ナの機能的特徴<sup> +</sup> / H<sup> +</sup細胞膜でそれらを表現するためにプロトン殺す選択を使用した細胞内区画の>交換器
Summary
The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.
Abstract
エンドソームの酸性化は、タンパク質のリサイクルと劣化、受容体の脱感作、およびシナプス小胞における神経伝達物質の負荷などのプロセス、幅広いするために重要である。この酸性化のClC塩化物輸送体に結合されたプロトンATPアーゼによって媒介されることが記載されている。電気的中性のプロトン輸送体を高度に保存された、のNa + / H +交換体（NHE）6、7及び9は、これらのコンパートメントにおいて発現される。それらの遺伝子の変異は、人間の認知と神経変性疾患にリンクされています。それらの細胞内局在化は、詳細な機能解析を妨げているように逆説的に、彼らの役割は、とらえどころのないまま。この原稿は、この問題を解決する方法を示している。これは、原形質膜で細胞内NHEsを保持することにより急性のサイトゾル酸性化の生存可能な変異体細胞系の選択から成る。次に、イオン選択性および活性を測定するために二つの相補的なプロトコルを示している（i）1種の蛍光ビデオ顕微鏡を用いて細胞内pH測定値に基づいて、および（ii）1つのリチウムの取り込みの迅速な動態に基づくこれらの交換器。そのようなプロトコルは、他の非起電性輸送を測定するために外挿することができる。さらに、ここで提示選択手順は、細胞内の保持不良表現型を有する細胞を生成する。従って、これらの細胞は、原形質膜における他の小胞の膜タンパク質を発現する。ここに示された実験戦略は、したがって、その後の選択のために使用される小胞のNa + / H +の交換とともに原形質膜で発現される他の細胞内タンパク質を研究するための潜在的に強力なツールを構成することができる。
Introduction
ほとんどの細胞内区画は、タンパク質またはホルモンの成熟、人身売買、リサイクル、神経伝達物質の負荷のために重要なパラメータである酸性の管腔のpHを、表示します。これは、サイトゾルおよび小胞の内容の間のpH勾配が小胞のClC塩化物トランスポーター2に結合され、液胞型H + -ATPアーゼ1によって生成されることが示されている。ノックアウト（KO）マウスとヒト患者の両方で、これらのトランスポーターの重要性は、その遺伝子3-6の突然変異によって引き起こさ重い表現型によって強調されています。
ナトリウム-水素交換体SLC9Aファミリーのメンバー、またのNa + / H +交換体のためNHEsと呼ばれるが、細胞内pHと細胞容積調節において、ならびに上皮を横切る酸-塩基当量のベクトル輸送における重要なエフェクターであることが示されている。原形質膜NHEs、3つの高度に保存されのNa + / H +交換体、NHE 6,7に加えおよび9はトランスゴルジ網および初期エンドソーム7で表されている。それらの遺伝子の変異は、アンジェルマン様またはクリスチャンソン症候群8-9、家族ベースの自閉症10及び注意欠陥多動性障害11-12でリンクされている。これらの交換器はまた、アルツハイマー病感受性13とX連鎖精神遅滞隣接遺伝子症候群14などの神経変性の問題に関わってきた。まとめると、これらの研究は、脳の発達および/または機能のこれらの細胞内NHEsの重要性を強調している。
これらの交換器の細胞内局在化は、それらのイオン選択性、搬送方向、速度論的パラメータ、及び規制の正確な測定を妨げる。細胞内区画において発現すべてのトランスポーターの場合のように、それらの生化学的活性を評価するために、したがって、完全にそれらの生理学的役割とmechanを理解することは極めて困難である彼らの病理学的な意味を根底にあるISMS。高い細胞質ゾルK +濃度に基づいて、最も一般的に受け入れられて仮説は、彼らがK +結合したプロトン排出トランスポーターとして働いていたということでした。それは定常状態の水疱性pHを維持するために、V-ATPアーゼによってプロトンポンプを相殺できるようなプロトンリークの存在が仮定されていた。この視覚資料の目的は、それらの形質膜にこのような小胞輸送体を発現する細胞株の遺伝的選択を可能にする、および（ii）これらのトランスポーターの機能を測定するために、二つの独立したアプローチを示すための方法を実証するためには、（i）である。
30年前、PouysségurとフランキはNHEファミリー15のメンバーの分子クローニングおよび特性を有効に遺伝的アプローチを開拓してきた。これは、スクリーニング法として、細胞内のプロトンの毒性に基づいていた。最初のステップは、欠損細胞株を得ることであった任意のNa + / H +交換において、このトランスポーターの可逆性を用いて、原形質膜で発現する。線維芽細胞は、（CCL39細胞株）のNa +またはLi +でプリロードし、次いで2時間、酸性細胞外培地（pH6.5）中に入れた。これは、機能のNa + / H +交換体を発現する細胞の死およびアンチポーター欠損細胞（PS120細胞系）16の選択につながった。重炭酸塩を含まない培地中で培養した場合、これらの細胞は、急性細胞内酸性化に非常に敏感である。そのような細胞は、急性細胞acidificationsに提出された場合、結果として、原形質膜における任意の機能プロトン流出メカニズムの発現が正に（17を参照）が選択される。このような酸性化技術は、売買欠陥が原形質膜でWT細胞NHEsの強制発現を可能とする細胞株を単離することができる。
真核生物のNa + / Hとして+交換器は、彼らがチャンネルを測定するために大きな成功を収めて使用されている電気生理学的ア プローチによって測定可能ではないが、電気的に中性である。この原稿は、したがって、細胞内pH測定及びリチウム取り込みの迅速な動態によって、この交換器の活性を測定する方法を示します。基礎となる概念が同じであるように、選択部のために開発プロセスの多くは、機能の測定のために直接使用されることに注意することは興味深い。
興味深いことに、我々は、この原稿に記載されたアプローチを使用して選択された細胞株に存在するトラフィッキング欠陥は、水疱性カリウムチャンネルTWIK1 18のように、原形質膜における他の小胞のタンパク質のより大きな発現をもたらすことを観察した。これは、小胞の膜貫通型タンパク質のための一般的なリテンション不良メカニズムの選択に向かって指摘している。したがって、この選択手順と、それが05を生成する細胞細胞内コンパートメントの膜タンパク質に取り組んで科学的なコミュニティのための有望なツールを構成している。同様にここで紹介する測定技術は、他の非起電性トランスポーターを研究するための適用可能な場合があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、部位特異的突然変異誘発によって、その一次配列を変更することなく、原形質膜で細胞内のNa + / H +交換体を発現する細胞を選択する方法について説明します。これらの交換は今特徴付けることができる。
この方法は、原形質膜小胞でのNa + / H +交換体を発現する細胞株を選択するために、細胞内のプロトンの細胞毒性?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are deeply indebted to all the members of the scientific community working on pH and ion transport, who have originated and improved the measurements described here. They particularly thank Dr. Jacques Pouysségur who originated the H+-killing selection technique used here. They acknowledge the University of Nice-Sophia Antipolis, the CNRS, the ANR (JCJC SVSE1 NHEint) and the ICST Labex for support.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Standard cell culture equipement | Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers | ||
| Incubator with CO2 | Sanyo | MCO15A | |
| Incubator without CO2 | Heraeus instrument | BB6220 | |
| Laminar flow hood PSM1200NF | Fisher | 52010120 | |
| DMEM medium | sigma | D5796 | |
| FBS gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Penicilin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| Trypsin 10X | PAA | L11-003 | |
| Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system | Thermo Scientific | ICE 3500 GFZ | |
| LiCl | sigma | L4408 | |
| Nitric Acid | sigma | 438073 | |
| Fluorescence videomicroscopy set | Leica | Composed of many devices with different catalog numbers | |
| Inverted automated microscope | Leica | DMI6000B | |
| microscope stand | leica | 11888906 | |
| 11888911 | |||
| 11505180 | |||
| 11888377 | |||
| incident fluorescence | leica | 11888901 | |
| 11504166 | |||
| motor bracket | leica | 11888379 | |
| 11505234 | |||
| 11521505 | |||
| 11522106 | |||
| LED transmission light | leica | 8097321 | |
| 8102034 | |||
| 11521580 | |||
| motorized plate | leica | 11522068 | |
| 11531172 | |||
| 11521734 | |||
| 11521719 | |||
| 11888423 | |||
| 11888424 | |||
| camera output | leica | 11888373 | |
| 11507807 | |||
| 11888393 | |||
| 11888259 | |||
| 11888258 | |||
| 11541510 | |||
| images acquisition/analysis software | leica | 11888375 | |
| optics | leica | 11506507 | |
| 11506243 | |||
| 11506203 | |||
| fluorescence Xenon lamp | leica | DMI6000 | |
| camera | hamamatsu | 8100601 | |
| metafluor/Mmfluor software | 11640905 | ||
| pH sensitive probe, BCECF-AM | life technologies | B1170 | |
| Nigericin | Sigma | N7143 |
References
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