Abstract
Endosomale forsuring er kritisk for en lang række processer, såsom protein genanvendelse og nedbrydning, receptor desensibilisering og neurotransmitter lastning i synaptiske vesikler. Denne forsuring er beskrevet at være medieret ved proton ATPaser koblet til CLC klorid transportører. Meget-konserverede elektroneutrale protoner transportvirksomheder, er Na + / H + vekslere (NHE) 6, 7 og 9 også til udtryk i disse rum. Mutationer i deres gener er blevet forbundet med humane kognitive og neurodegenerative sygdomme. Paradoksalt nok deres roller forblive undvigende, da deres intracellulære lokalisering har forhindret detaljeret funktionel karakterisering. Dette håndskrift viser en metode til at løse dette problem. Denne består af udvælgelse af mutante cellelinier, der er i stand til at overleve akut cytosoliske forsuring ved at bevare intracellulære NHE'er på plasmamembranen. Derefter viser to komplementære protokoller til at måle ion selektivitet og aktivitetdisse vekslere: (i) en baseret på intracellulære pH-målinger under anvendelse af fluorescens video mikroskopi, og (ii) den ene baseret på hurtige kinetik af lithium-optagelse. Sådanne protokoller kan ekstrapoleres til at måle andre ikke-elektrogen transportører. Desuden udvælgelsesproceduren præsenteres her genererer celler med en intracellulær tilbageholdelse defekt fænotype. Derfor er disse celler også udtrykker andre vesikulære membranproteiner på plasmamembranen. Den eksperimentelle strategi afbildet her, kan derfor udgøre et potentielt stærkt værktøj til at studere andre intracellulære proteiner, der vil blive derefter udtrykt på plasmamembranen sammen med vesikulær Na + / H + vekslere anvendes til valg.
Introduction
De fleste intracellulære rum viser en sur luminale pH, som er en vigtig parameter for modning, menneskehandel, genanvendelse af proteiner eller hormoner og neurotransmittere loading. Det er blevet vist, at pH-gradienten mellem cytosol og vesikulær indhold genereres af vakuolær H + ATPaser 1 koblet til vesikulære CLC klorid transportører 2. Både i knock-out (KO) mus og humane patienter, er betydningen af disse transportører blevet fremhævet af de tunge fænotyper forårsaget af mutationer i deres gener 3-6.
Medlemmerne af natrium-hydrogen vekslere SLC9A familie, også kaldet NHE'er for Na + / H + vekslere, har vist sig at være vigtige effektorer i intracellulær pH og regulering cellevolumen samt i vectorial transport af syre-base ækvivalenter tværs epitel . Udover plasma membran NHE'er, tre højkonserveret Na + / H + vekslere, NHE 6, 7og 9 er udtrykt i trans-Golgi netværket, og i begyndelsen af endosomer 7. Mutationer i deres gener har været forbundet med Angelman-lignende eller Christianson syndromer 8-9, familiebaseret autisme 10 og Attention Deficit Hyperactivity Disorder 11-12. Disse vekslere har også været involveret i neurodegenerative problemer såsom Alzheimers sygdom modtagelighed 13 og kønsbunden mental retardering tilstødende gener syndromer 14. Tilsammen fremhæve disse undersøgelser betydningen af disse intracellulære NHE'er i hjernens udvikling og / eller funktion.
Den intracellulære lokalisering af disse vekslere forhindrer nøjagtige målinger af deres ion selektivitet, retning transport, kinetiske parametre og regulering. Som det er tilfældet for alle transportvirksomheder udtrykt i intracellulære rum, er det yderst vanskeligt at vurdere deres biokemiske aktiviteter og dermed til fuldt ud at forstå deres fysiologiske roller og den mechanismer underliggende deres patologiske konsekvenser. Baseret på den høje cytosoliske K + koncentration, mest almindeligt accepteret hypotese var, at de arbejder som K + koblede proton effluxtransportører. Eksistensen af en sådan proton lækage var blevet antaget, da det kan opveje proton pumpning af de V-ATPaser for at opretholde en steady state vesikulær pH. Formålet med denne visuelle artikel er (i) at påvise en fremgangsmåde, som tillader genetisk udvælgelse af cellelinier, som udtrykker sådanne vesikulære transportere på deres plasmamembran, og (ii) for at vise to uafhængige fremgangsmåder til at måle funktioner af disse transportører.
Tre årtier siden, Pouysségur og Franchi har været banebrydende for en genetisk tilgang, gjorde det muligt for molekylær kloning og karakterisering af medlemmerne af NHE familien 15. Dette var baseret på toksiciteten af intracellulære protoner som en screeningsmetode. Det første skridt var at få cellelinier mangelfuldei en Na + / H + udveksling udtrykt på plasmamembranen ved hjælp af reversibiliteten af denne transportør. Fibroblaster (CCL39 cellelinie) blev indlæst med Na + eller Li + og derefter placeret i et surt ekstracellulære medium (pH 6,5) i 2 timer. Dette førte til døden af celler, der udtrykker en funktionel Na + / H + udveksling og til udvælgelse af antiporter-deficiente celler (PS120 cellelinie) 16. Når dyrket i bicarbonat-medium, disse celler er meget følsomme over for akut intracellulær forsuring. Følgelig vil ekspression af enhver funktionel proton udstrømningsmekanisme på plasmamembranen positivt valgt (se 17), hvis sådanne celler indgives akutte intracellulære acidifications. Sådanne forsuring teknikker kan anvendes til isolering af cellelinier med trafficking fejl muliggør tvungen ekspression af WT intracellulære NHE'er på plasmamembranen.
Som eukaryot Na + / H+ Vekslere er elektroneutrale, er de ikke måles ved de elektrofysiologiske metoder der har været anvendt med stor succes til at måle kanaler. Dette håndskrift viser derfor, hvordan man måler aktiviteten af dette veksler med intracellulære pH-målinger og hurtige kinetik af lithium optagelse. Da de underliggende begreber er den samme, er det interessant at bemærke, at mange af de processer, der er udviklet for udvælgelsen afsnittet også anvendes direkte til funktionelle målinger.
Interessant nok har vi observeret, at defekt trafficking stede i cellelinier udvalgt ved hjælp af metoden beskrevet i dette manuskript fører til en større ekspression af andre vesikulære proteiner ved plasmamembranen såsom vesikulære kaliumkanal TWIK1 18. Dette peger ud mod valget af en generel tilbageholdelse defekt mekanisme for vesikulær transmembrane proteiner. Derfor denne udvælgelsesprocedure, og de celler, den skaber majudgør et lovende redskab for det videnskabelige samfund arbejder på membranproteiner fra intracellulære rum. Samt de målemetoder, der præsenteres her kunne finde anvendelse for at studere andre ikke-elektrogen transportører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. H + Killing Selection
- Cellelinier
- Stabilt transficere NHE-deficiente celler (fx den CCL39-afledte PS120 cellelinje 16) ved hjælp af en kombination af mammal ekspressionsvektor og transfektion metode, der vil frembringe effektive transfektion udbytter og selektion i en fibroblast cellelinie.
BEMÆRK: I mange år calciumphosphatpræcipitation 19 blev anvendt med gode transfektion udbytter. Det har for nylig blevet erstattet af kommercielle reagenser, såsom lipofectamin 2000, idet transfektioner udført ved at følge producentens instruktioner.
- Stabilt transficere NHE-deficiente celler (fx den CCL39-afledte PS120 cellelinje 16) ved hjælp af en kombination af mammal ekspressionsvektor og transfektion metode, der vil frembringe effektive transfektion udbytter og selektion i en fibroblast cellelinie.
- Løsninger
- Forbered tre sterile opløsninger, der er beskrevet nedenfor. Steriliseres disse løsninger ved filtrering (0,22 um).
- Forbered en NH4 + Loading opløsning (pH 7,4) bestående af 50 mM NH4CI, 70 mM cholinchlorid, 5 mM KCI, 1 mM MgCI2, 2 mM CaCl2, 5 mM glucose og 15 mM MOPS ved pH 7,4.
- Forbered en skylleopløsning (pH 7,0) bestående af 120 mM cholinchlorid, 5 mM KCI, 1 mM MgCI2, 2 mM CaCl2, 5 mM glucose og 15 mM HEPES ved pH 7,0.
- Forbered en Recovery opløsning (pH 7,4) bestående af 120 mM NaCl, 5 mM KCI, 1 mM MgCI2, 2 mM CaCl2, 5 mM glucose og 15 mM HEPES ved pH 7,4.
- Forbered tre sterile opløsninger, der er beskrevet nedenfor. Steriliseres disse løsninger ved filtrering (0,22 um).
- Før start af udvælgelse, opnå en cellekultur inkubator, der kan anvendes ved 37 ° C uden yderligere CO 2 fra eksterne tank (betegnet CO 2 - "fri" incubator), som 5% CO 2 vil resultere i bufferkapacitet, der kan forringe forsuring. Forstærk cellelinie, der udtrykker NHE af interesse op til ca. 2 x 10 8 celler (typisk ca. 20 sammenflydende 100 mm plader).
- H + dræbe procedure:
- Inkuberes cellerne, der udtrykker den intracellulære NHE af interesse i 1 time i Loading Solution, ved 37 ° C i CO 2 -fri inkubator.
- Aspirer lastning skylles dem to gange i den ovenfor beskrevne-skyl løsning. Udfør dette trin effektivt til at fjerne den resterende ekstracellulære NH4Cl, som ville forringe oprettelsen af en stejl NH4 + gradient, der vil generere forsuring.
- Fjerne skylning medium ved aspiration og inkuber cellerne i en time i recovery løsning igen ved 37 ° C i CO 2 fri inkubator.
- Erstat recovery medium med regulært dyrkningsmedium (typisk DMEM med 7,5% FCS) og dyrke cellerne i standard dyrkningsbetingelser (37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2 og 95% luft).
- Gentag denne cyklus af udvælgelse to gange om ugen, indtil stabile kloner opstå.
BEMÆRK: Vær ekstra forsigtig med hensyn til cellekultur og udvælgelse forhold. Måneders arbejde kan blive ødelagt af forurening, der er mere tilbøjelige til at occur efter en lang periode med kultur og gentagne celle manipulationer.- Her vælger du, om at forstærke klonerne og karakterisere dem individuelt som yderligere beskrevet i afsnit 2-3, eller samle dem sammen til at generere et cellulært population før karakterisering.
- Påfør lejlighedsvis udvalg (ca. en gang hver anden uge) for at bevare de forsuring-resistente celler ved counter-udvælge dem, der kan have vendt tilbage til den parentale syre-følsomme fænotype (figur 1B).
2. Intracellulær pH-målinger
2.1) Fluorescens pH Imaging
- Brug ratiometrisk pH-sensitive fluorescerende farvestof BCECF / AM, som er pH-følsom når den exciteres ved 490 nm og besidder en 445 nm isosbestiske punkt efter producentens protokoller.
- Alternativt anvende andre pH-følsomme prober ifølge producentens protokoller.
- Brug en billeddannelse sæt conbestående af et omvendt mikroskop koblet til en høj følsomhed videokamera. Udstyre dette sæt med 450 nm og 490 nm smalbåndede interferensfiltre parret med passende kvarts neutral tæthed filtre til excitation.
- Hvis det er muligt, skal du bruge passende sæt af filtre og belysning betingelser setup sammenlignelige fluorescensværdierne for λ1 og λ2, således at forholdet nærmer 1. Også undgå basale fluorescens værdier, der er angivet enten mætte eller for lav, både for λ1 og / eller λ2. Dette kan give vigtige artefakter som dengang forholdet må ikke været påviselig selvom intracellulær pH er under forandring.
BEMÆRK: Dette system skal gøre det muligt hurtigt perfusion, tidsforskudt excitation ved de to ovennævnte bølgelængder og erhvervelse ved den korrekte emission bølgelængde (535 nm for BCECF). Udstyr systemet med software muliggør erhvervelse og opbevaring automatisk data.
- Hvis det er muligt, skal du bruge passende sæt af filtre og belysning betingelser setup sammenlignelige fluorescensværdierne for λ1 og λ2, således at forholdet nærmer 1. Også undgå basale fluorescens værdier, der er angivet enten mætte eller for lav, både for λ1 og / eller λ2. Dette kan give vigtige artefakter som dengang forholdet må ikke været påviselig selvom intracellulær pH er under forandring.
2.2) Måling af NHE Forward Activity (Ekstrudering afProtoner fra cytosolen)
- Forsure celler ved en 1 times inkubation i NH4 + Loading opløsning (se trin 1.4) i fravær af CO 2.
- Tilføj BCECF-AM (5 uM slutkoncentration) til løsning for de sidste fem minutter og derefter skylle det med NH4 + lastning løsning til at fjerne den ekstracellulære probe.
- Monter cellerne på mikroskopet og tage flere billeder for at optage en stabil basislinje. Perfundere skylleopløsningen (se ovenfor). Dette resulterer i et fald af fluorescens svarende til forsuring.
- Efter pH stabilisering, perfundere nogen af de løsninger nedenfor for at måle pH-genvindingskvoter medieret af Li + / H +, Na + / H + eller K + / H + udveksling. Hver opløsning indeholder en potentiel kobling kation skal testes for H + exchange. Hvis en af dem transporteres, vil dette resultere i en fluorescens stigning på 495 nm, som vil CORRESPOND til et raise i intracellulær pH:
120 mM LiCI, 5 mM KCI, 1 mM MgCI2, 2 mM CaCl2, 5 mM glucose og 15 mM HEPES ved pH 7,4
120 mM NaCl, 5 mM KCI, 1 mM MgCI2, 2 mM CaCl2, 5 mM glucose og 15 mM HEPES ved pH 7,4
125 mM KCI, 1 mM MgCI2, 2 mM CaCl2, 5 mM glucose og 15 mM HEPES ved pH 7,4
2.3) Måling af NHE Reverse aktivitet
BEMÆRK: Princippet er at invertere transmembrane ioniske gradienter.
- Forud for målingen, indlæse celler med intracellulære kation af interesse (se nedenfor).
- Der inkuberes dem i 5 min med BCECF / AM (se trin 2.2.2); skyl dem, montere dem på video mikroskop.
- Perfundere fyldningsopløsningen og tage flere billeder for at optage en stabil basislinje.
- Efter baseline stabilisering Image pH-variationer, når celler perfunderet med en ekstracellulær surt medium indeholdende 120 mM cholinchlorid, 5 mM KCI, 1 mM MgCI2, 2 mM CaCl2, 5 mM glucose og 15 mM MES ved pH 6,5.
- For LiCI loading, inkuberes cellerne i 2 timer i en opløsning bestående af 120 mM LiCI, 5 mM KCI, 1 mM MgCI2, 2 mM CaCl2, 5 mM glucose og 15 mM HEPES ved pH 7,4. Intracellulær lithium målt ved atomabsorptionsspektroskopi giver en værdi på ca. 60 mM.
- For Na + loading, inkuberes celler i to timer i en opløsning bestående af 120 mM NaCl, 5 mM KCI, 1 mM MgCI2, 2 mM CaCl2, 5 mM glucose og 15 mM HEPES ved pH 7,4 i nærvær af 1 mM ouabain at blokere Na / K ATPase. Under disse betingelser intracellulær Na + koncentration er i området på 40 mm.
BEMÆRK: K + loading er ikke nødvendig, da cytosoliske K + koncentrationen er i området fra 140 mM og en udadrettet K + gradient er derfor let at opnå.
2.4) databehandling og kalibrering:
BEMÆRK: Dette trin gælder både frem- og tilbage målinger.
- Ved afslutningen af hvert eksperiment perfundere celler med en opløsning af 140 mM KCI, 20 mM HEPES og 5 uM nigericin justeret til pH-værdier mellem 6,5 og 7,4.
- Indsamle data som fluorescens målinger fra billederne (gråtoner repræsenterer intensitet niveauer) og eksport under tekstformat og behandle som forklaret nedenfor ved hjælp af et regneark.
- Beregn intracellulære pH-værdier for hver enkelt celle eller område af interesse ved hjælp af følgende ligning:
pH = pKa + (Log (R-Rmin) / (R max -R)) x F min (λ2) / F max (λ2) - Brug F min (λ2) / F ma x (λ2) forhold, hvis der er probe blegning eller lækage, hvilket resulterer i et fald i 450 nm fluorescens gennem eksperimenter. Dette er imidlertid meget sjældent observeret i de anvendte betingelser i described eksperimenter.
- Som kalibreringsdata er til stede ved slutningen af hver pH-måling, kontrollere, om de tilsvarende beregnede værdier afviger fra pH-værdier, der anvendes til kalibrering. Hvis det er tilfældet, så justere alle eksperimentelt bestemt pH-værdier til kalibreringen ved hjælp af følgende fremgangsmåde:
- Beregn følgende kvotient (Q, forskellen mellem de målte værdier / Forskel mellem kalibreringsværdierne). Gang hele datasæt ved Q. foretage den endelige justering ved addition eller subtraktion, så de beregnede værdier vil være lig med de tilsvarende kalibreringsværdier.
3. Målinger af indledende Satser for NHE7 af Fast Li + Optagelse
- Seed celler på multi-brønds plader (6 til 24 brønde) og gøres sur dem ved hjælp af enten NH4 + loading ovenfor beskrevne teknik eller alternativt den nigericin / bovint serumalbumin (BSA) forsuring beskrevet i 20.
- Bevar korte og konsekvente uptake varigheder (typisk et minut eller under) for at sikre, at transporten fungerer i indledende satser betingelser. Sørg også for, at alle de løsninger, der anvendes til optagelse er isotonisk.
- Ved afslutningen af optagelse tid, omhyggeligt fjerne optagelse medium og vask cellerne fire gange med iskold phosphatpufret saltvand (PBS). Udfør disse vaske så hurtigt som muligt (mindre end 10 sek for fire af dem er ideel) for at forhindre lithium udstrømning.
- Lysere cellerne i 25% salpetersyre. Påfør 250 pi per brønd af 25% salpetersyre og lad det sidde i mindst 1 time, derefter skrot hver brønd med enden af pipettespidsen og overføre hele godt suspension i en ny microcentrifuge rør.
- Overfør lysatet i 1,5 ml mikrocentrifugerør, centrifugeres dem i 5 minutter ved 15.000 xg (stuetemperatur) for at fjerne cellerester.
- Mål indhold lithium i supernatanterne ved atomabsorptionsspektroskopi 21.
BEMÆRK: Forskellige virksomheder giver atomabsorptions spektrometre, som skal være udstyret med et lithium hulkatodelampe. Følg producentens anvisninger, da disse maskiner er meget præcis, men også ganske delikat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Udvalg:
H + dræbe Udvælgelsen er baseret på diffusion af ammonium svag base, som vist i figur 1A. Effekten af svage baser og syrer diffusion på intracellulær pH-værdien er udviklet af Walter bor og samarbejdspartnere 22. Den elegante idé at bruge dette fænomen til at fremstille en dødelig forsuring for positiv genetisk udvælgelse blev derefter udviklet af Jacques Pouysségur 17. Under en sådan protokol, det intracellulære pH falder til ca. 5,5 efter skylning trin. Celler, som ikke udtrykker en funktionel NHE på plasmamembranen kan ikke gendanne en neutral pH-værdi og viser en typisk forsuret aspekt med en flad form og en granulær cytosol (figur 1B). Efter gentagne udvælgelse cyklusser (ca. to H + dræbe procedurer / uge), celler, der fuldt ud og stabilt overleve denne forsuring (figur 1C) opstår ved en frekvens på omkring 10 -7.Dette vil resultere i dannelsen af individuelle cellulære kloner, som enten kan karakteriseres individuelt eller samles for at opnå cellepopulationer, hvis det ønskes. Kan udføres Standard eksperimenter såsom celleoverflade biotinylering eller RNA silencing at kontrollere, at proteinet udtrykt på plasmamembranen er faktisk en intracellulær NHE såsom NHE7 (se for eksempel Milosavljevic et al. 18). Samt bør RT-PCR og efterfølgende sekventering udføres for at kontrollere for eventuelle mutationer i sekvensen af de intracellulære NHE'er udtrykt i den valgte cellelinje.
Funktionel karakterisering:
Fluorescens Videomicroscopy:
Aktiviteten og ion selektivitet af de intracellulære NHE'er udtrykt på plasmamembranen kan karakteriseres ved at måle ændringer i intracellulær pH induceret af disse NHE'er i forskellige forhold. Til dette en videomicroscopy sæt udstyret med belysning enIndstillinger d erhvervelse til billedet et ratiometrisk sonde som BCECF / AM er skematiseret i figur 2A. figur 2B og 2C viser de typiske variationer i fluorescens værdier direkte opnået for excitationer ved 490 og 450 nm, efter en NH4 + lastning forsuring. figur 2D viser pH-kurven fra disse fluorescensværdierne følgende data, der er beskrevet i 2.4 behandling).
Lithium Optagelse:
Sammen med hydrogen og natrium, lithium omfatter en del af den første kolonne i den periodiske tabel, og er blevet vist at være en effektiv kobling kation for Na + / H + varmevekslere. Det er muligt at drage fordel af disse oplysninger til opsætning hurtige kinetik af lithium optagelse, for at måle i detaljer de funktionelle parametre for Na + / H + vekslere. Da denne kation er fraværende fra celle cytoplasma, ophobning af cytosolic forsuring kvantitativt afspejler aktiviteten af plasmamembranen NHE. Desuden kan måles nanomolær til picomolære koncentrationer af lithium med stor nøjagtighed ved hjælp af atomabsorptionsspektrometri. Således er denne fremgangsmåde er meget kraftfuld, når det kombineres med valg af plasma membran udtrykt vesikulær vekslere. Figur 3 illustrerer målingen protokollen beskrevet i 3) i protokollerne sektion. Celler, fortrinsvis podet på flere brønde (6 til 24) er syrnet som tidligere beskrevet. Den kinetiske starter med inkubation af cellerne i medium indeholdende lithium, og de andre kationer eller inhibitorer af interesse (figur 3A).
For at stoppe optagelsen, bliver cellerne derefter forelægges fire hurtige skylninger i iskoldt PBS. Betjening hurtigt fjerner ekstracellulære lithium samtidig sikre, at nogen væsentlig lithium udstrømning forekommer (figur 3B). Lithium-koncentrationen i hver brønd er dereftermålt under anvendelse af atomabsorptionsspektroskopi (figur 3C), og indledende satser Lithium optagelse, som direkte opnåelse af aktiviteten af veksleren ved steady state opnås som hældning målinger af lithium ophobning tidsforløbet (figur 3D).
Som for enzymkinetik, kan dosis-respons af indledende satser anvendes til at aflede Km-værdier for substrater (figur 4A) af Ki-værdier for inhibitorer. Et interessant træk af transportvirksomheder er, at forskellige koblingsdele kationer vil konkurrere om transport. Dette giver mulighed for måling af Km for natrium ved konkurrence med lithium optagelse (figur 4B).
Figur 1: Valg af celler, der udtrykker en intracellulær Na + / H + </ Strong> veksler på deres plasmamembran. (A) Strategi for de tre trin H + dræbe udvælgelse af celler, der udtrykker et funktionelt ikke-muterede og ikke-mærkede intracellulære NHE på plasmamembranen. (B) fasekontrastmikroskopi billede af PS120 parentale celler forelagt en syre belastning. Scale bar: 25 pm (C) fasekontrastmikroskopi billede af PS120 celler valgt til ekspression af en vesikulær veksler på plasmamembranen, efter en syre belastning. Scale bar: 25 pm Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2: Intracellulære pH-målinger (A) Princippet om pH videomicroscopy måling.. (B) Evolution af den udsendte fluorescens (595 nm) af BCECF pH-sonde efter en excitation ved 490 nm. L: syre belastning, Ri; Skyl, Re: genopretning, Cal6.5: kalibrering ved en intracellulær pH på 6,5, Cal7.0: Kalibrering ved en intracellulær pH på 7,0 (c) Udviklingen i den udsendte fluorescens (595 nm) i BCECF pH-sonde efter en excitation ved 450 nm. L: syre belastning, Ri; Skyl, Re: genopretning, Cal6.5: kalibrering ved en intracellulær pH på 6,5, Cal7.0: Kalibrering ved en intracellulær pH på 7,0 (D) Udviklingen i den intracellulære pH beregnet ud fra de 490/450 nm fluorescens forhold mellem den BCECF pH sonde og fra kalibreringspunkter. L: syre belastning, Ri; Skyl, Re: genopretning, Cal6.5: kalibrering ved en intracellulær pH på 6,5, Cal7.0: Kalibrering ved en intracellulær pH på 7,0 Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3:. NHE-aktivitet målt ved indledende satser Li + optagelse (A - C) Scheme skildrer de forskellige kritiske trin i måleteknik (D) Eksempel på en målt tidsforløb for lithium optagelse for vesikulær NHE7 veksleren udtryk på plasma membran. Bemærk linearitet kinetiske inden for de eksperimentelle betingelser, der sikrer indledende satser måling. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4: Typisk Dosis-respons kurver for NHE7 (oprindelige data fra 18).Indledende satser Lithium optagelse blev målt ved anvendelse af 1-minuts kinetik. (A) dosisresponskurve for ekstracellulær lithium. (B) Konkurrence af forskellige koncentrationer af ekstracellulært natrium på 1 mM ekstracellulært lithium optagelse. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver, hvordan man vælge celler, der udtrykker intracellulært Na + / H + varmevekslere på plasmamembranen uden at ændre deres primære sekvens ved stedrettet mutagenese. Disse vekslere kan nu karakteriseres.
Denne metode er baseret på den cellulære toksicitet af intracellulære protoner at vælge cellelinier, vil udtrykke vesikulær Na + / H + varmevekslere på plasmamembranen. Det er måske muligt i princippet at bruge andre kationer, der kan mistænkes for at være transporteret, såsom Li +, K +, eller Cs +. Men dette tilføjer et ekstra niveau af usikkerhed. Hvis udvælgelsen ikke giver nogen positiv klon, vil det så være vanskeligt at vurdere, om det testede kation ikke transporteres eller veksleren er slet ikke plasmamembranen. Af disse grunde har markeringer blevet udført under anvendelse af Na + som en kobling kation, da dette er det ekstracellulære substrspiste fundet i højeste overflod i fysiologiske betingelser. Dette førte til udvælgelsen af varianter, der udtrykker NHE7 18, samt NHE6 og NHE9 på plasmamembranen (digter og Counillon, upublicerede resultater).
Denne plasmamembranen udtryk muliggør måling af transportørerne funktionelle parametre ved metoder, som kan indtil videre kun anvendes til plasma membrantransportører. Selvfølgelig er det ikke muligt at udelukke, at en sådan ændring i membran miljø kan påvirke de funktionelle træk ved de vesikulære NHE'er. Dog kan denne strategi være værd at bruge mindst tre grunde: (i) den intracellulære ekspression af NHE6, 7 og 9 er til hinder for enhver detaljeret funktionel måling, (ii) membran miljøer og protein eller lipid partnere har oftest vist sig at påvirke subtile regulerende mekanismer i andre NHE'er og ikke deres meget grundlæggende funktioner i disse transportører (tilhørsforhold til kobling kationer, selektivitet, retningsbestemthed, pharmacological funktioner). Så det er meget sandsynligt, at de vil forblive uændret af membranen udtryk for vesikulære NHE'er. (Iii) Kendskab til de funktionelle mekanismer og farmakologiske profiler af en plasmamembran udtrykt vesikulær mekanisme, er det så muligt at gøre vesikulær pH-målinger for at løse disse mulige uoverensstemmelser mellem plasmamembranen og vesikulær udtryk.
En anden potentiel begrænsning ved denne teknik er, at strategien beskrevet her kan føre til udvælgelsen af celler, der udtrykker andre H + ekstrudering mekanisme end den transficerede vesikulær Na + / H + varmeveksler (såsom en plasmamembranen NHE eller en H + ATPase for eksempel ). Selv om det aldrig blev observeret i laboratoriet, er det derfor afgørende at anvende klassisk celleoverfladen mærkning koblet til tavshed til rent faktisk at kontrollere, at NHE af interesse faktisk udtrykkes ved plasmamembranen og medierer Na + eller Li + et al. 18).
For at karakterisere aktiviteten af disse transportører, to protokoller, henholdsvis baseret på intracellulære pH-variationer og ionstrømme beskrevet. Den første metode kræver anvendelse af pH-følsomme fluorescerende prober og en tilstrækkelig fluorescens video mikroskopi system. Denne metode, som bruges af mange grupper på området, er blevet udviklet i 1980'erne, først med fluorimeters at måle signaler danner celler i suspension 23, så ved hjælp af digital erhvervelse til at måle individuelle celler ved at koble fluorescens excitation og erhvervelse at videomicroscopy 24. Sidstnævnte teknik er nu blevet meget hurtigt og nemt, på grund af den høje ydeevne belysning kameraer og computersystemer. Interessant, virksomheder giver normalt meget informative tekniske ark sammen med deres fluorescerende prober. Disse pH-variationer giver vigtige oplysningerat bestemme arten af de ekstracellulære kationer kombineret med proton efflux. I denne henseende er det vigtigt at bemærke, at varigheden af ammonium præinkubation skal omhyggeligt justeres afhængigt af de celler, der anvendes til målingerne. CCL39-afledte fibroblaster, støtter meget godt en times læsning med 50 mM NH4Cl. Dette resulterer i en meget stærk syre, som muliggør NHE fuld aktivering og frembringer et stærkt signal for målinger (Vmax forhold). Dog vil andre celler som cardiomyocytter eller primære renale celler ikke støtte sådan en vigtig ammonium belastning. Det er værd at udføre flere indledende forsøg med forskellige inkubation eller NH4Cl koncentrationer gange. Årsagen til disse forskelle i følsomhed til NH4Cl er ikke klare. De kan være relateret til den mulige ekspression af ammonium transportsystemer 25,26. Tilsvarende natrium-fri opløsning, der anvendes til skylning lastning opløsning, kan ikke tolereresaf celler, såsom kardiomyocytter f.eks. Selv indledende hastigheder vil blive mindre præcist fastlagt, er det nødvendigt at perfundere direkte med inddrivelse opløsning efter ammonium læsning.
Desuden intracellulære pH-målinger giver også en enkel måde at undersøge de reversible egenskaber af disse vekslere som omvendt tilstand vil producere en forsuring, der vil være let detekteres ved et fald i BCECF fluorescens niveau, der kan udtrykkes som en pH-værdier efter kalibrering . Begrænsningerne i disse eksperimenter er manglen på en præcis kvantificering af transportaktiviteter, da forsøgene måle pH-variationer, der opererer på en logaritmisk skala, og er begrænset af intracellulær bufferkapacitet. Kan måles Sidstnævnte og pH-variationer multipliceret med bufferkapacitet udbytte ionstrømme. Men denne proces kombinerer flere eksperimentelle fejl (på pH-målinger, målinger bufferkapacitet og Calibration), og er derfor ikke meget kvantitativ. Derfor at få adgang til enzymatiske konstanter plasmamembranen udtrykt transportør, hurtig ionstrøm teknikker er meget mere enkel og præcis.
Fordi intracellulære indhold er i millimolære område, afsløre NHE-medierede ændringer i cytosolisk natrium er ikke mulig. Fremover årevis sådanne uptake teknikker blev baseret på anvendelse af radioisotoper, såsom 22 Na +. Dette håndskrift beskriver en ikke-radioaktiv metode, for hvilken 22 Na + erstattes med lithium, baseret på det rationale, der denne kation, som også bruges af NHE'er, er fraværende fra cellecytosol og kan måles med stor nøjagtighed ved hjælp af atomabsorptionsspektrometri 21. Når de relevante betingelser (tid og lithium koncentration) til at måle lineære optræk (dvs.., Er i indledende satser betingelser) bestemmes, tilhørsforhold til de andre potentielle koblings- kationer og / ellerinhibitorer kan måles nøjagtigt som vist i figur 3 og 4. Et sidste potentiel begrænsning er, at lithium optagelse metode naturligvis kun kan fungere, hvis veksleren af interesse væsentligt transporterer denne kation. Hvis det ikke er tilfældet, vil forsøgslederen nødt til at stole enten på ovennævnte intracellulær pH-målinger eller bliver nødt til at bruge radioaktive natrium optagelse.
Et sådant sæt af eksperimenter har ført nylig førte til den iagttagelse, at NHE7 intracellulær Na + / H + exchanger, som oprindeligt mentes at være en H + / K + transportør, som ville alkalinize vesikler var i virkeligheden en endosomal forsyring mekanisme koblet til natrium 18.. Dette har dybe konsekvenser for intracellulære rum som hidtil denne rolle blev anset for at blive afsat til VH + ATPaser. Som hvert medlem af NHE familien synes at vise en meget specifik kinetisk signatur ofløj til sin fysiologiske rolle, er det fristende at hypotesen, at karakteriseringen af NHE6 og NHE9 hjælp af de metoder, der er beskrevet i denne artikel vil afsløre nye og uventede funktioner, der vil fremhæve deres fysiologiske funktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard cell culture equipement | Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers | ||
| Incubator with CO2 | Sanyo | MCO15A | |
| Incubator without CO2 | Heraeus instrument | BB6220 | |
| Laminar flow hood PSM1200NF | Fisher | 52010120 | |
| DMEM medium | sigma | D5796 | |
| FBS gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Penicilin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| Trypsin 10x | PAA | L11-003 | |
| Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system | Thermo Scientific | ICE 3500 GFZ | |
| LiCl | sigma | L4408 | |
| Nitric Acid | sigma | 438073 | |
| Fluorescence videomicroscopy set | Leica | Composed of many devices with different catalog numbers | |
| Inverted automated microscope | Leica | DMI6000B | |
| microscope stand | leica | 11888906 | |
| 11888911 | |||
| 11505180 | |||
| 11888377 | |||
| incident fluorescence | leica | 11888901 | |
| 11504166 | |||
| motor bracket | leica | 11888379 | |
| 11505234 | |||
| 11521505 | |||
| 11522106 | |||
| LED transmission light | leica | 8097321 | |
| 8102034 | |||
| 11521580 | |||
| motorized plate | leica | 11522068 | |
| 11531172 | |||
| 11521734 | |||
| 11521719 | |||
| 11888423 | |||
| 11888424 | |||
| camera output | leica | 11888373 | |
| 11507807 | |||
| 11888393 | |||
| 11888259 | |||
| 11888258 | |||
| 11541510 | |||
| images acquisition/analysis software | leica | 11888375 | |
| optics | leica | 11506507 | |
| 11506243 | |||
| 11506203 | |||
| fluorescence Xenon lamp | leica | DMI6000 | |
| camera | hamamatsu | 8100601 | |
| metafluor/Mmfluor software | 11640905 | ||
| pH sensitive probe, BCECF-AM | life technologies | B1170 | |
| Nigericin | Sigma | N7143 |
References
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Jentsch, T. J. Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CLC chloride transporters. J Physiol. 578 (3), 633-640 (2007).
- Kornak, U., et al. Mutations in the a3 subunit of the vacuolar H(+)-ATPase cause infantile malignant osteopetrosis. Hum Mol Genet. 9 (13), 2059-2063 (2000).
- Gunther, W., Piwon, N., Jentsch, T. J. The ClC-5 chloride channel knock-out mouse - an animal model for Dent's disease. Pflugers Arch. 445 (4), 456-462 (2003).
- Kasper, D., et al. Loss of the chloride channel ClC-7 leads to lysosomal storage disease and neurodegeneration. Embo J. 24 (5), 1079-1091 (2005).
- Poet, M., et al. Lysosomal storage disease upon disruption of the neuronal chloride transport protein ClC-6. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13854-13859 (2006).
- Nakamura, N., Tanaka, S., Teko, Y., Mitsui, K., Kanazawa, H. Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation. J Biol Chem. 280 (2), 1561-1572 (2005).
- Gilfillan, G. D., et al. SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome. Am J Hum Genet. 82 (4), 1003-1010 (2008).
- Mignot, C., et al. Novel mutation in SLC9A6 gene in a patient with Christianson syndrome and retinitis pigmentosum. Brain & Development. 35 (2), 172-176 (2013).
- Morrow, E. M., et al. Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry. Science. 321 (5886), 218-223 (2008).
- Lasky-Su, J., et al. Genome-wide association scan of the time to onset of attention deficit hyperactivity disorder. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 147B (8), 1355-1358 (2008).
- Franke, B., Neale, B. M., Faraone, S. V. Genome-wide association studies in ADHD. Hum Genet. 126 (1), 13-50 (2009).
- Meda, S. A., et al. A large scale multivariate parallel ICA method reveals novel imaging-genetic relationships for Alzheimer's disease in the ADNI cohort. Neuroimage. 60 (3), 1608-1621 (2012).
- Zhang, L., et al. A microdeletion in Xp11.3 accounts for co-segregation of retinitis pigmentosa and mental retardation in a large kindred. Am J Med Genet A. 140 (4), 349-357 (2006).
- Sardet, C., Franchi, A., Pouysségur, J. Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiporter. Cell. 56 (2), 271-280 (1989).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Franchi, A., Cragoe, E., Pouysségur, J. Isolation and properties of fibroblast mutants overexpressing an altered Na+/H+ antiporter. J Biol Chem. 261 (31), 14614-14620 (1986).
- Milosavljevic, N., et al. The Intracellular Na+/H+ Exchanger NHE7 effects a Na+ coupled, but not K+ coupled proton-loading mechanism in endocytosis. Cell Reports. 7 (3), 1-8 (2014).
- Wigler, M., et al. Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes. Cell. 16 (4), 777-785 (1979).
- Lacroix, J., Poët, M., Maherel, C., Counillon, L. A mechanism for the activation of the Na/H exchanger NHE-1 by cytoplasmic acidification and mitogens. EMBO Reports. 5 (1), 91-96 (2004).
- Milosavljevic, N., et al. Nongenomic Effects of Cisplatin: Acute Inhibition of Mechanosensitive Transporters and Channels without Actin Remodeling. Cancer Res. 70 (19), 7514-7522 (2010).
- Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).
- Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Na+-H+ exchange in gastric glands as measured with a cytoplasmic-trapped, fluorescent pH indicator. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (23), 7436-7440 (1984).
- Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Digital image processing of intracellular pH in gastric oxyntic and chief cells. Nature. 325, 447-450 (1987).
- Quentin, F., et al. RhBG and RhCG, the putative ammonia transporters, are expressed in the same cells in the distal nephron. J Am Soc Nephrol. 14 (3), 545-554 (2003).
- Geyer, R. R., Musa-Aziz, R., Enkavi, G., Mahinthichaichan, P., Tajkhorshid, E., Boron, W. F. Movement of NH3 through the human urea transporter B: a new gas channel. Am J Physiol Renal Physiol. 304 (12), F1447-F1457 (2013).
