J Lab Clin Med. 97 (4), 525-534 (1981).
- Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
- Tuchweber, B., Desmoulière, A., Bochaton-Piallat, M. L., Rubbia-Brandt, L., Gabbiani, G. Proliferation and phenotypic modulation of portal fibroblasts in the early stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 74 (1), 265-278 (1996).
- Desmoulière, A., et al. Extracellular matrix deposition, lysyl oxidase expression, and myofibroblastic differentiation during the initial stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 76 (6), 765-778 (1997).
- Arias, M., et al. Adenoviral expression of a transforming growth factor-β1 antisense mRNA is effective in preventing liver fibrosis in bile-duct ligated rats. BMC Gastroenterol. 3 (29), (2003).
- Borkham-Kamphorst, E., et al. Dominant-negative soluble PDGF-β receptor inhibits hepatic stellate cell activation and attenuates liver fibrosis. Lab. Invest. 84 (6), 766-777 (2004).
- Borkham-Kamphorst, E., Huss, S., Van de Leur, E., Haas, U., Weiskirchen, R. Adenoviral CCN3/NOV gene transfer fails to mitigate liver fibrosis in an experimental bile duct ligation model because of hepatocyte apoptosis. Liver Int. 32 (9), 1342-1353 (2012).
- Borkham-Kamphorst, E., et al. The anti-fibrotic effects of CCN1/CYR61 in primary portal myofibroblasts are mediated through induction of reactive oxygen species resulting in cellular senescence, apoptosis and attenuated TGF-β signaling. Biochim. Biophys. Acta. 1843 (5), 902-914 (2014).
- Huss, S., et al. Development and evaluation of an open source Delphi-based software for morphometric quantification of liver fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 3 (1), 10 (2010).
- Borkham-Kamphorst, E., Drews, F., Weiskirchen, R. Induction of lipocalin-2 expression in acute and chronic experimental liver injury moderated by pro-inflammatory cytokines interleukin-1β through nuclear factor-κB activation. Liver Int. 31 (5), 656-665 (2011).
- Karlmark, K. R., et al. The fractalkine receptor CX3CR1 protects against liver fibrosis by controlling differentiation and survival of infiltrating hepatic monocytes. Hepatology. 52 (5), 1769-1782 (2010).
- Tarcin, O., et al. Time course of collagen peak in bile duct-ligated rats. BMC Gastroenterol. 11, 45 (2011).
- Takase, S., Leo, M. A., Nouchi, T., Lieber, C. S. Desmin distinguishes cultured fat-storing cells from myofibroblasts, smooth muscle cells and fibroblasts in the rat. J. Hepatol. 6 (3), 267-276 (1988).
- Borkham-Kamphorst, E., et al. Protective effects of lipocalin-2 (LCN2) in acute liver injury suggest a novel function in liver homeostasis. Biochim. Biophys. Acta. 1832 (5), 660-673 (2013).
- Labbus, K., et al. Proteomic profiling in Lipocalin 2 deficient mice under normal and inflammatory conditions. J Proteomics. 78, 188-196 (2013).
- Kirkland, J. G., et al. Reversible surgical model of biliary inflammation and obstructive jaundice in mice. J. Surg. Res. 164 (2), 221-227 (2010).
- Heinrich, S., et al. Partial bile duct ligation in mice: a novel model of acute cholestasis. Surgery. 149 (3), 445-451 (2011).
- Scholten, D., et al. Genetic labeling does not detect epithelial-to-mesenchymal transition of cholangiocytes in liver fibrosis in mice. Gastroenterology. 139 (3), 987-998 (2010).
- Aller, M. A., et al. A half century (1961-2011) of applying microsurgery to experimental liver research. World J Hepatol. 4 (7), 199-208 (2012).
- Russell, W. M. S., Burch, R. The Principles of Humane Experimental Technique. , London, Methuen. (1959).
