Abstract
Endosomalen Ansäuerung ist von entscheidender Bedeutung für eine Vielzahl von Prozessen, wie zB Protein-Recycling und Abbau, Rezeptordesensibilisierung und Neurotransmitter Belastung in synaptischen Vesikeln. Diese Ansäuerung wird beschrieben, dass durch Protonen-ATPasen, um ClC Chloridtransporter gekoppelt vermittelt werden. Hochkonservierten elektro Protonen Transporter sind die Na + / H + Austauscher (NHE) 6, 7 und 9 auch in diesen Kammern ausgedrückt. Mutationen in ihren Genen haben mit der menschlichen kognitiven und neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht worden. Paradoxerweise bleibt ihre Rolle schwer fassbar, da ihre intrazelluläre Lokalisation hat detaillierte funktionelle Charakterisierung verhindert. Diese Handschrift zeigt ein Verfahren, um dieses Problem zu lösen. Diese besteht aus der Auswahl der mutierten Zelllinien, fähig zu überleben akuten cytosolische Ansäuerung durch Halte intrazellulärem NHEs an der Plasmamembran. Es zeigt dann zwei sich ergänzenden Protokolle, um die Ionenselektivität und Aktivität zu messendieser Austauscher: (i) eine auf die intrazelluläre pH-Messungen unter Verwendung von Fluoreszenzvideomikroskopie, und (ii) eine auf der Basis der schnellen Kinetik der Lithiumaufnahme. Solche Protokolle können extrapoliert werden, um andere nicht-elektro Transporter zu messen. Darüber hinaus ist die hier vorgestellte Auswahlverfahren erzeugt Zellen mit einem intrazellulären Retention defekt Phänotyp. Daher werden diese Zellen exprimieren auch andere Vesikelmembran Proteine an der Plasmamembran. Die hier dargestellte experimentelle Strategie kann daher eine potentiell leistungsfähiges Werkzeug, um andere intrazelluläre Proteine, die dann an der Plasmamembran zusammen mit der vesikulären Na + / H + Austauscher für die Auswahl verwendet ausdrücken zu studieren.
Introduction
Die meisten intrazellulären Kompartimenten Anzeige eine saure luminalen pH-Wert, der einer der wichtigsten Parameter für die Reifung, Menschenhandel, Recycling von Proteinen oder Hormonen und Neurotransmittern Laden ist. Es wurde gezeigt, dass der pH-Gradient zwischen Cytosol und vesikulärer Gehalt durch vakuoläre H + ATPasen 1 erzeugt, um vesikuläre ClC Chloridtransporter 2 gekoppelt. Sowohl in Knock-out (KO) Mäusen und menschlichen Patienten ist die Bedeutung dieser Transporter durch die schweren Phänotypen, die durch Mutationen in ihren Genen 3-6 verursacht hervorgehoben.
Die Mitglieder des Sodium-Hydrogen Tauscher SLC9A Familie, genannt auch NHEs für Na + / H + Austauscher haben, dass sie Schlüssel Effektoren der intrazellulären pH-Wert und Zellvolumenregulation sowie in vektorieller Transport von Säure-Basenäquivalente durch das Zellgewebe sein . Neben der Plasmamembran NHEs drei hochkonservierten Na + / H + Austauscher NHE 6, 7und 9 sind in trans-Golgi Netzwerk und Anfang Endosomen 7 ausgedrückt. Mutationen in ihren Genen haben mit Angelman-like oder Christi Syndrome 8-9, familienbasierten Autismus 10 und Aufmerksamkeits-Defizit-Hyperaktivitäts-Störung 11-12 verbunden. Diese Tauscher auch bei neurodegenerativen Probleme wie Alzheimer Krankheitsanfälligkeit 13 und X-chromosomale geistige Retardierung zusammenhängenden Gene Syndrome 14 beteiligt. Zusammen genommen verdeutlichen auch diese Studien die Bedeutung dieser intrazellulären NHEs der Gehirnentwicklung und / oder Funktion.
Die intrazelluläre Lokalisation dieser Tauscher verhindert genaue Messungen der Ionenselektivität, Transportrichtung, kinetische Parameter und Regulierung. Wie ist der Fall für alle Transporter in intrazellulären Kompartimenten ausgedrückt, äußerst schwierig, ihre biochemischen Aktivitäten zu bewerten und damit zu ihrer physiologischen Funktionen und die mechan vollständig zu verstehen istIsmen zugrunde liegenden pathologischen ihre Auswirkungen. Aufgrund der hohen cytosolische K + -Konzentration, war die allgemein akzeptierte Hypothese, dass sie als K + gekoppelten Protonen Efflux-Transporter arbeiten. Die Existenz einer solchen Protonenleck hatte Hypothese aufgestellt, wie es Protonenpumpen durch den V-ATPasen, um einen stationären Zustand vesikulären pH aufrechtzuerhalten leichen. Das Ziel dieser visuellen Gegenstand (i), ein Verfahren, das die genetische Selektion von Zelllinien, die solche vesikuläre Transporter an ihrer Plasmamembran zu exprimieren, und (ii) an zwei unabhängige Ansätze, um die Funktionen dieser Transporter messen zeigen ermöglicht demonstrieren.
Vor drei Jahrzehnten Pouysségur und Franchi eine genetische Ansatz, der die molekulare Klonierung und Charakterisierung der Mitglieder der NHE Familie 15 aktiviert voran. Dies wurde auf die Toxizität von intrazellulärem Protonen als Screening Methode. Der erste Schritt war, um Zelllinien zu erhalten defizientenjeden Na + / H + -Austausch ausgedrückt in der Plasmamembran mit Hilfe der Reversibilität dieses Transporters. Fibroblasten (CCL39-Zellinie) wurden mit Na + oder Li + vorgespannt und dann in einer sauren extrazellulären Mediums (pH 6,5) für 2 Stunden platziert. Dies führte zu dem Tod von Zellen, die einen funktionellen Na + / H + -Austausch zu aktivieren und auf die Auswahl von Antiporter-defizienten Zellen (PS120 Zellinie) 16. Wenn Bicarbonat-freiem Medium kultiviert werden, diese Zellen sind sehr empfindlich gegenüber akuten intrazellulären Ansäuerung. Infolgedessen wird die Expression eines beliebigen Funktionsprotonen Effluxmechanismen an der Plasmamembran positiv gewählt werden (siehe 17), wenn diese Zellen in akuten intrazellulären Ansäuerungen eingereicht. Solche Versauerung Techniken können verwendet werden, um Zelllinien mit Handel Defekte ermöglicht die erzwungene Expression von WT intrazellulären NHEs an der Plasmamembran zu isolieren.
Als eukaryontische Na + / H+ Tauscher sind elektro, sie sind nicht messbar durch die elektrophysiologische Ansätze, die mit großem Erfolg eingesetzt worden sind, um Kanäle zu messen. Dieses Manuskript daher demonstriert, wie die Aktivität dieses Tauscher durch intrazelluläre pH-Messungen und schnelle Kinetik der Lithiumaufnahme messen. Da die zugrunde liegenden Konzepte die gleichen sind, ist es interessant zu bemerken, daß viele der für den Auswahlabschnitt entwickelten Verfahren auch direkt für die funktionelle Messungen verwendet.
Interessanterweise haben wir festgestellt, dass der Menschenhandel Defekt in der Zelllinien mit Hilfe der in dieser Handschrift beschriebenen Ansatz gewählt vorhanden führt zu einer größeren Expression von anderen vesikulären Proteine an der Plasmamembran wie der vesikulären Kaliumkanal TWIK1 18. Dies weist darauf hin, in Richtung auf die Auswahl einer allgemeinen Retentionsdefektmechanismus vesicularis Transmembranproteine. Daher ist diese Auswahlverfahren und die Zellen, die es generiert Maistellen ein vielversprechendes Werkzeug für die wissenschaftliche Gemeinschaft der Arbeit an den Membranproteinen von intrazellulären Kompartimenten. Sowie die Messtechnik hier vorgestellten könnten anwendbar für die Untersuchung anderer nicht-elektroTransporter sein.
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Protocol
1. H + Töten Auswahl
- Zelllinien
- Stabil zu transfizieren NHE-defiziente Zellen (zB die CCL39-abgeleitete PS120 Zellinie 16) mit einer beliebigen Kombination von Säugetier-Expressionsvektor und Transfektion Verfahren, die eine effiziente Transfektion Ausbeuten und Selektion in einer Fibroblastenzelllinie zu produzieren.
HINWEIS: Viele Jahre wurde Calciumphosphatpräzipitation 19 mit guten Ausbeuten Transfektion verwendet. Dies wurde in jüngerer Zeit durch kommerzielle Reagenzien wie Lipofectamine2000 ersetzt, wobei die Transfektionen nach Herstellerangaben durchgeführt.
- Stabil zu transfizieren NHE-defiziente Zellen (zB die CCL39-abgeleitete PS120 Zellinie 16) mit einer beliebigen Kombination von Säugetier-Expressionsvektor und Transfektion Verfahren, die eine effiziente Transfektion Ausbeuten und Selektion in einer Fibroblastenzelllinie zu produzieren.
- Lösungen
- Bereiten drei nachstehend beschriebenen sterilen Lösungen. Sterilisieren Sie diese Lösungen durch Filtration (0,22 um).
- Vorbereiten einer NH 4 + Loading-Lösung (pH 7,4) von 50 mM NH 4 Cl, 70 mM Cholinchlorid, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM gl umfasstucose und 15 mM MOPS pH 7,4.
- Bereiten einer Spüllösung (pH 7,0), der 120 mM Cholinchlorid, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM HEPES bei pH 7,0 enthielt.
- Vorbereiten einer Gewinnungslösung (pH 7,4), der 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM HEPES bei pH 7,4 enthielt.
- Bereiten drei nachstehend beschriebenen sterilen Lösungen. Sterilisieren Sie diese Lösungen durch Filtration (0,22 um).
- Vor Beginn der Auswahl, erhalten eine Zellkulturbrutschrank, die bei 37 ° C ohne zusätzliche CO 2 aus externem Behälter (genannt CO 2 - "frei" Inkubator) verwendet werden kann, wie 5% CO 2 wird in Puffer Ergebnis, dass die beeinträchtigen können Versauerung. Erhöhen der Zelllinie, die NHE von Interesse bis zu etwa 2 x 10 8 Zellen (in der Regel etwa 20 konfluenten 100 mm-Platten).
- H + Töten Verfahren:
- Die Zellen, die den intrazellulären NHE interessiere Inkubation für 1 Stunde in der Auftragslösung bei 37 ° C im CO 2 -freie Inkubator.
- Saugen Sie das Lade Lösung und dann zweimal spülen Sie sie in der oben beschriebenen-Spüllösung. Führen Sie diesen Schritt effizient, um die restliche extrazellulären NH 4 Cl, die die Schaffung eines steilen NH 4 + Gradienten, die die Versauerung generieren beeinträchtigen beseitigen.
- Beseitigen Sie die Spülmedium durch Aspiration und inkubieren Sie die Zellen für eine Stunde im Recovery-Lösung wieder auf 37 ° C im CO 2 Inkubator frei.
- Ersetzen des Wiederherstellungsmedium mit regelmäßigen Kulturmedium (typischerweise DMEM mit 7,5% FCS) und wachsen die Zellen in Standardkulturbedingungen (37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 und 95% Luft).
- Wiederholen Sie diesen Zyklus der Auswahl zweimal in der Woche, bis stabile Klone entstehen.
HINWEIS: Seien Sie besonders vorsichtig über die Zellkultur und Selektionsbedingungen. Monate Arbeit kann von jedem Kontamination, die anfälliger für o ist ruiniertCCur nach einer langen Periode der Kultur und wiederholte Zellmanipulationen.- Hier auswählen, ob die Klone zu verstärken und zu charakterisieren, sie individuell, wie weiter in Abschnitte 2-3 beschrieben, oder sie gemeinsam zusammen, um eine Zellpopulation vor der Charakterisierung zu erzeugen.
- Anwenden gelegentlichen Auswahl (etwa einmal alle zwei Wochen), um die Ansäuerung-resistenten Zellen durch Gegen diejenigen ausgewählt werden, die dem Elternsäureempfindlichen Phänotyp (1B) umgeschaltet haben kann beibehalten.
2. Intrazelluläre pH-Messungen
2.1) Fluoreszenz pH Imaging
- Verwenden Sie die ratiometrische pH-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff BCECF / AM, der pH-empfindlich ist, wenn bei 490 nm angeregt und besitzt eine 445 nm isosbestischen Punkt nach Herstellerprotokolle.
- Alternativ können Sie auch andere pH-empfindliche Sonden, nach Herstellerprotokolle.
- Verwenden Sie eine Bild gesetzt conbestehend aus einem umgekehrten Mikroskop auf eine hohe Empfindlichkeit Videokamera gekoppelt ist. Rüsten Sie dieses Set mit 450 nm und 490 nm Schmalband-Interferenzfilter, gepaart mit entsprechenden Quarz-Neutraldichtefilter zur Anregung.
- Wenn möglich, verwenden Sie die entsprechende Reihe von Filtern und Beleuchtungsbedingungen die Einrichtung vergleichbarer Fluoreszenzwerte für λ1 und λ2, dass das Verhältnis nähert 1. Vermeiden Sie auch basale Fluoreszenzwerte, die gesetzt werden, entweder gesättigt oder zu niedrig ist, sowohl für λ1 und / oder λ2. Dies kann wichtige Artefakte ergeben, wie dann kann das Verhältnis nicht nachweisbar, obwohl intrazellulären pH-Wert verändert sich.
HINWEIS: Das System muss schnell Perfusion, Zeitraffer-Anregung bei den beiden oben genannten Wellenlängen und Übernahmen in der richtigen Emissionswellenlänge (535 nm für BCECF) zu ermöglichen. Rüsten Sie das System mit Software, die automatische Datenerfassung und -speicherung.
- Wenn möglich, verwenden Sie die entsprechende Reihe von Filtern und Beleuchtungsbedingungen die Einrichtung vergleichbarer Fluoreszenzwerte für λ1 und λ2, dass das Verhältnis nähert 1. Vermeiden Sie auch basale Fluoreszenzwerte, die gesetzt werden, entweder gesättigt oder zu niedrig ist, sowohl für λ1 und / oder λ2. Dies kann wichtige Artefakte ergeben, wie dann kann das Verhältnis nicht nachweisbar, obwohl intrazellulären pH-Wert verändert sich.
2.2) Messung der NHE Zukunfts Aktivität (Extrusion vonProtonen aus dem Cytosol)
- Anzusäuern Zellen durch einen 1-stündigen Inkubation in der NH 4 + Loading-Lösung (siehe Schritt 1.4) in Abwesenheit von CO 2.
- Fügen BCECF-AM (5 uM Endkonzentration) zu der Lösung in den letzten fünf Minuten und dann spülen Sie ihn mit NH 4 + Beladungslösung, die extrazelluläre Sonde zu entfernen.
- Montieren Sie die Zellen unter dem Mikroskop an, um mehrere Bilder auf eine stabile Basislinie aufzuzeichnen. Versorgen die Spüllösung (siehe oben). Dies führt zu einem Abfall der Fluoreszenz, die der Ansäuerung.
- Nach pH-Stabilisierung, durchströmen eine der unten angegebenen Lösungen für pH Rückgewinnungsraten von Li + / H +, Na + / H + oder K + / H + Austausch vermittelte messen. Jede Lösung enthält eine potentielle Kopplung Kation für H + Austausch getestet werden. Wenn eine dieser transportiert wird, wird dies in einer Zunahme der Fluoreszenz bei 495 nm, die entspr resultierenond zu einer Erhöhung des intrazellulären pH-Wert:
120 mM LiCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM HEPES bei pH 7,4,
120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM HEPES bei pH 7,4,
125 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM HEPES bei pH 7,4,
2.3) Messung der NHE Rückwärtsaktivitäts
ANMERKUNG: Das Prinzip dabei ist, die Transmembran-Ionengradienten invertieren.
- Vor der Messung laden die Zellen mit der intrazelluläre Kation von Interesse (siehe unten).
- Inkubieren Sie sie für 5 min mit BCECF / AM (siehe Schritt 2.2.2); spülen Sie sie, hängen Sie sie auf dem Videomikroskop.
- Versorgen die Beladungslösung an, um mehrere Bilder auf eine stabile Basislinie aufzuzeichnen.
- Nach der Grundlinienstabilisierung Bild die pH-Schwankungen, wenn die Zellen mit einer extrazellulären sauren Medium, das 120 m perfundiertM Cholinchlorid, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM MES bei pH 6,5.
- Für LiCl Lade inkubieren Zellen für 2 h in einer Lösung von 120 mM LiCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM HEPES bei pH 7,4 zusammengesetzt. Intrazellulärem Lithium durch Atomabsorptionsspektroskopie gemessen ergibt einen Wert von etwa 60 mM.
- Für Na + Lade inkubieren Zellen für zwei Stunden in einer Lösung aus 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM HEPES bei pH 7,4 zusammengesetzt ist, in Gegenwart von 1 mM Ouabain die Na / K-ATPase zu blockieren. Unter diesen Bedingungen ist die intrazelluläre Na + Konzentration im Bereich von 40 mM.
HINWEIS: K + Belasten nicht notwendig cytosolischen K + -Konzentration in einem Bereich von 140 mm und einen nach außen gerichteten K + -Gradienten ist daher leicht zu erreichen.
2.4) Datenreinigung und Kalibrierung:
HINWEIS: Dieser Schritt gilt sowohl für die Vorwärts- und Rückwärtsmessung.
- Am Ende jedes Experiments perfundieren Zellen mit einer Lösung von 140 mM KCl, 20 mM HEPES und 5 & mgr; M Nigericin auf pH-Werte zwischen 6,5 und 7,4 eingestellt.
- Sammeln Sie Daten, wie Fluoreszenzmessungen aus den Bildern (Graustufen, die Intensitätsstufen) und Export unter Text-Format und zu behandeln, wie unten mit einem Tabellenkalkulationsprogramm erläutert.
- Berechnen intrazellulären pH-Wert für jede einzelne Zelle oder eine Region von Interesse unter Verwendung der folgenden Gleichung:
pH = pKa + (Log (R-R min) / (R max -R)) x F min (λ2) / F max (λ2) - Durch Drücken der F min (λ2) / F ma x (λ2) -Verhältnis, wenn es Sonde Bleichen oder Leckage, was zu einer Abnahme der 450 nm-Fluoreszenz während der gesamten Experimente. Dies ist aber nur sehr selten in den in der des verwendeten Bedingungen beobachtetcribed Experimente.
- Da die Kalibrierungsdaten am Ende jedes der pH-Messung vorhanden sind, zu überprüfen, ob die entsprechenden berechneten Werte die pH-Werte für die Kalibrierung verwendet werden, unterscheiden. Wenn dies der Fall ist, stellen Sie dann alle experimentell bestimmten pH-Werte für die Kalibrierung mit dem folgenden Verfahren:
- Berechnen des folgenden Quotienten (Q, die Differenz zwischen der gemessenen Werte / Unterschied zwischen der Kalibrierungswerte). Multiplizieren Sie die gesamte Datenmenge von Q. Nehmen Sie die endgültige Einstellung durch Addition oder Subtraktion, so dass die berechneten Werte werden die entsprechenden Kalibrierungswerten entsprechen.
3. Messungen der Anfangsgeschwindigkeiten von NHE7 von Fast Li + Uptake
- Saatgutzellen auf Multi-Well-Platten (6 bis 24 Vertiefungen) und säuert sie entweder mit der oben oder abwechselnd die Nigericin / Rinderserumalbumin (BSA) in 20 beschrieben Ansäuerung beschrieben NH 4 + Beladungstechnik.
- Halten Sie kurz und konsistente Aufnahme Dauer (in der Regel 1 Minute oder weniger), um sicherzustellen, dass der Transport ist im Anfangsgeschwindigkeiten Bedingungen. Stellen Sie außerdem sicher, dass alle für die Aufnahme verwendeten Lösungen sind isotonisch.
- Am Ende der Aufnahmezeit, sorgfältig beseitigt die Aufnahmemedium und die Zellen werden viermal mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Führen Sie diese wäscht so schnell wie möglich (weniger als 10 Sekunden für die vier von ihnen ist ideal), um Lithium-Efflux verhindern.
- Lyse der Zellen in 25% ige Salpetersäure. Apply 250 ul pro Vertiefung von 25% Salpetersäure und lassen Sie es für mindestens 1 h sitzen, dann Schrott jede Vertiefung mit dem Ende der Pipettenspitze und überweisen Sie den ganzen gut Suspension in einem neuen microcentrifuge Rohr.
- Übertragen des Lysats in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, Zentrifugieren 5 Minuten lang bei 15.000 × g (Raumtemperatur), um die Zelltrümmer zu entfernen.
- Messung der Lithiumgehalt der Überstände durch Atomabsorptionsspektroskopie 21.
HINWEIS: Verschiedene Unternehmen bieten Atomabsorptionsspektrometer, das mit einer Lithium-Hohlkathodenlampe ausgestattet werden müssen. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, wie diese Maschinen sind sehr präzise, sondern auch sehr empfindlich.
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Representative Results
Auswahl:
Die H + tötet Auswahl basiert auf der Diffusion des Ammonium schwachen Base basiert, wie in 1A dargestellt. Die Wirkung von schwachen Basen und Säuren Diffusion auf intrazelluläre pH wurde von Walter Boron und Mitarbeiter 22 Pionierarbeit geleistet. Das elegante Idee, dieses Phänomen zu nutzen, um zu produzieren eine tödliche Versauerung für positive genetische Selektion wurde dann von Jacques Pouysségur 17 entwickelt. Unter solchen Protokolls, fällt der intrazellulären pH-Wertes auf etwa 5,5 nach dem Spülschritt. Zellen, die keine funktionelle NHE exprimieren, an der Plasmamembran kann einen neutralen pH-Wert nicht erholen und zeigen eine typische angesäuerten Aspekt mit einer flachen Form und einem granularen Cytosol (1B). Nach wiederholten Selektionszyklen (etwa zwei H + Tötungsverfahren / woche), Zellen, die diese Ansäuerung (1C) entstehen vollständig und dauerhaft zu überleben, mit einer Frequenz von etwa 10 -7.Dies wird bei der Bildung der einzelnen Zellklone, die entweder einzeln oder gebündelt, um dadurch zelluläre Populationen falls gewünscht erhalten werden kann, führen. Standardversuche, wie Zelloberflächen Biotinylierung oder RNA-Silencing kann durchgeführt, um zu kontrollieren, dass das Protein an der Plasmamembran exprimiert ist in der Tat ein intrazelluläres NHE wie NHE7 (siehe zum Beispiel 18 Milosavljević et al.) Werden. Ebenso sollten RT-PCR und anschließende Sequenzierung durchgeführt, um eventuelle Veränderungen in der Sequenz der intrazellulären NHEs im ausgewählten Zelllinie exprimiert überprüfen.
Funktionelle Charakterisierung:
Fluoreszenzvideomikroskopie:
Die Aktivität und die Ionenselektivität der intrazellulären NHEs an der Plasmamembran exprimiert wird, kann durch Messung der Veränderungen der intrazellulären pH durch diese NHEs unter verschiedenen Bedingungen induziert charakterisiert werden. Hierzu ist eine Videomikroskopie Satz mit Beleuchtung eine ausgestatteted Erfassungseinstellungen, ein Abbild eines ratiometrischen Sonde wie BCECF / AM wird in 2A schematisch dargestellt. 2B und 2C zeigen die typischen Veränderungen in der Fluoreszenzwerte direkt für Erregungen erhalten bei 490 und 450 nm, nach einer NH 4 + Laden Ansäuerung. 2D zeigt die pH-Kurve aus den Fluoreszenzwerte folgenden in 2.4 beschriebenen Behandlung) erhalten.
Lithium-Aufnahme:
Zusammen mit Wasserstoff und Natrium, Lithium umfasst einen Teil der ersten Spalte des Periodensystems, und es wurde gezeigt, um eine effiziente Kopplung Kation Na + / H + Austauscher sein. Es ist möglich, von dieser Information, um das Setup schnelle Kinetik der Lithiumaufnahme zu nehmen, um in Details der Funktionsparameter des Na + / H + Austauscher messen. Da dieses Kation fehlt Zytoplasma, die Ansammlung auf cytosolic Ansäuerung quantitativ spiegeln die Aktivität der Plasmamembran NHE. Darüber hinaus können nanomolaren bis Pikomolbereich von Lithium mit hoher Genauigkeit mittels Atomabsorptionsspektrometrie gemessen werden. Somit ist dieser Ansatz sehr mächtig, wenn bei der Auswahl der Plasmamembran exprimiert vesikulären Tauscher kombiniert, Fig. 3 veranschaulicht die in 3 beschriebenen Messprotokoll) der Protokolle Schnitt. Zellen, vorzugsweise an mehreren Lochplatten (6 bis 24) ausgesät werden angesäuert, wie zuvor beschrieben. Die kinetische beginnt mit der Inkubation der Zellen in Medium, enthaltend Lithium, und die anderen Kationen oder Inhibitoren von Interesse (3A).
Um die Aufnahme zu stoppen, Zellen werden dann in vier schnelle Spülungen in eiskaltem PBS vorgelegt. Betriebs rasch entfernt jegliche extrazellulärem Lithium gleichzeitig sicherzustellen, dass kein signifikanter Lithium Efflux auftritt (3B). Lithium-Konzentration in jede Vertiefung ist danngemessen mit Atomabsorptionsspektroskopie (3C) und Anfangsgeschwindigkeiten von Lithium-Aufnahme, die führen direkt zu der Aktivität des Tauscher im Gleichgewichtszustand als Steigung Messungen der Lithium Akkumulationszeit natürlich (3D) erhalten.
Wie für Enzymkinetik können Dosis-Antwort von Anfangsgeschwindigkeiten verwendet, um Km Werte für Substrate (4A) der Ki-Werte für Inhibitoren abzuleiten. Ein interessantes Merkmal der Transporter ist, dass unterschiedliche Kopplungs Kationen wird für den Transport zu konkurrieren. Dies ergibt die Möglichkeit der Messung der Km für Natrium durch Konkurrenz mit der Lithiumaufnahme (4B).
Abbildung 1: Selektion von Zellen, die eine intrazelluläre Na + / H + </ Strong> Tauscher an ihrer Plasmamembran. (A) Strategie für die drei Schritte H + tötet Selektion von Zellen, die eine funktionelle nicht-mutierten und nicht-markierten intrazellulärem NHE an der Plasmamembran. (B) Phasenkontrastmikroskopie Bild PS120 Elternzellen bis zu einer Säurebelastung vorgelegt. Maßstabsbalken: 25 & mgr; m (C) Phasenkontrastmikroskop-Aufnahme von PS120 Zellen für die Expression eines vesikulären Tauscher an der Plasmamembran, ausgewählt nach einer Säurebelastung. Maßstab: 25 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2: Die intrazellulären pH-Messungen (A) Prinzip der pH-Messung Videomikroskopie.. (SEIEN SIEvolution der emittierten Fluoreszenz (595 nm) der BCECF-pH-Sonde nach einer Anregung bei 490 nm. L: Säurebelastung, Ri; Spülen, Re: Rückgewinnung, Cal6.5: Kalibrierung bei einem intrazellulären pH-Wert von 6,5, Cal7.0: Kalibrierung an einem intrazellulären pH-Wert von 7,0 (C) Evolution der emittierten Fluoreszenz (595 nm) der BCECF-pH-Sonde nach einer Anregung bei 450 nm. L: Säurebelastung, Ri; Spülen, Re: Rückgewinnung, Cal6.5: Kalibrierung bei einem intrazellulären pH-Wert von 6,5, Cal7.0: Kalibrierung an einem intrazellulären pH-Wert von 7,0 (D) Entwicklung des intrazellulären pH-Wert von den 490/450 nm Fluoreszenzverhältnisse des BCECF pH berechnet Sonde und von den Kalibrierungspunkten. L: Säurebelastung, Ri; Spülen, Re: Rückgewinnung, Cal6.5: Kalibrierung bei einem intrazellulären pH-Wert von 6,5, Cal7.0: Kalibrierung an einem intrazellulären pH-Wert von 7,0 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abb. 3: NHE-Aktivität von Anfangsgeschwindigkeiten von Li + Aufnahme gemessen (A - C) Schema der Darstellung der verschiedenen kritischen Schritte der Messtechnik (D) Beispiel eines gemessenen Zeitverlauf der Lithiumaufnahme für die vesikuläre NHE7 Tauscher ausgedrückt an der Plasma Membran. Beachten Sie die Linearität der kinetischen innerhalb der experimentellen Bedingungen gewährleisten Anfangsgeschwindigkeiten Messung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Figur 4: typische Dosis-Wirkungs-Kurven für NHE7 (Originaldaten aus 18).Anfangsgeschwindigkeiten von Lithium-Aufnahme wurden gemessen unter Verwendung von 1-Minuten-Kinetik. (A) Die Dosis-Wirkungs-Kurve für die extrazelluläre Lithium. (B) Wettbewerb von verschiedenen Konzentrationen von extrazellulärem Natrium auf 1 mM extrazellulären Lithiumaufnahme. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt, wie Zellen, die intrazelluläre Na + / H + Austauscher an der Plasmamembran, ohne dass ihre Primärsequenz durch ortsgerichtete Mutagenese ausgewählt. Diese Austauscher kann nun charakterisiert werden.
Dieses Verfahren basiert auf der zellulären Toxizität von intrazellulärem Protonen basierend auf Zelllinien, die vesikulären Na + / H + Austauscher an der Plasmamembran exprimieren wählt. Es könnte möglich sein, im Prinzip für andere Kationen, die im Verdacht kann gewährleistet werden kann, wie beispielsweise Li +, K + oder Cs + verwenden. Dies erhöht jedoch ein zusätzliches Maß an Unsicherheit. Wenn die Auswahl keinerlei positiven Klon nicht zu erhalten, wird es dann schwierig sein, zu beurteilen, ob die geprüfte Kation nicht transportiert wird oder der Wärmetauscher ist nicht an der Plasmamembran. Aus diesen Gründen wurden Selektionen wurden unter Verwendung von Na + als Kupplungskation als dies der extrazellulären substraß in höchster Fülle in physiologischen Bedingungen gefunden. Dies führte zu der Auswahl an Varianten auszudrücken NHE7 18 sowie NHE6 und NHE9 an die Plasmamembran (Dichter und Counillon, unveröffentlichte Ergebnisse).
Diese Plasmamembranexpression ermöglicht die Messung der Transporter funktionellen Parameter durch Verfahren, die bisher nur für Plasmamembrantransporter verwendet werden könnten. Natürlich ist es nicht möglich, auszuschließen, dass eine solche Veränderung der Membranumgebung können die Funktionsmerkmale der vesikulären NHEs beeinflussen. Allerdings könnte diese Strategie lohnt sich der Einsatz von mindestens drei Gründe haben: (i) die intrazelluläre Expression von NHE6, 7 und 9 schließt jede detaillierte Funktionsmessung, (ii) Membranumgebungen und Protein oder Lipid-Partner haben vor allem gezeigt, dass sie Einfluss auf subtile Regulations Mechanismen der anderen NHEs und nicht ihre ganz grundlegenden Merkmale dieser Transporter (Affinitäten zur Kopplung Kationen, Selektivität, Direktionalität, pharmacological Funktionen). So ist es sehr wahrscheinlich, dass diese werden unverändert über die Membranexpression der vesikulären NHEs bleiben. (Iii) Die Kenntnis der Wirkungsmechanismen und pharmakologische Profile eines Plasmamembran exprimiert vesikulären Mechanismus ist es dann möglich zu machen vesikulären pH-Messungen, um diese mögliche Diskrepanzen zwischen der Plasmamembran und vesikuläre Expression adressieren.
Ein weiterer potenzieller Nachteil dieser Technik ist, dass die hier beschriebene Strategie kann zu der Auswahl von Zellen führen exprimieren andere H + Extrudieren Mechanismus als die transfizierten vesikulären Na + / H + Austauscher (wie eine Plasmamembran NHE oder einer H + ATPase beispiels ). Obwohl nie im Labor festgestellt, ist es daher von entscheidender Bedeutung, um klassische Zelloberflächenmarkierung gekoppelt Silencing tatsächlich prüfen, ob der NHE von Interesse ist in der Tat an der Plasmamembran exprimiert verwenden und vermittelt die Na + oder Li + 18 Milosavljevic et al.).
Um die Aktivität dieser Transporter charakterisieren zwei Protokolle, die jeweils auf die intrazelluläre pH-Veränderungen und Ionenflüssen basiert, beschrieben. Das erste Verfahren erfordert die Verwendung von pH-sensitiven Fluoreszenzsonden und eine ausreichende Fluoreszenz-Videomikroskopiesystem. Diese Methode, die durch viele Gruppen auf dem Gebiet verwendet wird, wurde in den 1980er Jahren entwickelt worden ist, zunächst mit Fluorimeter auf Signale bilden Zellen in Suspension 23 zu messen, dann unter Verwendung von digitalen Erfassung, einzelne Zellen durch die Kopplung mit Fluoreszenzanregung und Akquisition Videomikroskopie 24 messen. Die letztere Technik ist nun sehr schnell und einfach zu werden, wegen der hohen Leistungsfähigkeit von Kameras, Beleuchtung und Computersystemen. Interessant ist, dass Unternehmen bieten in der Regel sehr informative Datenblätter mit ihren fluoreszierenden Sonden. Diese pH-Schwankungen liefern wichtige Informationendie Art der extrazellulären Kationen gekoppelt mit Protonen Efflux bestimmen. In dieser Hinsicht ist es wichtig zu bemerken, dass die Dauer des Ammonium Vorinkubation muss je nach den für die Messungen verwendeten Zellen sorgfältig eingestellt werden. CCL39-Fibroblasten, unterstützt sehr gut eine Stunde Beladung mit 50 mM NH 4 Cl. Dies führt zu einer sehr starken Versauerung, die NHE volle Aktivierung ermöglicht und erzeugt ein starkes Signal für die Messung (Vmax Bedingungen). Aber auch andere Zellen wie Herzmuskelzellen oder primären Nierenzellen nicht unterstützt, so wäre der Ammoniumbelastung. Es lohnt sich, die Durchführung mehrerer Vorversuche mit unterschiedlichen Inkubationszeiten oder NH 4 Cl-Konzentrationen. Der Grund für diese Unterschiede in der Empfindlichkeit gegen NH 4 Cl sind nicht klar. Sie können auf die mögliche Expression des Ammoniumtransportsysteme 25,26 stehen. Ähnlich den natriumfreien Lösung, die zum Spülen der Beladungslösung verwendet wird, kann nicht toleriertvon Zellen, wie beispielsweise Herzmuskelzellen. Obwohl Anfangsgeschwindigkeiten weniger genau bestimmt werden kann, ist es notwendig, direkt mit dem Recovery-Lösung nach der Ammoniumbelastung durchströmen.
Zusätzlich intrazellulären pH-Messungen stellen auch eine einfache Möglichkeit, um die reversible Eigenschaften dieser Tauscher als Rückwärtsmodus zu untersuchen wird gesäuert, die leicht von einer Abnahme der BCECF-Fluoreszenz Pegel, der pH-Werte nach dem Kalibrieren ausgedrückt werden kann detektiert werden produzieren . Die Begrenzungen dieser Versuche ist der Mangel an einer genauen Quantifizierung des Verkehrs, wie die Experimente Maßnahme pH-Schwankungen, die auf einer logarithmischen Skala zu betreiben und werden durch intrazelluläre Pufferkapazität begrenzt. Letzteres kann gemessen und pH-Schwankungen durch die Pufferkapazität Ausbeute Ionenflüsse multipliziert. Doch dieser Prozess kombiniert mehrere Versuchsfehler (auf pH-Messungen, die Pufferkapazität der Mess-und Kalibriertion) und ist daher nicht sehr quantitativ. Daher, um die enzymatische Konstanten der Plasmamembran exprimiert zugreifen Transporter sind schnelle Ionenfluß Techniken wesentlich einfacher und genauer.
Aufgrund intrazellulären Inhalt im millimolaren Bereich, Erkennen NHE-vermittelte Veränderungen in zytosolischen Natrium ist nicht möglich. Von nun an, seit Jahren solche Aufnahme Techniken wurden für die Verwendung von Radioisotopen, wie 22 Na + basiert. Diese Handschrift beschreibt eine nicht-radioaktive Verfahren, für die 22 Na + durch Lithium, basierend auf dem Grundprinzip, dass dieses Kation, das auch durch NHEs verwendet wird, fehlt Zellcytosol und mit großer Genauigkeit mittels Atomabsorptionsspektrometrie 21 gemessen werden. Sobald die geeigneten Bedingungen (Zeit und Lithiumkonzentration), um lineare Aufnahmen zu messen (dh., Da in Anfangsgeschwindigkeiten Bedingungen) ermittelt werden, Affinitäten für die anderen möglichen Kopplung Kationen und / oderInhibitoren genau gemessen wie in den 3 und 4 gezeigt werden. Eine letzte mögliche Einschränkung ist, dass die Lithium-Aufnahme-Methode kann natürlich nur funktionieren, wenn der Wärmetauscher von Interesse dieses Kation erheblich transportiert. Wenn es nicht der Fall ist, wird der Versuchsleiter haben, die entweder in den oben genannten intrazellulären pH-Messungen zu stützen oder müssen radioaktive Natriumaufnahme verwenden.
Ein solcher Satz von Experimenten führte kürzlich auf der Beobachtung, dass die NHE7 intrazellulären Na + / H + -Exchanger, die zunächst angenommen wurde, dass eine H + / K + Transporter die Vesikel alkalisieren würde tatsächlich zu einer endosomalen Ansäuerung Mechanismus Natrium gekoppelt sein führten 18. Das hat tiefe Auswirkungen auf die intrazellulären Kompartimenten wie bisher diese Rolle wurde gedacht, um den VH + ATPasen gewidmet. Da jedes Mitglied der Familie NHE scheint eine sehr spezifische kinetische Unterschrift o AnzeigeFlügel, seine physiologische Rolle, ist es verlockend, die Hypothese auf, dass die Charakterisierung von NHE6 und NHE9 mit den in diesem Artikel beschriebenen Methoden werden neue und unerwartete Eigenschaften, die ihre physiologischen Funktionen Highlight wird offenbaren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard cell culture equipement | Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers | ||
| Incubator with CO2 | Sanyo | MCO15A | |
| Incubator without CO2 | Heraeus instrument | BB6220 | |
| Laminar flow hood PSM1200NF | Fisher | 52010120 | |
| DMEM medium | sigma | D5796 | |
| FBS gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Penicilin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| Trypsin 10x | PAA | L11-003 | |
| Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system | Thermo Scientific | ICE 3500 GFZ | |
| LiCl | sigma | L4408 | |
| Nitric Acid | sigma | 438073 | |
| Fluorescence videomicroscopy set | Leica | Composed of many devices with different catalog numbers | |
| Inverted automated microscope | Leica | DMI6000B | |
| microscope stand | leica | 11888906 | |
| 11888911 | |||
| 11505180 | |||
| 11888377 | |||
| incident fluorescence | leica | 11888901 | |
| 11504166 | |||
| motor bracket | leica | 11888379 | |
| 11505234 | |||
| 11521505 | |||
| 11522106 | |||
| LED transmission light | leica | 8097321 | |
| 8102034 | |||
| 11521580 | |||
| motorized plate | leica | 11522068 | |
| 11531172 | |||
| 11521734 | |||
| 11521719 | |||
| 11888423 | |||
| 11888424 | |||
| camera output | leica | 11888373 | |
| 11507807 | |||
| 11888393 | |||
| 11888259 | |||
| 11888258 | |||
| 11541510 | |||
| images acquisition/analysis software | leica | 11888375 | |
| optics | leica | 11506507 | |
| 11506243 | |||
| 11506203 | |||
| fluorescence Xenon lamp | leica | DMI6000 | |
| camera | hamamatsu | 8100601 | |
| metafluor/Mmfluor software | 11640905 | ||
| pH sensitive probe, BCECF-AM | life technologies | B1170 | |
| Nigericin | Sigma | N7143 |
References
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Jentsch, T. J. Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CLC chloride transporters. J Physiol. 578 (3), 633-640 (2007).
- Kornak, U., et al. Mutations in the a3 subunit of the vacuolar H(+)-ATPase cause infantile malignant osteopetrosis. Hum Mol Genet. 9 (13), 2059-2063 (2000).
- Gunther, W., Piwon, N., Jentsch, T. J. The ClC-5 chloride channel knock-out mouse - an animal model for Dent's disease. Pflugers Arch. 445 (4), 456-462 (2003).
- Kasper, D., et al. Loss of the chloride channel ClC-7 leads to lysosomal storage disease and neurodegeneration. Embo J. 24 (5), 1079-1091 (2005).
- Poet, M., et al. Lysosomal storage disease upon disruption of the neuronal chloride transport protein ClC-6. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13854-13859 (2006).
- Nakamura, N., Tanaka, S., Teko, Y., Mitsui, K., Kanazawa, H. Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation. J Biol Chem. 280 (2), 1561-1572 (2005).
- Gilfillan, G. D., et al. SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome. Am J Hum Genet. 82 (4), 1003-1010 (2008).
- Mignot, C., et al. Novel mutation in SLC9A6 gene in a patient with Christianson syndrome and retinitis pigmentosum. Brain & Development. 35 (2), 172-176 (2013).
- Morrow, E. M., et al. Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry. Science. 321 (5886), 218-223 (2008).
- Lasky-Su, J., et al. Genome-wide association scan of the time to onset of attention deficit hyperactivity disorder. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 147B (8), 1355-1358 (2008).
- Franke, B., Neale, B. M., Faraone, S. V. Genome-wide association studies in ADHD. Hum Genet. 126 (1), 13-50 (2009).
- Meda, S. A., et al. A large scale multivariate parallel ICA method reveals novel imaging-genetic relationships for Alzheimer's disease in the ADNI cohort. Neuroimage. 60 (3), 1608-1621 (2012).
- Zhang, L., et al. A microdeletion in Xp11.3 accounts for co-segregation of retinitis pigmentosa and mental retardation in a large kindred. Am J Med Genet A. 140 (4), 349-357 (2006).
- Sardet, C., Franchi, A., Pouysségur, J. Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiporter. Cell. 56 (2), 271-280 (1989).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Franchi, A., Cragoe, E., Pouysségur, J. Isolation and properties of fibroblast mutants overexpressing an altered Na+/H+ antiporter. J Biol Chem. 261 (31), 14614-14620 (1986).
- Milosavljevic, N., et al. The Intracellular Na+/H+ Exchanger NHE7 effects a Na+ coupled, but not K+ coupled proton-loading mechanism in endocytosis. Cell Reports. 7 (3), 1-8 (2014).
- Wigler, M., et al. Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes. Cell. 16 (4), 777-785 (1979).
- Lacroix, J., Poët, M., Maherel, C., Counillon, L. A mechanism for the activation of the Na/H exchanger NHE-1 by cytoplasmic acidification and mitogens. EMBO Reports. 5 (1), 91-96 (2004).
- Milosavljevic, N., et al. Nongenomic Effects of Cisplatin: Acute Inhibition of Mechanosensitive Transporters and Channels without Actin Remodeling. Cancer Res. 70 (19), 7514-7522 (2010).
- Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).
- Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Na+-H+ exchange in gastric glands as measured with a cytoplasmic-trapped, fluorescent pH indicator. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (23), 7436-7440 (1984).
- Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Digital image processing of intracellular pH in gastric oxyntic and chief cells. Nature. 325, 447-450 (1987).
- Quentin, F., et al. RhBG and RhCG, the putative ammonia transporters, are expressed in the same cells in the distal nephron. J Am Soc Nephrol. 14 (3), 545-554 (2003).
- Geyer, R. R., Musa-Aziz, R., Enkavi, G., Mahinthichaichan, P., Tajkhorshid, E., Boron, W. F. Movement of NH3 through the human urea transporter B: a new gas channel. Am J Physiol Renal Physiol. 304 (12), F1447-F1457 (2013).
