Functionele karakterisatie van Na<sup> +</sup> / H<sup> +</sup> Warmtewisselaars van intracellulaire compartimenten met Proton-doden Selectie om ze te uiten op het plasmamembraan
Summary
The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.
Abstract
Endosomale verzuring is van cruciaal belang voor een breed scala van processen, zoals eiwitten recycling en degradatie, receptor desensibilisatie, en neurotransmitter laden in de synaptische blaasjes. Deze verzuring wordt beschreven te worden gemedieerd door proton ATPasen gekoppelde CIC chloride transporters. Sterk geconserveerde electroneutrale protonen transporters, worden de Na + / H + uitwisselaars (NHE) 6, 7 en 9 ook die in deze compartimenten. Mutaties in de genen verbonden met menselijke cognitieve en neurodegeneratieve ziekten. Paradoxaal genoeg, hun rol blijven ongrijpbaar, als hun intracellulaire lokalisatie heeft verhinderd gedetailleerde functionele karakterisatie. Het manuscript geeft een methode om dit probleem op te lossen. Deze bestaat uit de selectie van mutante cellijnen, bestand zijn tegen acute cytosolische verzuring door behoud intracellulaire NHEs op het plasmamembraan. Het toont dan twee aanvullende protocollen bij het ion selectiviteit en activiteit te metenDeze wisselaars: (i) één gebaseerd op intracellulaire pH-metingen via fluorescentie microscopie video, en (ii) een op basis van de snelle kinetiek van lithium opname. Dergelijke protocollen kunnen worden geëxtrapoleerd naar andere niet-elektrogene transporters meten. Bovendien is de selectieprocedure gepresenteerde genereert cellen met een intracellulaire retentie defect fenotype. Daarom zullen deze cellen ook andere vesiculaire membraaneiwitten in de plasmamembraan drukken. De experimentele strategie hier afgebeelde derhalve een potentieel krachtig hulpmiddel om andere intracellulaire eiwitten die dan wordt uitgedrukt in het plasmamembraan met vesiculaire Na + / H + warmtewisselaars gebruikt voor de selectie.
Introduction
De meeste intracellulaire compartimenten geven een zure luminale pH, dat is een belangrijke parameter voor de rijping, mensenhandel, recycling van eiwitten of hormonen en neurotransmitters geladen. Aangetoond is dat de pH-gradiënt tussen cytosol en vesiculaire inhoud wordt gegenereerd door vacuolair H + ATPasen 1, gekoppeld met vesiculaire ClC chloride transporteurs 2. Zowel in de knock-out (KO) muizen en menselijke patiënten, het belang van deze transporters werd benadrukt door de zware fenotypes veroorzaakt door mutaties in hun genen 3-6.
De leden van de natrium-waterstof wisselaars SLC9A familie, aangeduid ook NHEs voor Na + / H + wisselaars, is aangetoond sleutel effectoren in intracellulaire pH en celvolume regulatie, evenals in vectoriële transport van zuur-base-equivalenten in epithelia worden . Naast de plasmamembraan NHEs, drie zeer geconserveerde Na + / H + wisselaars NHE 6, 7en 9 worden uitgedrukt in trans-Golgi netwerk en begin endosomen 7. Mutaties in hun genen hebben in verband gebracht met het Angelman-achtige of Christianson syndromen 8-9, familie-gebaseerde autisme 10 en Attention Deficit Hyperactivity Disorder 11-12. Deze warmtewisselaars zijn ook betrokken geweest bij neurodegeneratieve problemen zoals Alzheimer ziektegevoeligheid 13 en X-gebonden mentale retardatie aaneengesloten genen syndromen 14. Tezamen bieden deze studies benadrukken het belang van deze intracellulaire NHEs in ontwikkeling van de hersenen en / of functie.
De intracellulaire lokalisatie van deze wisselaars voorkomt nauwkeurige metingen van hun ionselectiviteit, transport richting, kinetische parameters en regelgeving. Zoals bij alle transporteurs uitgedrukt in intracellulaire compartimenten, is het uiterst moeilijk om hun biochemische activiteiten te beoordelen en daarmee tot volle hun fysiologische rol en de Mechanismen onderliggende hun pathologische gevolgen. Gebaseerd op de hoge cytosolische K + concentratie, de meest algemeen aanvaarde hypothese was dat ze werken als K + gekoppelde proton efflux transporters. Het bestaan van dergelijke proton lek werd verondersteld, omdat proton pomp kan compenseren door de V-ATPasen om een steady state vesiculaire pH te handhaven. Het doel van dit visuele artikel is (i) een werkwijze die de genetische selectie van cellijnen die dergelijke vesiculaire transporters op de plasmamembraan expressie, en (ii) twee onafhankelijke benaderingen om de functies van deze transporters meten zichtbaar blijft tonen.
Drie decennia geleden hebben Pouysségur en Franchi een genetische benadering die de moleculaire klonering en karakterisering van de leden van de NHE familie 15 ingeschakeld bood. Dit was gebaseerd op de toxiciteit van intracellulaire protonen als screeningsmethode. De eerste stap was om cellijnen deficiënt te verkrijgenin een Na + / H + uitwisseling uitgedrukt op het plasmamembraan, waarbij de reversibiliteit van deze transporter. Fibroblasten (CCL39 cellijn) werden voorgeladen met Na + of Li + en daarna in een zuur extracellulaire medium (pH 6,5) gedurende 2 uur. Dit leidde tot de dood van cellen die een functioneel Na + / H + uitwisseling en de selectie van antiporter-deficiënte cellen (PS120 cellijn) 16. Wanneer gekweekt in bicarbonaat-vrij medium, deze cellen zijn zeer gevoelig voor acute intracellulaire aanzuring. Bijgevolg zal de expressie van een functioneel proton efflux mechanisme het plasmamembraan positief worden geselecteerd (zie 17) of dergelijke cellen zijn afkomstig van acute intracellulaire acidifications. Dergelijke verzuring technieken kunnen worden gebruikt om cellijnen te isoleren met verhandelen gebreken waarvan de geforceerde expressie van WT intracellulaire NHEs het plasmamembraan.
Als eukaryotische Na + / H+ Wisselaars electroneutrale, zijn ze niet meetbaar door de elektrofysiologische benaderingen die zijn met succes gebruikt om kanalen te meten. Dit manuscript toont dus hoe de activiteit van dit wisselaar te meten door intracellulaire pH-metingen en snelle kinetiek van lithium opname. Als de onderliggende begrippen hetzelfde is interessant op te merken dat veel van de werkwijzen ontwikkeld voor het gedeelte selectie ook rechtstreeks worden gebruikt voor functionele metingen.
Interessant, hebben we vastgesteld dat de handel defect in de cellijnen geselecteerd met de in dit manuscript beschreven aanpak leidt tot een grotere expressie van andere vesiculaire eiwitten in het plasmamembraan zoals vesiculaire kaliumkanaal TWIK1 18. Dit wijst in de richting van de selectie van een algemene retentie defect mechanisme voor vesiculaire transmembraaneiwitten. Vandaar deze selectieprocedure en de cellen die het genereert meivormen een veelbelovend hulpmiddel voor de wetenschappelijke gemeenschap aan het membraaneiwitten van intracellulaire compartimenten. Zowel de meettechnieken hier gepresenteerde zou gelden voor het bestuderen van andere niet-elektrogene transporters zijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol wordt beschreven hoe cellen die intracellulaire Na + / H + uitwisselaars bij de plasmamembraan selecteren zonder dat hun primaire sequentie door plaatsgerichte mutagenese. Deze wisselaars kunnen nu worden gekarakteriseerd.
Deze methode is gebaseerd op de cellulaire toxiciteit van intracellulaire protonen cellijnen die vesiculaire Na + / H + uitwisselaars zal drukken op de plasmamembraan selecteren. Het zou mogelijk zijn in principe and…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are deeply indebted to all the members of the scientific community working on pH and ion transport, who have originated and improved the measurements described here. They particularly thank Dr. Jacques Pouysségur who originated the H+-killing selection technique used here. They acknowledge the University of Nice-Sophia Antipolis, the CNRS, the ANR (JCJC SVSE1 NHEint) and the ICST Labex for support.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Standard cell culture equipement | Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers | ||
| Incubator with CO2 | Sanyo | MCO15A | |
| Incubator without CO2 | Heraeus instrument | BB6220 | |
| Laminar flow hood PSM1200NF | Fisher | 52010120 | |
| DMEM medium | sigma | D5796 | |
| FBS gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Penicilin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| Trypsin 10X | PAA | L11-003 | |
| Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system | Thermo Scientific | ICE 3500 GFZ | |
| LiCl | sigma | L4408 | |
| Nitric Acid | sigma | 438073 | |
| Fluorescence videomicroscopy set | Leica | Composed of many devices with different catalog numbers | |
| Inverted automated microscope | Leica | DMI6000B | |
| microscope stand | leica | 11888906 | |
| 11888911 | |||
| 11505180 | |||
| 11888377 | |||
| incident fluorescence | leica | 11888901 | |
| 11504166 | |||
| motor bracket | leica | 11888379 | |
| 11505234 | |||
| 11521505 | |||
| 11522106 | |||
| LED transmission light | leica | 8097321 | |
| 8102034 | |||
| 11521580 | |||
| motorized plate | leica | 11522068 | |
| 11531172 | |||
| 11521734 | |||
| 11521719 | |||
| 11888423 | |||
| 11888424 | |||
| camera output | leica | 11888373 | |
| 11507807 | |||
| 11888393 | |||
| 11888259 | |||
| 11888258 | |||
| 11541510 | |||
| images acquisition/analysis software | leica | 11888375 | |
| optics | leica | 11506507 | |
| 11506243 | |||
| 11506203 | |||
| fluorescence Xenon lamp | leica | DMI6000 | |
| camera | hamamatsu | 8100601 | |
| metafluor/Mmfluor software | 11640905 | ||
| pH sensitive probe, BCECF-AM | life technologies | B1170 | |
| Nigericin | Sigma | N7143 |
References
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Jentsch, T. J. Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CLC chloride transporters. J Physiol. 578 (3), 633-640 (2007).
- Kornak, U., et al. Mutations in the a3 subunit of the vacuolar H(+)-ATPase cause infantile malignant osteopetrosis. Hum Mol Genet. 9 (13), 2059-2063 (2000).
- Gunther, W., Piwon, N., Jentsch, T. J. The ClC-5 chloride channel knock-out mouse – an animal model for Dent’s disease. Pflugers Arch. 445 (4), 456-462 (2003).
- Kasper, D., et al. Loss of the chloride channel ClC-7 leads to lysosomal storage disease and neurodegeneration. Embo J. 24 (5), 1079-1091 (2005).
- Poet, M., et al. Lysosomal storage disease upon disruption of the neuronal chloride transport protein ClC-6. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13854-13859 (2006).
- Nakamura, N., Tanaka, S., Teko, Y., Mitsui, K., Kanazawa, H. Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation. J Biol Chem. 280 (2), 1561-1572 (2005).
- Gilfillan, G. D., et al. SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome. Am J Hum Genet. 82 (4), 1003-1010 (2008).
- Mignot, C., et al. Novel mutation in SLC9A6 gene in a patient with Christianson syndrome and retinitis pigmentosum. Brain & Development. 35 (2), 172-176 (2013).
- Morrow, E. M., et al. Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry. Science. 321 (5886), 218-223 (2008).
- Lasky-Su, J., et al. Genome-wide association scan of the time to onset of attention deficit hyperactivity disorder. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 147B (8), 1355-1358 (2008).
- Franke, B., Neale, B. M., Faraone, S. V. Genome-wide association studies in ADHD. Hum Genet. 126 (1), 13-50 (2009).
- Meda, S. A., et al. A large scale multivariate parallel ICA method reveals novel imaging-genetic relationships for Alzheimer’s disease in the ADNI cohort. Neuroimage. 60 (3), 1608-1621 (2012).
- Zhang, L., et al. A microdeletion in Xp11.3 accounts for co-segregation of retinitis pigmentosa and mental retardation in a large kindred. Am J Med Genet A. 140 (4), 349-357 (2006).
- Sardet, C., Franchi, A., Pouysségur, J. Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiporter. Cell. 56 (2), 271-280 (1989).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L’Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Franchi, A., Cragoe, E., Pouysségur, J. Isolation and properties of fibroblast mutants overexpressing an altered Na+/H+ antiporter. J Biol Chem. 261 (31), 14614-14620 (1986).
- Milosavljevic, N., et al. The Intracellular Na+/H+ Exchanger NHE7 effects a Na+ coupled, but not K+ coupled proton-loading mechanism in endocytosis. Cell Reports. 7 (3), 1-8 (2014).
- Wigler, M., et al. Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes. Cell. 16 (4), 777-785 (1979).
- Lacroix, J., Poët, M., Maherel, C., Counillon, L. A mechanism for the activation of the Na/H exchanger NHE-1 by cytoplasmic acidification and mitogens. EMBO Reports. 5 (1), 91-96 (2004).
- Milosavljevic, N., et al. Nongenomic Effects of Cisplatin: Acute Inhibition of Mechanosensitive Transporters and Channels without Actin Remodeling. Cancer Res. 70 (19), 7514-7522 (2010).
- Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).
- Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Na+-H+ exchange in gastric glands as measured with a cytoplasmic-trapped, fluorescent pH indicator. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (23), 7436-7440 (1984).
- Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Digital image processing of intracellular pH in gastric oxyntic and chief cells. Nature. 325, 447-450 (1987).
- Quentin, F., et al. RhBG and RhCG, the putative ammonia transporters, are expressed in the same cells in the distal nephron. J Am Soc Nephrol. 14 (3), 545-554 (2003).
- Geyer, R. R., Musa-Aziz, R., Enkavi, G., Mahinthichaichan, P., Tajkhorshid, E., Boron, W. F. Movement of NH3 through the human urea transporter B: a new gas channel. Am J Physiol Renal Physiol. 304 (12), F1447-F1457 (2013).
