Abstract
Acidificazione endosomali è critica per una vasta gamma di processi, quali il riciclaggio proteica e la degradazione, desensibilizzazione del recettore, e neurotrasmettitore caricamento in vescicole sinaptiche. Questo acidificazione è descritto per essere mediato da ATPasi protonica, insieme ai trasportatori di cloruro CLC. Altamente conservata protoni elettricamente trasportatori, la Na + / H + scambiatori (NHE) 6, 7 e 9 sono espresse anche in questi comparti. Le mutazioni nei loro geni sono stati collegati con le malattie cognitive e neurodegenerative umane. Paradossalmente, i loro ruoli rimangono elusivi, come la loro localizzazione intracellulare ha impedito dettagliata caratterizzazione funzionale. Questo manoscritto mostra un metodo per risolvere questo problema. Questo consiste nella selezione di linee cellulari mutanti, capaci di sopravvivere acidificazione citosolica acuta mantenendo NHEs intracellulari alla membrana plasmatica. Quindi raffigura due protocolli complementari per misurare la selettività e attività ionicadi questi scambiatori: (i) una basata su misurazioni di pH intracellulare mediante videomicroscopia a fluorescenza, e (ii) uno basato sulla cinetica veloci di litio assorbimento. Tali protocolli possono essere estrapolati per misurare altri trasportatori non elettrogeniche. Inoltre, la procedura di selezione qui presentata genera cellule con fenotipo ritenzione intracellulare difettoso. Pertanto queste cellule esprimono anche altre proteine di membrana vescicolare a livello della membrana plasmatica. La strategia sperimentale descritta qui può quindi costituire uno strumento potenzialmente efficace per studiare altre proteine intracellulari che saranno poi espressi a livello della membrana plasmatica insieme con la vescicolare Na + / H + scambiatori usati per la selezione.
Introduction
La maggior parte dei compartimenti intracellulari mostrano un pH luminale acido, che è un parametro fondamentale per la maturazione, il traffico, il riciclaggio di proteine o ormoni e neurotrasmettitori loading. E 'stato dimostrato che il gradiente di pH tra contenuto citosol e vescicolare è generato da vacuolar H + ATPasi 1, accoppiato ad vescicolari trasportatori cloruro ClC 2. Sia in knock-out (KO) topi e pazienti umani, l'importanza di questi trasportatori è stata evidenziata dai fenotipi pesanti causate da mutazioni nei loro geni 3-6.
I membri della famiglia SLC9A scambiatori sodio-idrogeno, anche chiamati NHEs per Na + / H + scambiatori, hanno dimostrato di essere effettori chiave pH intracellulare e regolazione del volume cellulare, così come nel trasporto vettoriale di equivalenti acido-base di tutti gli epiteli . Oltre alle NHEs membrana plasmatica, tre altamente conservati Na + / H + scambiatori, NHE 6, 7e 9 sono espressi in rete trans-Golgi e in endosomi precoci 7. Le mutazioni nei loro geni sono stati associati con l'autismo basato sulla famiglia 10 e Attention Deficit Hyperactivity Disorder Angelman-like o Christianson Sindromi 8-9 11-12. Questi scambiatori sono stati coinvolti in problemi neurodegenerative quali la malattia di Alzheimer suscettibilità 13 e collegata a X ritardo mentale geni contigui SINDROMI 14. Presi insieme, questi studi sottolineano l'importanza di questi NHEs intracellulari di sviluppo e / o la funzione del cervello.
La localizzazione intracellulare di questi scambiatori impedisce misurazioni accurate delle loro selettività ionica, direzione di trasporto, i parametri cinetici e regolazione. Come è il caso per tutti i trasportatori espressi in compartimenti intracellulari, è estremamente difficile valutare le loro attività biochimiche e quindi di comprendere appieno i loro ruoli fisiologici e meccanismi sottostanti le loro implicazioni patologiche. Sulla base della concentrazione citosolica K +, l'ipotesi più comunemente accettata era che stavano lavorando come K + accoppiati protoni trasportatori di efflusso. L'esistenza di tale perdita protonica era stato ipotizzato, come può controbilanciare protonica pompaggio dalle V-ATPasi al fine di mantenere uno stato stazionario vescicolare pH. Lo scopo di questo articolo visiva è (i) un metodo per dimostrare che permette la selezione genetica di linee cellulari che esprimono tali trasportatori vescicolari al loro membrana plasmatica, e (ii) mostrano due approcci indipendenti per misurare le funzioni di questi trasportatori.
Tre decenni fa, Pouysségur e Franchi hanno sperimentato un approccio genetico che ha permesso la clonazione molecolare e la caratterizzazione dei membri della famiglia NHE 15. Questa era basata sulla tossicità di protoni intracellulari come metodo di screening. Il primo passo è stato quello di ottenere linee di cellule deficientiin qualsiasi / H scambio Na + + espresso a livello della membrana plasmatica, utilizzando la reversibilità di questo trasportatore. I fibroblasti (linea cellulare CCL39) sono stati precaricati con Na + o Li + e poi poste in un mezzo extracellulare acido (pH 6,5) per 2 ore. Ciò ha portato alla morte di cellule esprimenti un funzionale Na + / H + scambio e la selezione di celle antiporter-deficienti (linea cellulare PS120) 16. Quando coltivate in terreno privo di bicarbonato, queste cellule sono molto sensibili all'acidificazione intracellulare acuta. Di conseguenza, l'espressione di un meccanismo di protoni efflusso funzionale a livello della membrana plasmatica sarà selezionato positivamente (vedi 17) se tali cellule sono sottoposte a acidificazioni intracellulari acute. Tali tecniche acidificazione possono essere utilizzati per isolare linee cellulari con traffico difetti che consentono l'espressione forzata di NHEs intracellulari WT a livello della membrana plasmatica.
Come eucarioti Na + / H+ Scambiatori sono elettricamente neutro, non sono misurabili dagli approcci elettrofisiologici che sono stati utilizzati con successo per misurare canali. Questo manoscritto dimostra quindi come misurare l'attività di questo scambiatore per misure di pH intracellulari e rapidi cinetica di assorbimento di litio. Poiché i concetti di base sono gli stessi, è interessante notare che molti dei processi sviluppati per la sezione di selezione vengono anche utilizzate direttamente per misurazioni funzionali.
È interessante notare, abbiamo osservato che il difetto traffico presente nelle linee cellulari selezionate utilizzando l'approccio descritto in questo manoscritto porta ad una maggiore espressione di altre proteine vescicolari alla membrana plasmatica, come il canale del potassio vescicolare TWIK1 18. Questo indica verso la selezione di un meccanismo di ritenzione difetto generale per proteine transmembrana vescicolari. Quindi questa procedura di selezione e le cellule che genera maggiocostituiscono uno strumento promettente per la comunità scientifica lavorare sulle proteine di membrana di compartimenti intracellulari. Come pure le tecniche di misurazione qui presentate potrebbero essere applicabili per studiare altri trasportatori non elettrogeniche.
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Protocol
1. H + Uccidere Selezione
- Linee cellulari
- Stabilmente trasfettare cellule NHE-deficienti (ad esempio, il PS120 linea cellulare CCL39-derivato 16) utilizzando qualsiasi combinazione di mammiferi vettore di espressione e di metodo di trasfezione che produrrà rendimenti trasfezione efficienti e selezione in una linea cellulare di fibroblasti.
NOTA: Per molti anni fosfato di calcio precipitazioni 19 è stato utilizzato con buoni rendimenti trasfezione. Questo è stato sostituito più recentemente da reagenti commerciali come Lipofectamine2000, le trasfezioni essere eseguiti seguendo le istruzioni del produttore.
- Stabilmente trasfettare cellule NHE-deficienti (ad esempio, il PS120 linea cellulare CCL39-derivato 16) utilizzando qualsiasi combinazione di mammiferi vettore di espressione e di metodo di trasfezione che produrrà rendimenti trasfezione efficienti e selezione in una linea cellulare di fibroblasti.
- Soluzioni
- Preparare tre soluzioni sterili descritti di seguito. Sterilizzare queste soluzioni per filtrazione (0,22 micron).
- Preparare una soluzione di NH 4 + Loading (pH 7,4) comprendente 50 mM NH 4 Cl, 70 mM di cloruro di colina, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, GL 5 mMucose e 15 MOPS mm a pH 7.4.
- Preparare una soluzione di risciacquo (pH 7,0) composto da 120 mM di cloruro di colina, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, glucosio 5 mM e 15 mM HEPES a pH 7,0.
- Preparare una soluzione di ripristino (pH 7,4) compreso di 120 mM NaCl, KCl 5 mM, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM di glucosio e 15 mM HEPES a pH 7,4.
- Preparare tre soluzioni sterili descritti di seguito. Sterilizzare queste soluzioni per filtrazione (0,22 micron).
- Prima di iniziare la selezione, ottenere un incubatore di coltura cellulare che può essere utilizzato a 37 ° C senza ulteriore CO 2 dal serbatoio esterno (chiamato CO 2 - incubatore "libero"), il 5% di CO 2 si tradurrà in buffer che possono compromettere la acidificazione. Amplifica la linea cellulare che esprime la NHE di interesse fino a circa 2 x 10 8 cellule (in genere circa 20 confluenti 100 piastre mm).
- H + uccidendo procedura:
- Incubare le cellule che esprimono la intracellulare NHE di interesse per 1 ora in soluzione di caricamento, a 37 ° C in CO 2 incubatore -free.
- Aspirare la soluzione di carico e quindi risciacquare due volte nella soluzione descritta sopra risciacquo. Eseguire questo passaggio efficiente per eliminare il residuo extracellulare NH 4 Cl che compromettano la creazione di una ripida NH 4 + gradiente che genererà l'acidificazione.
- Eliminare il mezzo risciacquo mediante aspirazione e incubare le cellule per un'ora in soluzione di recupero di nuovo a 37 ° C in incubatore CO 2 libera.
- Sostituire il mezzo di recupero con terreno di coltura regolare (tipicamente DMEM con 7,5% FCS) e far crescere le cellule in condizioni di coltura standard (37 ° C in atmosfera umidificata al 5% di CO 2 e il 95% di aria).
- Ripetere questo ciclo di selezione due volte a settimana fino cloni stabili emergono.
NOTA: Prestare particolare attenzione per quanto riguarda la coltura cellulare e condizioni di selezione. Mesi di lavoro può essere rovinato da qualsiasi contaminazione che è più incline a oCCur dopo un lungo periodo di cultura e di manipolazioni cellulari ripetuti.- Qui, scegliere se amplificare i cloni e caratterizzare singolarmente come descritto nelle sezioni 2-3, o in piscina insieme per generare una popolazione cellulare prima di caratterizzazione.
- Applicare selezione occasionali (circa una volta ogni due settimane) per trattenere le cellule acidificazione resistente by-counter selezionando quelle che possono riversati fenotipo di acido sensibile parentale (Figura 1B).
2. intracellulare pH Misurazioni
2.1) fluorescenza pH Imaging
- Utilizzare il raziometrico pH sensibile colorante fluorescente BCECF / AM, che è sensibile al pH quando eccitato a 490 nm e 445 nm possiede un punto isosbestic, seguendo i protocolli del produttore.
- In alternativa, utilizzare altre sonde pH-sensibili, seguendo i protocolli del produttore.
- Utilizzare un set con immaginiCONSISTONO di un microscopio invertito accoppiato ad una videocamera ad alta sensibilità. Dotare questo set con 450 nm e 490 nm filtri interferenza a banda stretta in coppia con quarzo opportuni filtri densità neutra per l'eccitazione.
- Se possibile, utilizzare l'insieme appropriato di filtri e delle condizioni di illuminazione a fluorescenza di impostazione valori confrontabili per λ1 e λ2 in modo che il rapporto si avvicina a 1. Evitare anche valori di fluorescenza basali impostati o saturare o troppo bassa, sia per λ1 e / o λ2. Questo può cedere manufatti importanti come allora il rapporto non può essere rilevabile anche se il pH intracellulare sta cambiando.
NOTA: Il sistema deve consentire di perfusione rapida, time-lapse eccitazione a due lunghezze d'onda di cui sopra e di acquisizione alla lunghezza d'onda di emissione corretta (535 nm per BCECF). Dotare il sistema con software che consente l'acquisizione automatica dei dati e di stoccaggio.
- Se possibile, utilizzare l'insieme appropriato di filtri e delle condizioni di illuminazione a fluorescenza di impostazione valori confrontabili per λ1 e λ2 in modo che il rapporto si avvicina a 1. Evitare anche valori di fluorescenza basali impostati o saturare o troppo bassa, sia per λ1 e / o λ2. Questo può cedere manufatti importanti come allora il rapporto non può essere rilevabile anche se il pH intracellulare sta cambiando.
2.2) Misura della NHE Forward Activity (Estrusione diI protoni dal citoplasma)
- Acidificare cellule da una incubazione di 1 ora in soluzione di NH 4 + Loading (vedere il punto 1.4) in assenza di CO 2.
- Aggiungere BCECF-AM (concentrazione finale 5 mM) alla soluzione per gli ultimi cinque minuti e quindi risciacquare con NH 4 + soluzione tampone per eliminare la sonda extracellulare.
- Montare le celle del microscopio e prendere più immagini per registrare una linea di base stabile. Profumato soluzione di risciacquo (vedi sopra). Ciò si traduce in una diminuzione della fluorescenza corrispondente al acidificazione.
- Dopo la stabilizzazione del pH, profumato una delle soluzioni indicate qui di seguito per misurare i tassi di recupero pH mediati da Li + / H +, Na + / H + o K + / H + scambio. Ogni soluzione contiene un potenziale cationico accoppiamento da testare per H + scambio. Se uno di questi è trasportata, questo si tradurrà in un aumento della fluorescenza a 495 nm che correspond ad un aumento del pH intracellulare:
, Glucosio LiCl 120 mM, KCl 5 mM, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2 5 mM e 15 mM HEPES a pH 7.4
, Glucosio 120 mM NaCl, KCl 5 mM, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2 5 mM e 15 mM HEPES a pH 7.4
, Glucosio 125 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2 5 mM e 15 mM HEPES a pH 7.4
2.3) Misura della NHE Activity Reverse
NOTA: Il principio è quello di invertire i gradienti ionici transmembrana.
- Prima della misura, caricare le cellule con il catione intracellulare di interesse (vedi sotto).
- Incubare per 5 minuti con BCECF / AM (vedi punto 2.2.2); sciacquarle, montarli sul microscopio video.
- Profumato la soluzione di carico e prendere più immagini per registrare una linea di base stabile.
- Dopo la stabilizzazione della linea di base, immagine le variazioni di pH quando le cellule vengono perfusi con soluzione acida extracellulare contenente 120 mM cloruro di colina, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, il glucosio 5 mm e 15 mm a MES pH 6.5.
- Per LiCl carico, incubare le cellule per 2 ore in una soluzione composta di 120 mM LiCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM di glucosio e 15 mM HEPES a pH 7,4. Litio intracellulare misurata mediante spettroscopia ad assorbimento atomico produce un valore di circa 60 mM.
- Per Na + carico, incubare le cellule, per due ore in una soluzione composta di 120 mM NaCl, KCl 5 mM, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM di glucosio e 15 mM HEPES a pH 7,4 in presenza di 1 mM ouabain per bloccare la Na / K ATPasi. In queste condizioni, la concentrazione intracellulare Na + è nella gamma di 40 mM.
NOTA: K + caricamento non è necessaria in quanto K + citosolico concentrazione nell'intervallo 140 mM e un gradiente K + verso l'esterno diretto è quindi facile da realizzare.
2.4) Il trattamento dei dati e calibrazione:
NOTA: Questo passaggio si applica sia alle misure avanti e retromarcia.
- Al termine di ogni esperimento, profumato cellule con una soluzione di 140 mM KCl, 20 mM HEPES e 5 mM nigericin regolata a valori di pH tra 6,5 e 7,4.
- Raccogliere dati come misure di fluorescenza dalle immagini (livelli di grigio che rappresentano i livelli di intensità) e l'esportazione in formato testo e trattare come spiegato di seguito con un programma di foglio di calcolo.
- Calcolare i valori di pH intracellulare per ogni singola cella o regione di interesse utilizzando la seguente equazione:
pH = pKa + (Log (R-Rmin) / (R max -R)) x F min (λ2) / F max (λ2) - Utilizzare l'min F (λ2) / F ma x (λ2) rapporto se c'è sonda sbianca o perdite, con conseguente diminuzione della fluorescenza a 450 nm durante gli esperimenti. Questo è comunque molto raramente osservata nelle condizioni utilizzate nel desEsperimenti Cribed.
- Poiché sono presenti alla fine di ogni misurazione pH i dati di calibrazione, verificare se i corrispondenti valori calcolati differiscono dai valori di pH utilizzati per la calibrazione. Se è il caso, quindi regolare tutti i valori di pH sperimentalmente determinato alla calibrazione utilizzando la seguente procedura:
- Calcolare il seguente quoziente (Q, la differenza tra il valore misurato / differenza tra i valori di calibrazione). Moltiplicare l'intero set di dati da Q. Effettuare la regolazione finale per addizione o sottrazione in modo che i valori calcolati saranno pari ai valori di taratura corrispondenti.
3. Misurazioni di iniziali Tassi di NHE7 di veloce Li + assorbimento
- Cellule seme su lastre multiple e (da 6 a 24 pozzetti) e acidificare loro utilizzando la tecnica di NH 4 + carico descritto sopra o alternativamente la Nigericina / albumina di siero bovino (BSA) acidificazione descritto in 20.
- Mantenere brevi e coerenti durata di assorbimento (in genere un minuto o anche oltre) per garantire che il trasporto opera in tassi di condizioni iniziali. Assicurarsi inoltre che tutte le soluzioni utilizzate per l'assorbimento è isotonico.
- Alla fine del tempo di assorbimento, eliminare accuratamente il mezzo assorbimento e lavare le cellule quattro volte con soluzione salina fosfato ghiacciato tamponata (PBS). Eseguire questi lavaggi più velocemente possibile (meno di 10 sec per quattro di essi è ideale) per impedire litio efflusso.
- Lyse le cellule del 25% di acido nitrico. Applicare 250 microlitri per pozzetto di 25% di acido nitrico e lasciate riposare per almeno 1 ora, poi rottami ogni pozzetto con l'estremità della punta della pipetta e trasferire l'intera sospensione bene in una nuova mitubo crocentrifuge.
- Trasferire il lisato in provette da 1,5 ml microcentrifuga, li centrifugare per 5 minuti a 15.000 xg (temperatura ambiente) per rimuovere i detriti cellulari.
- Misurare il contenuto di litio dei sopranatanti mediante spettroscopia ad assorbimento atomico 21.
NOTA: Diverse aziende forniscono spettrometri di assorbimento atomico, che devono essere dotati di una batteria agli lampada a catodo cavo. Seguire le istruzioni del produttore in quanto queste macchine sono molto precise, ma anche molto delicato.
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Representative Results
Selezione:
La selezione + uccidendo H si basa sulla diffusione della ammonio base debole, come illustrato nella Figura 1A. L'effetto di basi deboli e acidi diffusione sul pH intracellulare è stata introdotta da Walter Boron e collaboratori 22. L'elegante idea di utilizzare questo fenomeno per la produzione di una acidificazione letale per la selezione genetica positiva è stata poi sviluppata da Jacques Pouysségur 17. Sotto tale protocollo, il pH intracellulare scende a circa 5,5 dopo la fase di risciacquo. Le cellule che non esprimono un NHE funzionale a livello della membrana plasmatica non possono recuperare un valore pH neutro e mostra un aspetto tipico acidificato con una forma piatta e un citosol granulare (Figura 1B). Dopo ripetuti cicli di selezione (circa due H + uccidendo procedure / settimana), cellule che pienamente e stabilmente sopravvivere acidificazione (Figura 1C) emerge, ad una frequenza di circa 10 -7.Ciò comporta la formazione di singoli cloni cellulari che possono essere caratterizzati sia singolarmente o raggruppate per ottenere popolazioni cellulari se desiderato. Esperimenti standard come biotinilazione superficie cellulare o silenziamento dell'RNA possono essere condotte per controllare che la proteina espressa nella membrana plasmatica è effettivamente un intracellulare NHE come NHE7 (vedi ad esempio Milosavljević et al. 18). Così, RT-PCR e successivo sequenziamento devono essere eseguiti per verificare eventuali mutazioni nella sequenza dei NHEs intracellulari espresse nella linea cellulare selezionata.
Caratterizzazione funzionale:
Fluorescenza Videomicroscopy:
L'attività e la selettività di ioni dei NHEs intracellulari espressi sulla membrana plasmatica può essere caratterizzata misurando le variazioni di pH intracellulare indotto da questi NHEs in varie condizioni. Per questo una serie videomicroscopia dotato di illuminazione di unimpostazioni d acquisizione di immagine una sonda raziometrica come BCECF / AM è schematizzato in Figura 2A. Figura 2B e 2C mostrano le tipiche variazioni dei valori di fluorescenza direttamente ottenuti per eccitazioni a 490 e 450 nm, a seguito di un NH 4 + caricamento acidificazione. Figura 2D mostra la curva di pH ottenuto da questi valori di fluorescenza in seguito al trattamento dei dati descritto in 2.4).
Litio Assorbimento:
Insieme con idrogeno e sodio, litio comprende parte della prima colonna della tabella periodica e ha dimostrato di essere un catione accoppiamento efficiente per Na + / H + scambiatori. È possibile sfruttare questa informazione installazione rapida cinetica di assorbimento di litio, per misurare in dettaglio i parametri funzionali della Na + / H + scambiatori. Poiché questo cazione è assente dal citoplasma della cellula, l'accumulo su cytacidificazione osolic sarà quantitativamente riflettere l'attività della membrana plasmatica NHE. Inoltre, a concentrazioni nanomolari picomolari di litio può essere misurata con grande precisione utilizzando spettrometria ad assorbimento atomico. Pertanto, questo approccio è molto potente quando combinato con la selezione della membrana plasmatica scambiatori vescicolari espresse. La Figura 3 illustra il metodo di misurazione descritto in 3) della sezione protocolli. Cells, preferibilmente seminate su piastre multiple pozzetti (da 6 a 24) vengono acidificati come precedentemente descritto. La cinetica inizia con l'incubazione delle cellule in terreno contenente litio, e gli altri cationi o inibitori di interesse (Figura 3A).
Per fermare l'assorbimento, le cellule vengono poi sottoposti a quattro risciacqui rapidi ghiacciata PBS. Funzionamento rapidamente rimuove qualsiasi litio extracellulare garantendo che si verifica alcuna significativa efflusso litio (Figura 3B). Concentrazione di litio in ogni pozzetto è quindimisurata utilizzando la spettroscopia di assorbimento atomico (Figura 3C), e tassi iniziali di litio assorbimento, che cedere direttamente l'attività dello scambiatore allo steady-state sono ottenuti come misure pendenza del corso tempo di accumulo al litio (Figura 3D).
Quanto cinetica enzimatica, dose-risposta di tassi iniziali può essere utilizzato per ricavare valori Km per substrati (Figura 4A) di valori di Ki per inibitori. Una caratteristica interessante di trasportatori è che diversi cationi accoppiamento si sfideranno per il trasporto. Questo produce la possibilità di misurare la Km del sodio da competizione con litio assorbimento (Figura 4B).
Figura 1: Selezione di cellule esprimenti un intracellulare Na + / H + </ Strong> di scambiatori alla loro membrana plasmatica. (A) Strategia per le tre fasi H + uccidere selezione di cellule che esprimono un funzionale non mutato e non-tagged intracellulare NHE a livello della membrana plasmatica. Immagine di microscopia (B) contrasto di fase di cellule parentali PS120 sottoposti a un carico acido. Scale bar: 25 micron (C) contrasto di fase immagine microscopia di cellule PS120 selezionate per l'espressione di uno scambiatore vescicolare a livello della membrana plasmatica, a seguito di un carico acido. Scala bar: 25 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: misurazioni del pH intracellulare (A) Principio di misura del pH videomicroscopia.. (B) Evolution della fluorescenza emessa (595 nm) della sonda BCECF pH a seguito di una eccitazione a 490 nm. L: carico acido, Ri; Risciacquare, Re: recupero, Cal6.5: calibrazione a un pH intracellulare di 6,5, Cal7.0: Calibrazione ad un pH intracellulare di 7,0 (C) Evoluzione della fluorescenza emessa (595 nm) della sonda BCECF pH a seguito di una eccitazione a 450 nm. L: carico acido, Ri; Risciacquare, Re: recupero, Cal6.5: calibrazione a un pH intracellulare di 6,5, Cal7.0: Calibrazione ad un pH intracellulare di 7,0 (D) Evoluzione del pH intracellulare calcolato dai 490/450 rapporti nm fluorescenza del BCECF pH sonda e dai punti di taratura. L: carico acido, Ri; Risciacquare, Re: recupero, Cal6.5: calibrazione a un pH intracellulare di 6,5, Cal7.0: Calibrazione ad un pH intracellulare di 7,0 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Attività NHE misurata con tassi iniziali di Li + assorbimento (A - C) Scheme raffiguranti le diverse fasi critiche della tecnica di misurazione (D) Esempio di un corso a tempo misurato di captazione di litio per la vescicolare NHE7 scambiatore espressa al plasma membrana. Notare la linearità della cinetica nelle condizioni sperimentali, assicurando tassi iniziali di misura. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Tipico curve dose-risposta per NHE7 (dati originali dal 18).Tassi iniziali di litio assorbimento sono stati misurati utilizzando cinetica di 1 minuto. (A) la curva dose-risposta per litio extracellulare. (B) La concorrenza di diverse concentrazioni di sodio extracellulare su 1mM captazione litio extracellulare. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive come selezionare le cellule che esprimono intracellulare Na + / H + scambiatori a livello della membrana plasmatica, senza alterarne la sequenza primaria per mutagenesi sito-specifica. Questi scambiatori possono essere caratterizzati.
Questo metodo si basa sulla tossicità cellulare di protoni intracellulari per selezionare linee cellulari che esprimono vescicolare Na + / H + scambiatori a livello della membrana plasmatica. Potrebbe essere possibile, in linea di principio, di utilizzare altri cationi che possono essere sospettati di essere trasportato, come Li +, K +, Cs + o. Tuttavia, questo aggiunge un ulteriore livello di incertezza. Se la selezione non produce alcun clone positivo, allora sarà difficile valutare se il catione testato non viene trasportato o scambiatore non è a livello della membrana plasmatica. Per queste ragioni, selezioni sono state eseguite utilizzando Na + come catione accoppiamento quanto questo è il substr extracellulareate trova in alto abbondanza in condizioni fisiologiche. Ciò ha portato alla selezione di varianti che esprimono NHE7 18, così come NHE6 e NHE9 sulla membrana plasmatica (poeta e Counillon, risultati non pubblicati).
Questa espressione membrana plasmatica consente la misurazione dei parametri funzionali trasportatori di metodi che possono essere utilizzati finora solo per trasportatori di membrana plasmatica. Naturalmente non è possibile escludere che tale cambiamento nell'ambiente membrana può influenzare le caratteristiche funzionali delle NHEs vescicolari. Tuttavia, questa strategia potrebbe essere la pena utilizzare per almeno tre motivi: (i) l'espressione intracellulare di NHE6, 7 e 9 osta ad ogni misura dettagliata funzionale, (ii) gli ambienti di membrana e proteine o lipidi partner hanno per lo più dimostrato di influenzare sottili normativo meccanismi delle altre NHEs e non le loro caratteristiche molto fondamentali di questi trasportatori (affinità per cationi accoppiamento, selettività, direzionalità, phCaratteristiche armacological). Quindi è molto probabile che coloro che rimarranno invariati dall'espressione membrane delle NHEs vescicolari. (Iii) Conoscere i meccanismi funzionali e profili farmacologici di un meccanismo vescicolare membrana plasmatica-espresso, è poi possibile effettuare misurazioni vescicolare pH per affrontare questi possibili discrepanze tra la membrana plasmatica ed espressione vescicolare.
Un'altra potenziale limitazione di questa tecnica è che la strategia descritta qui può portare alla selezione di cellule esprimenti altri H + meccanismo di estrusione rispetto alla vescicolare transfettate Na + / H + scambiatore (come una membrana plasmatica NHE, o H + ATPasi ad esempio ). Anche se è stato mai osservato in laboratorio, è quindi fondamentale utilizzare etichettatura superficie cellulare classico accoppiato silenziamento per verificare effettivamente che l'NHE di interesse è infatti espresso sulla membrana plasmatica e media la Na + o Li + et al. 18).
Per caratterizzare l'attività di questi trasportatori, due protocolli, rispettivamente basate su variazioni di pH intracellulare e flussi ionici sono descritti. Il primo metodo richiede l'uso di sonde fluorescenti sensibili al pH e un sistema di microscopia a fluorescenza di video adeguata. Questo metodo, che viene utilizzato da molti gruppi nel settore, è stato sviluppato negli anni 1980, prima usando fluorimetri per misurare segnali formano cellule in sospensione 23, quindi utilizzando acquisizione digitale per misurare le singole celle di accoppiamento eccitazione di fluorescenza e acquisizione videomicroscopia 24. Quest'ultima tecnica è diventata molto veloce e facile, grazie alle elevate prestazioni di telecamere, illuminazione e sistemi informatici. È interessante notare che le aziende di solito forniscono schede tecniche informative molto insieme ai loro sonde fluorescenti. Queste variazioni di pH forniscono informazioni importantiper determinare la natura dei cationi extracellulari accoppiato con protoni efflusso. A questo proposito, è importante notare che la durata della preincubazione ammonio deve essere regolata con attenzione a seconda delle cellule utilizzate per le misurazioni. Fibroblasti CCL39-derivati, supportano molto bene un carico un'ora con 50 mM NH 4 Cl. Ciò si traduce in un forte acidificazione che permette NHE attivazione piena e produce un forte segnale per misurazioni (condizioni Vmax). Tuttavia, altre cellule come cardiomiociti o cellule renali primarie non sosterrebbero un tale importante carico di ammonio. Vale la pena di eseguire numerosi studi preliminari con diversi tempi di incubazione o NH 4 concentrazioni Cl. La ragione di tali differenze nella sensibilità al NH 4 Cl non sono chiare. Essi possono essere correlati alla possibile espressione di sistemi di trasporto di ammonio 25,26. Analogamente la soluzione senza sodio che viene utilizzato per il risciacquo della soluzione di carico non può essere tolleratadalle cellule, come ad esempio cardiomiociti. Sebbene velocità iniziali saranno determinati minore precisione, è necessario perfusione direttamente con la soluzione di recupero dopo il caricamento di ammonio.
Inoltre, le misure di pH intracellulari forniscono anche un modo semplice per studiare le proprietà di questi scambiatori reversibili come la modalità inversa produrrà una acidificazione che verrà facilmente rilevato da una diminuzione del livello di fluorescenza BCECF che può essere espresso come segue calibrazione pH . I limiti di questi esperimenti è la mancanza di una quantificazione accurata delle attività di trasporto, come le variazioni di pH esperimenti misura, che operano su una scala logaritmica e sono limitate dalla capacità tampone intracellulare. Quest'ultima può essere misurata e le variazioni di pH moltiplicato per capacità di buffering flussi resa ionici. Tuttavia, questo processo combina diversi errori sperimentali (su misurazioni del pH, misure di capacità di buffering, e calibrazione) e non è quindi altamente quantitativa. Quindi, per accedere alle costanti enzimatiche della membrana plasmatica espressa trasportatore, le tecniche di flusso rapido ioni sono molto più semplice e preciso.
Poiché contenuti intracellulari sono nella gamma millimolare, rilevando le variazioni NHE-mediate in sodio citosolico non è possibile. D'ora in poi, per anni tali tecniche assorbimento erano basate sull'uso di radioisotopi come 22 Na +. Questo manoscritto descrive un metodo non radioattivo per i quali Na + 22 è sostituito dal litio, basato sulla logica che questo catione che viene utilizzato anche da NHEs, è assente dal citosol delle cellule e può essere misurata con grande precisione mediante spettrometria di assorbimento atomico 21. Una volta che le condizioni adeguate (tempo e di concentrazione di litio) per misurare fumaioli lineari (es., Essendo in tassi condizioni iniziali) sono determinati, affinità per gli altri cationi accoppiamento potenziale e / oinibitori possono essere misurate con precisione come mostrato nelle figure 3 e 4. Un ultimo limite potenziale è che il metodo di litio assorbimento può ovviamente solo funzionare se lo scambiatore di interesse trasporta in modo significativo questo cazione. Se non è il caso, lo sperimentatore dovrà contare sia sulle misurazioni di pH intracellulare summenzionati o dovrà utilizzare assorbimento di sodio radioattivo.
Una tale serie di esperimenti hanno portato di recente portato alla constatazione che il NHE7 intracellulare Na + / H + scambiatore, che inizialmente si credeva di essere un H + / K + trasportatore che alkalinize vescicole era in realtà un meccanismo endosomal acidificazione accoppiato al sodio 18. Ciò ha implicazioni profonde per compartimenti intracellulari come finora questo ruolo è stato pensato per essere dedicata ai + ATPasi VH. Come ogni membro della famiglia NHE sembra visualizzare un ben preciso cinetica firma oala per il suo ruolo fisiologico, si è tentati di ipotizzare che la caratterizzazione di NHE6 e NHE9 utilizzando i metodi descritti in questo articolo rivelerà romanzo e caratteristiche inaspettate che metterà in evidenza le loro funzioni fisiologiche.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard cell culture equipement | Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers | ||
| Incubator with CO2 | Sanyo | MCO15A | |
| Incubator without CO2 | Heraeus instrument | BB6220 | |
| Laminar flow hood PSM1200NF | Fisher | 52010120 | |
| DMEM medium | sigma | D5796 | |
| FBS gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Penicilin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| Trypsin 10x | PAA | L11-003 | |
| Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system | Thermo Scientific | ICE 3500 GFZ | |
| LiCl | sigma | L4408 | |
| Nitric Acid | sigma | 438073 | |
| Fluorescence videomicroscopy set | Leica | Composed of many devices with different catalog numbers | |
| Inverted automated microscope | Leica | DMI6000B | |
| microscope stand | leica | 11888906 | |
| 11888911 | |||
| 11505180 | |||
| 11888377 | |||
| incident fluorescence | leica | 11888901 | |
| 11504166 | |||
| motor bracket | leica | 11888379 | |
| 11505234 | |||
| 11521505 | |||
| 11522106 | |||
| LED transmission light | leica | 8097321 | |
| 8102034 | |||
| 11521580 | |||
| motorized plate | leica | 11522068 | |
| 11531172 | |||
| 11521734 | |||
| 11521719 | |||
| 11888423 | |||
| 11888424 | |||
| camera output | leica | 11888373 | |
| 11507807 | |||
| 11888393 | |||
| 11888259 | |||
| 11888258 | |||
| 11541510 | |||
| images acquisition/analysis software | leica | 11888375 | |
| optics | leica | 11506507 | |
| 11506243 | |||
| 11506203 | |||
| fluorescence Xenon lamp | leica | DMI6000 | |
| camera | hamamatsu | 8100601 | |
| metafluor/Mmfluor software | 11640905 | ||
| pH sensitive probe, BCECF-AM | life technologies | B1170 | |
| Nigericin | Sigma | N7143 |
References
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