Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Et lite volum Bioassay å Vurdere Bakteriell / Planteplankton Co-kultur Bruke VANN-Pulse-amplitydemodulerte (VANN PAM) Fluorometri

Published: March 11, 2015 doi: 10.3791/52455
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Alberta

Abstract

Konvensjonelle metoder for eksperimentell manipulasjon av mikroalger har anvendt store volumer av kultur (20 ml til 5 l), slik at kulturen kan delutvalgt gjennom hele eksperimentet 1-7. Subsampling av store volumer kan være problematisk av flere grunner: 1) det fører til variasjon i det totale volum og overflateareal: volumforhold av kulturen i løpet av eksperimentet; 2) pseudo-replikasjon (dvs. replikere prøver fra den samme behandling kolben 8) blir anvendt i stedet for virkelige replikater (dvs. prøvetaking fra gjentatte behandlinger); 3) varigheten av forsøket er begrenset av det totale volum; og 4) axenic kulturer eller vanlig bakterieflora er vanskelig å opprettholde i løpet av langvarige eksperimenter som forurensning vanligvis oppstår under Delsampling.

Bruken av mikrotiterplater muliggjør en ml kulturvolumer som skal brukes for hver replikere, med opp til 48 separate behandlinger innenforen 12.65 x 8.5 x 2.2 cm plate, og dermed redusere den eksperimentelle volum og som åpner for omfattende replikering uten Delsampling noen behandling. I tillegg kan denne teknikken bli modifisert for å passe til en rekke eksperimentelle formater, inkludert: bakteriell-alge-ko-kulturer, alge fysiologiske tester, og toksinet screening 9-11. Individuelle brønner med en alge, bakterier og / eller ko-kulturene kan prøves for en rekke laboratorieprosedyrer, inkludert, men ikke begrenset til: VANN-puls-amplitude-modulert (WATER-PAM) fluorometri, mikroskopi, bakteriekolonidannende enhet (cfu) teller og flowcytometri. Kombinasjonen av mikrotiter plateformat og vann-PAM fluorometri tillater flere hurtige målinger av fotokjemisk utbytte og andre fotokjemiske parametere med lav variabilitet mellom prøver med høy reproduserbarhet og unngår de mange fallgruver subsampling en glassballong eller konisk kolbe i løpet av et eksperiment .

Introduction

Planteplankton fysiologi har tradisjonelt blitt studert i meso-skala eksperimenter som spenner fra 20 ml i koniske kolber til 5 L i glassballonger 1-7. Dette eksperimentell skala krever subsampling for eksperimentell overvåking, som ofre replikere prøver for hvert tidspunkt skaper en uhåndterlig eksperimentelle oppsettet.

Evnen til å øke antallet uavhengige eksperimenter ved bruk av den samme diurnal inkubator plass ved miniaturizing den eksperimentelle volum for alge fysiologiske eksperimenter vil redusere eller eliminere de begrensninger av subsampling og pseudo-replikasjon fra store volumer. En mikrotiterplate format er blitt utviklet for alge bioanalyser ved anvendelse av en 1 ml kulturvolum for eksperimentelt å manipulere alger i variable forhold. Dette lille volum eksperimentelle tillater antall replikater økes, øker eksperimentell reproduserbarhet på grunn av en redusert variabilitet mellom gjentatte prøver ogeksperimenter, og tillater sann replikering og samtidig opprettholde eksperimentelle kontroller (dvs. axenic algekulturer) for 140 dager (figur 2) 12.

Denne mikrotiter plateformat blir lett tilpasses for en rekke eksperimentelle spørsmål, slik som: har en bakterie ha en symbiotisk, nøytral eller patogene interaksjon med sin alge vert? Er tillegg av et sammensatt stimulerende eller giftig for en alge? Disse og andre spørsmål kan rettes på en rask høy gjennomstrømming måte ved hjelp av dette nye formatet 9-11.

En 48-brønners mikrotiterplate kulturplate tillater hver 1 ml tillegg til å være en uavhengig eksperimentelle oppsettet som er samplet ved en enkelt tids-punkt. Ulike parametre kan prøves fra dette en ml volum, inkludert, men ikke begrenset til: klorofyll fluorescens og fotokjemiske parametre ved hjelp VANN-Pulse-amplitydemodulerte (VANN PAM) fluorometri (se Materialer og utstyr tabell) 13. VANN PAM fluorometri er en hurtig og ikke-invasiv teknikk som kan brukes til å overvåke eksperimenter utført med alger 13. Den tillater måling av foto effektivitet og PSII helse fra en liten kultur volum (150-300 mL av kultur utvannet i medium til en 2 - 4 ml volum for VANN PAM) 14,15. I tillegg til vann-PAM fluorometri, kan dette oppsettet kan brukes til å måle en rekke andre parametere, inkludert, men ikke begrenset til: mikroskopi for å visualisere bakteriene er festet til algeceller og endringer i alge cellemorfologi; bakteriekolonidannende enhet (CFU) teller; og flowcytometri for algecelletall og identifisere subpopulasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beregninger for Forsøksoppsett

  1. Beregn volum av alger og / eller bakteriekulturer som trengs for kontroller som vil være nødvendig for hele eksperimentet ved å bruke ligning 1:
    Ligning 1
    Hvor y er lik antall kontroller som trengs pr dag, og z er lik antall dager.
  2. Beregn volum av alge og / eller bakteriekulturer som er nødvendig for ko-kulturer for forsøket ved å bruke ligning 2:
    Ligning 2
    MERK: Det er mulig å erstatte 'co-kultur' eksperimenter med enhver forbindelse skjermen; bare justere den endelige forbindelse, oppløsningsmiddel og algekonsentrasjoner for å passe den eksperimentelle design.
  3. Bruke ligninger 1 og 2 for å beregne sluttvolum på tidlig-eksponentiell algekultur (vanligvis fem dager for ~ 10 4 celler / ml, men dette bør bestemmes av performing en algevekstkurve) som er nødvendig for forsøket (det volum som er nødvendig for trinn 2.3) ved hjelp av ligning 3:
    Ligning 3
  4. Bruke ligningene 1 og 2 for å beregne det endelige volum på 10 4 cfu / ml bakteriekultur (eller ønsket inokulering konsentrasjon) nødvendig for forsøket (det volum som er nødvendig for trinn 4.2) ved bruk av ligning 4:
    Ligning 4
    MERK: Bruk ytterligere 10 ml i trinn 1.3 og 1.4 til står for pipetteringsfeil og eventuelle tester som utføres (f.eks VANN PAM, flowcytometri, mikroskopi, etc.) på 0 d. Øke dette volumet om nødvendig for å passe den eksperimentelle design.
    MERK: For et eksempel beregning av en 8-dagers eksperiment se § 10. Se supplerende tabell for medie oppskrifter.

2. Økende algeceller for Forsøksoppsett

  1. Isolere eller få enaktivt voksende axenic algekultur.
  2. Aseptisk overføring 10% av det endelige volum av algekultur i sterilt algemedium (f.eks L1 eller lignende marine algemedium, se Materialer og utstyr tabellen), som sikrer en 1: 9 fortynning av algekultur i friskt medium. Vokser den fortynnede alge i en inkubator ved hjelp diurnal tidligere definerte vekstbetingelser for at belastningen (f.eks, 18 ° C med en 16: 8 timers lys: mørke syklus som vanligvis brukes).
  3. Når kulturen har nådd tidlig eksponensiell fase re-kultur av algen i samme sterilt algemedium (f.eks L1 eller lignende marine algemedium), at sluttkonsentrasjonen er en 1: 9-fortynning, og at det endelige volum av alger er lik V A beregnes (trinn 1.3).
    MERK: Det er viktig å sikre disse kulturene er axenic. Test alle alge medier og alge lager flasker for forurensning ved plating en 20 pl prøve på en generell marin bakteriell medium (f.eks MarineBuljong 2216 supplert med 1,5% agar eller lignende).
  4. Vokse algekultur til tidlig-eksponentiell fase (~ 10 4 celler / ml).
    MERK: Hver alge belastningen har en unik vekstkurve avhengig av dyrkningsforhold. Tidlig eksponensiell fase (~ 10 4 celler / ml) kan bestemmes ved å utføre en algevekstkurve basert på celletetthet (dvs. ved hjelp av flow cytometri eller mikroskopi).

3. Klarbakterieceller for Inoculation

  1. Forhånds bestemme bakteriekonsentrasjon (cfu / ml) og optisk tetthet (OD) av bakterien ved stasjonære fase ved å gjøre en vekstkurve i de valgte bakterielle medium og vekstbetingelser (f.eks Marine Broth 2216 ved 25 ° C og 160 opm, eller lignende). Bruk denne informasjonen til å dyrke cellene (trinn 3.3) og senere for å fortynne cellene riktig i trinn 3.7.
  2. Overfør aseptisk et isolert og fersk vokst bakteriekoloni fra en 1,5% agar plate (f.eks Marine Broth 2216 smidigmentert med 1,5% agar eller lignende marine bakterie fast medium) i 5 ml av bakterie flytende medium (f.eks Marine Broth 2216 eller lignende marine bakteriemedium).
  3. Dyrke bakterien til stasjonær fase på en rullende trommel eller rister (~ 12 til 36 timer, avhengig av bakterien). Planlegge eksperimentet slik at bakterien har nådd stasjonær fase (~ august 10 til september 10 cfu / ml) på samme tid som de algeceller har nådd tidlig eksponensiell fase (~ 10 4 celler / ml).
  4. Ved hjelp av en pipette, vaske ned en hvilken som helst biofilm festet til testrøret inn i mediet. Pipetter 1 ml godt blandet bakteriekultur inn i en steril 1,5 ml mikrorør. Sentrifuger i 1 min ved 14 000 x g.
  5. Fjern og kast supernatanten (bakteriell media) uten å forstyrre pelleten (bakterieceller). Tilsett 1 ml sterilt alge medier (f.eks L1 eller lignende) til mikrorør (med pellet). Vortex mikrorør å suspendere pellet i alge medier.
  6. Andre vask:gjenta trinn 3.5.
    MERK: Det er viktig å vaske de bakterielle celler med alge media for å grundig fjerne alle de bakterielle media, celle detritus, utskilles proteiner og små molekyler fra cellene før inoculating algene med dem som dette kan endre næringssammensetningen alge media eller innføre bioaktive molekyler til skjermen.
  7. Serielt fortynnet de vaskede bakterieceller i algemateriale, til en endelig konsentrasjon som er 100 ganger mer konsentrert enn den ønskede sluttbakteriekonsentrasjon (cfu / ml). Lagre microtube som inneholder celler som har blitt vasket og utvannet i alge media for trinn 4.2.
    MERK: Planlegg eksperimentet basert på å ha en 1: 1-forhold av alger til bakterier på 0 d. For å gjøre dette den ønskede innledende bakteriekonsentrasjon for forsøket er 10 4 cfu / ml, slik at i trinn 3.7 de første celler bør være serielt fortynnet til 10 6 cfu / ml.

4. Forberede Bakterier for Experimental Setup

  1. Forberede fire sterile autoklaveres glass koniske kolber og merke dem: a) «alge kontroll kolbe", b) "utvannet bakteriell lager kolbe", c) "bakteriell kontroll kolbe ', og d)' co-kultur kolbe '.
  2. Fortynn den bakterielle suspensjon fra trinn 3.7 1:99 med sterilt algemateriale til et sluttvolum = V B (trinn 1.4). Gjør fortynning i kolben merket utvannet bakteriell lager (trinn 4.1).
    MERK: det foregående eksempel (trinn 4.2), gir dette 1:99 fortynning en sluttkonsentrasjon på 10 4 cfu / ml. Swirl kolbe å blande celler.
  3. Pipette V kontroll (trinn 1.1) fra den fortynnede bakteriell lager og putte den i bakteriell kontroll kolbe.
  4. Pipetter V kontroll av sterilt algemedium inn i den bakterielle kontrollkolbe (dette er en 1: 1-fortynning). Swirl kolbe å blande celler og sett til side for trinn 7.3.
  5. Pipette V co-kultur fra den fortynnede bakteriell lagerkolbe til co-kultur kolbe, satt kolbe til side for trinn 6.1.
    MERK: Når du gjør flere samtidige kulturer på samme alge på en gang (dvs. en co-kultur av to forskjellige bakterie isolater med en kontroll) er det nødvendig å beregne en V co-kultur for hver stamme individuelt og deretter gjenta trinn 4.5 for hver co-kultur separat. Det er også nødvendig å øke V-A beregnet i trinn 1.3 til å omfatte begge ko-kulturer som er vist i ligning 5:
    Ligning 5

5. Klar Alger for Forsøksoppsett

  1. Bland forsiktig tidlig-eksponentiell algekultur (fra trinn 2.4) med en bred munn pipettespissen til cellene vises godt blandet.
  2. Pipette V kontroll fra alge lager flasken til alge kontroll kolbe. Pipettere forsiktig ved anvendelse av en 10 ml pipette. Deretter returnere alge lager flasken i dagaktive kuvøse.
  3. Pipette V fortsrol sterilt algemedium til algekontroll kolbe (dette er en 1: 1-fortynning). Virvle å blande kolbe og plass i dagaktive kuvøse, inntil nødvendig for trinn 7.4.

6. Klar Experimental Co-kultur

  1. Forsiktig pipettere V ko-kultur fra alge lager kolben inn i den bakterielle ko-kultur kolben fra trinn 4.5. Returnere co-kultur kolbe til dagaktive inkubator inntil nødvendig for trinn 7.5.
    MERK: Konsentrasjonen av bakterier i den bakterielle kontroll bør tilsvare den bakteriekonsentrasjon i forsøks ko-kulturen. Tilsvarende bør konsentrasjonen av alger i algekontroll lik konsentrasjonen av algene i den eksperimentelle ko-kulturen. Ved å ha de samme innledende bakterie- og algekonsentrasjoner, kan befolkningstettheten bli sammenlignet i løpet av eksperimentet.

7. Sette opp mikrotiterplater

  1. Del en steril 48-brønners mikrotiterplate som per figur 1.Etiketten over de ytre brønner inneholdende enten sterilt fortynningsmiddel eller ikke-fotosyntetiske prøver.
    MERK: Randomisering av platebrønnene kan gjøres for prøver tatt på samme dag. For eksempel vil en kvadrant bli samplet ved en d i eksperimentet; brønnene som skal randomiserte er B2 - 4 og C2 - 4. La omkretsen av platen er fylt med steril løsning, som vist i figur 1.

Figur 1
Fig. 1. Skjematisk fremstilling av prøven plasseres i en 48-brønners mikrotiterplate brønner som skal fylles på følgende måte: kolonne 1 og 6, brønner A til F ( Sirkel 1 ) Er fylt med 1 ml 1 x PBS (eller annen steril oppløsning / media). Radene A og F, brønner 2 - 8 ( Sirkel 2 ) Er fylt med en ml bakteriekontroll; Rows B og E brønner 2 - 8 ( Circle 3 ) Er fylt med en ml alge kontroll; radene C og D, brønner 2 - 8 ( Sirkel 4 ) Er fylt med 1 ml ko-kulturen. Platen er delt inn i 4 kvadranter (A2, A5, D2, og D5) disse kvadrantene er hver spesifikke prøvetakings dager 1-4, bør dette randomiserte hele plater og merket deretter. Innenfor hver dag anbefaler vi randomizing algekontroll ( Sirkel 5 ) Og co-kultur ( Circle 6 ) brønner ved hjelp av en tilfeldig nummer generator. Merke lokket over 1x PBS og / eller bakteriekontrollbrønner for å hindre skyggelegging av algekulturer.

  1. Pipetter en 1x ml fosfatbufferoppløsning (PBS, pH 7,4) eller en annen steril oppløsning i de aktuelle brønner som antydet i figur 1. Utføres denne langsomt og forsiktig. PBS vil change ionestyrken av alger og / eller ko-kulturmedium hvis det spruter i andre brønner slik at håndtaket nøye.
  2. Pipetter 1 ml av bakteriekulturen i kontrollen brønnene merket bakteriekontroll (figur 1). Virvle bakteriell kolbe før pipettering hver plate for å unngå bakteriesettling.
  3. Pipetter 1 ml av alge kontroll kultur i brønner merket alge kontroll ved hjelp av en bred munn pipette (figur 1). Virvle alge kolbe så regelmessig som bakteriell kolbe. Hvis algen har en tendens til å synke eller flyte, virvle så regelmessig som er nødvendig for å opprettholde et visuelt ensartet kultur.
  4. Ved hjelp av en bred munn pipette, pipette 1 ml av co-kultur i de aktuelle brønnene (figur 1). Virvlende co-kultur kolbe så regelmessig som alge kolbe.
  5. Forsegle hver plate med parafilm og sett i en diurnal inkubator ved den ønskede temperatur og diurnal lyssyklus (18 ° C med en 16: 8 timers lys: mørke syklus som vanligvis brukes). Reiseplatene i dagaktive inkubator før du er klar til å ta PAM målinger (§ 8). Sikrer at alle platene er orientert i samme retning for å tillate konsistent lyseksponering.
  6. Ta en 20 pl alikvot fra PBS, algemateriale, alge lager og algekontroll og slippe platen på et passende ikke-selektivt medium (f.eks Marine Broth 2216 supplert med 1,5% agar), og platene inkuberes ved 18 - 25 ° C i 72 hr å teste for forurensning. Hvis veksten ut i en hvilken som helst av de oppløsninger som ikke bør inneholde bakterier, og disse data bør ikke brukes.
  7. Ta PAM fluorometri målinger ved hjelp av den gjenværende prøven fra algekontroll og co-kulturkolber for den eksperimentelle 0 d PAM fluorometri lesing (se trinn 8.1). Eventuelle andre 0-D-målinger bør også utføres med den gjenværende algekontroll, bakteriekontroll og prøver ko-kultur.

8. Ta PAM fluorometri Lesestoff fra Stock Samples

  1. Nullstille VANN PAMmed sterile alge media i en ren skål før du tar målinger 8.
  2. Pipetter 300 ul fra algekontroll eller ko-kulturflasker i en ren kyvette inneholdende 2,7 ml av det samme algemediet benyttet i forsøket. Bland prøven og væske forsiktig med en bred munn pipette.
  3. Tørk bort alle fingeravtrykk fra utsiden av kyvetten med en vev før du legger kyvetten i VANN PAM.
  4. Plassere kyvetten inn VANN PAM. Dekk prøven med lokket og la den mørk tilpasse for 3 min. Mørke tilpasningsTiden varierer avhengig av arter av alger og må bestemmes for den spesifikke alge brukt i forsøket. Unngå lange mørke tilpasnings ganger (> 20 min) ved å ta VANN PAM opplesninger under midten av den mørke syklus av alge dagaktive inkubatorer 16,17.
  5. After dark tilpasning, traff F 0. Hvis fluorescens målinger er over 3900, fortynne prøven 1: 1 i alge medium. Mørk-tilpasse for ytterligere 3 min og takea ny lesning. Hvis F 0 eller F m målinger er fortsatt over 3900, fortsetter å fortynne prøven 1: 1 i alge medium helt til F 0 og F m målinger er under 3900.
    MERK: Sørg for å redegjøre for disse fortynninger ved innspilling endelig fluorescens: for eksempel hvis den alge prøven fortynnes 1: 9 under den første overføringen fra brønnen til fortynning tube, deretter alge fluorescens lesing av 500 skal multipliseres med den inverse av fortynningsfaktoren (i dette tilfelle 10) og den faktiske fluorescens av røret er da 5.000.
  6. Etter innstilling F 0, ta en mette puls (SAT-Pulse) leser hver 90 sek ved å trykke på knappen SAT å ta F m målinger. Tidsintervallet mellom avlesningene kan justeres avhengig av alge belastning. Kast prøven.
  7. Gjenta trinn 08.01 til 08.06 for de resterende prøvene.

9. Ta PAM fluorometri Lesestoff fra mikrotiterplater

  1. Etikett6 sterile prøverør av> 3 ml volum for brønner B2 - 4 for alge kontroll og brønn C2 - 4 for bakterie ko-kultur (se plateoppsettet på figur 1).
  2. Alikvoter 2,7 ml sterilt algemedium til hvert rør.
  3. Plassere rør i dagaktive kuvøse og tillate dem å akklimatisere seg til temperaturen algen ble dyrket på i 30 min.
  4. Før du fjerner mikrotiterplate fra inkubatoren sikre at lys penetrasjon inn i de mørke aklimatisert brønnene er begrenset ved å dekke plate med aluminiumsfolie (eller lignende), bare fjerne folien mens aktivt overfører kultur fra brønnene til fortynningsrør (trinn 9.5 - 9.7).
  5. Aseptisk å blande den første mikrotiterplatebrønn (vel B2) med en vid åpning pipettespissen ved langsomt å pipettere opp og ned.
  6. Skaff fortynningsrør fra inkubatoren og aseptisk overføring 300 mL fra vel B2 (figur 1) til den tilsvarende prøverør med en bred munn pipette (Dette er en 1: 9 fortynning av prøven i algemedium).
  7. Gjenta trinn 09.05 til 09.06 for de resterende brønnene (B3,4 og C2 - 4).
  8. Dekk prøverør med aluminiumsfolie og returnere dem til dagaktive inkubator til alt er klart for VANN PAM.
  9. Utføre VANN PAM målinger som beskrevet i trinn 8.1 til 8.7. Tett mikrotiterplate med parafilm før det sendes til inkubatoren.
  10. Gjenta opplesninger ved planlagte tidsintervaller for varigheten av eksperimentet. Frekvensen og lengden av prøvetaking skal planlegges ved begynnelsen av forsøket.

10. Prøve Experiment

Prøven eksperiment er en 10 dagers co-kultur av en bakterie (Phaeobacter gallaeciensis BS107) og en microalga (Emiliania huxleyi stamme (CCMP3266)). Det inkluderer en algekontroll, bakteriekontroll og en bakteriell alge eksperimentelle ko-kulturen.

  1. Beregne mengder bakterier og alge aksjer som kreves (trinn 1.1 til 1,4)
    Ligning 10
  2. Klargjør alge lager, en V-A på 40 ml, ved å inokulere 4 ml av algen i 36 ml medium og inkubert inntil tidlig eksponensiell vekst er oppnådd med en celletetthet på 4 ~ 10 celler / ml (trinn 2.1 til 2.4).
  3. Klargjør det bakterielle lager kolbe ved å fortynne 400 ul av de 10 6 cfu / ml bakterier oppnådd i del 3 i en V B av 40 ml med algemateriale (sluttkonsentrasjon av bakterier vil være 10 4 cfu / ml).
  4. Overføring halvdel (20 ml) av bakterie lager til det bakterielle kontrollkolbe og tilsett 20 ml av algemateriale for å gjøre det bakterielle kontroll. Transfer halvparten (20 ml) alge lager til alge kontroll kolbe og tilsett 20 ml av alge media for å gjøre opp alge kontroll (§ 5). Overføre de resterende 20 ml bakterie lager til co-kultur kolbe og bland med de resterende 20 ml alge lager for å etablere co-kultur (avsnitt6).
  5. Pipetter 1 x PBS (pH 7,4), kontroller, og ko-kulturen i to forhåndsmerkede mikrotiterplater (figur 1), 1 ml pr brønn. Bruk 3 ml de resterende kontroller og co-kulturer å gjøre 0 d målinger (cfu teller, VANN PAM (§ 8), mikroskopisk observasjon av alge cellemorfologi, og alge celle fiksering for flowcytometri).
  6. Ta vann-PAM-avlesninger for den algekontroll og ko-kulturen gang om dagen i 10 d, og alltid på samme tid som de 0 d målingene ble tatt (del 8).

11. Andre Parametere av interesse

  1. Bestem bakteriell cfu konsentrasjon: utføre en seriell fortynning av bakteriell kontroll og co-kultur i sterile 1x PBS (eller lignende), og deretter slippe plate på Marine Broth 2216 supplert med 1,5% agar (eller lignende) og observere antall cfu som vokser å bestemme de bakterielle cfu / ml for hver brønn 18.
  2. Å evaluere algecellekonsentrasjonen: fikse alge kontroll og samarbeidkultur med en 0,15% sluttkonsentrasjon av glutaraldehyd. Inkuber i 10 minutter i mørket og deretter flash-frysing i flytende nitrogen, og oppbevares ved -80 ° C. Prosessen alle prøvene på en strømningscytometer (FACS Calibur eller lignende) for å telle algeceller.
  3. Observer alge cellemorfologi: algekulturer og bakteriell alge ko-kultur ved hjelp av mikroskopi (dvs. lysmikroskopi, epifluorescens, eller lignende).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

VANN PAM fluorometri avlesninger.

VANN-Pulse-amplitydemodulerte (PAM) fluorometri er en rask og effektiv metode for å bestemme fluorescens (en proxy for klorofyll-innhold) og foto yield (PSII helse) av algekulturer. PAM WinControl programvare genererer et regneark med rå dataverdier for (følgende er de grunnleggende parametrene for mørke tilpasset algeprøver):

F 0 = fluorescens av mørke-tilpasset celler

F m = maksimal fluorescens etter mette lysdioder (LED) puls

F v / F m = (F m -F 0) / F m = potensiell kvanteutbytte av en mørk tilpasset prøve 19

PAM fluorometri har mange bruksområder og kan gi mye informasjon om photosystem og helse av alGAE. I tillegg er det andre parametre som er viktige ved testing lett tilpasses prøver. For ytterligere å lese disse er nærmere omtalt i disse vurderinger 13,16,20-23. Disse data kan overføres til et regneark eller plotte programvare for å generere grafer av den innledende alge fluorescens (F 0), den maksimale alge fluorescens (F m), og potensialet kvanteutbytte (F v / F m; figurene 2 og 3) . Grafene i figur 3 skildre hvordan alge fluorescens og F v / F m er påvirket av bakterien ved å sammenligne alge vokst alene (kontroll) til det som dyrkes med bakterien i co-kultur gjennom hele 10-dagers co-kultur eksperiment (Figur 3C). I dette eksempel ble en to-prøve t-test anvendt for å sammenligne parametrene statistisk mellom de to behandlinger på hver dag. Tilsvarende for eksperimenter hvor mer enn to behandlinger er til stede, en ANOVA kunneanvendes. F m lesing (Figur 3B) er tatt rett etter metnings LED puls, noe som betyr at den primære PSII elektronakseptoren QA er fullt redusert og kan ikke akseptere flere elektroner fra PSII reaksjon sentrum P680, og som sådan, er alle reaksjons sentre ' lukket '17. Dette hindrer den fotokjemiske anvendelse av lysenergi, og bringer fluorescensemisjonen til et maksimum. Dette gir da maksimal fluorescens (F m) lesing. Figur 3C viser en dramatisk nedgang i PSII helse mellom 5 d og 10 d når co-kultivert med bakterien i forhold til økende alene (kontroll). Standard feilfelt er avledet fra triplikate mikrotiterbrønner, som er uavhengige forsøk fra samme foreldre bakterie- og algekulturer. Den gjennomgående lite standardfeil bekrefter robustheten og reproduserbarheten av mikrotiterplaten format for alge bioanalyser som det tillater uavhengige eksperimenter som kan brukes som Replikater og eliminerer behovet for å subsample forsøksenheten over varigheten av forsøket.

Figur 2
Figur 2. Representative VANN PAM fluorometri grafer av en 140 d vekstkurve av axenic Emiliania huxleyi (CCMP3266). (A) Readings for første alge fluorescens (F 0), (B) maksimal alge fluorescens (F m), og ( C) potensiell kvanteutbytte (F v / F m) for E. huxleyi er vist som svarte sirkler. Linjen av best passer for F 0 og F m var normal log tre parameter (Sigmaplot) R 2 = 0,94, 0,95 kroner. Potensiell kvanteutbytte (F v / F m) er en dimensjonsløs uttrykk for foto helse, som er beregnet som (F m - F 0) / F m. Linjen av best passer for F v / F m kurve var en 3 faktor polynom R2 = 0,6. Feilfelt representerer standardfeil mellom triplikatbrønner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Representative VANN PAM fluorometri grafer av en 10 d co-dyrking eksperiment av Emiliania huxleyi (CCMP3266) med Phaeobacter gallaeciensis BS107. (A) Den første alge fluorescens (F 0), (B) maksimal alge fluorescens (F m) og (C) potensiell kvanteutbytte (F v / F m) fremstilles grafisk for control alge (åpne sirkler) og alge co-dyrket med en bakterie (svarte sirkler). Potensiell kvanteutbytte (F v / F m) er en dimensjonsløs uttrykk for foto helse, som er beregnet som (F m - F 0) / F m. Feilstolpene representerer standardfeil mellom triplikatbrønner. En stjerne (*) angir hvilke dager parametrene for kontroll- og co-kultur behandlinger avvek betydelig. Forskjeller mellom behandlinger for alle dagene var ikke-signifikant med unntak av 10 d i alle tre parametrene (10 d - F 0: t-test, df = 2,5, t-ratio = -15, p = 0,0017 *; F m: t- test, df = 2,1, t-ratio = -16,15, p = 0,003 *; F v / F m.: t-test, df = -18,68, t-ratio = 2,0, p = 0,0028 *) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Algevekst i en miniatyrisert format.

Miniatyrisering av algekulturer i en 1 ml kulturvolum i en mikrotiterplate tillater replikasjon i et eksperiment for å økes. Det er viktig å sikre at algen er frisk gjennom et eksperiment; utføre en vekstkurve (figur 2), ved bruk av mikrotiter plateformat for å vurdere forskjellige algemateriale, for å sikre at de ernæringsmessige krav algen er oppfylt. I tillegg kan det være viktig å optimalisere diurnal syklus (lyse og mørke perioder) og temperatur. Riktig optimalisering for en gitt alge kan gi rom for å opprettholde sunn algekulturer ved topp fluorescens for 26 d, og for å detektere potensielle kvanteutbytte etter 140 dager (figur 2).

Minimere fordamping effekter.

Det er viktig å minimalisere fordamping virkningene av væskebaserte assays som en "kanteffekt" er vanligvis observed hvor det er større fordampning i brønner på kanten av mikrotiterplaten enn i brønner som ligger mot midten av platen. Mens fordampning har blitt observert ved kanten av platene, gjør fordampningshastigheten begrenser ikke den eksperimentelle varighet som friske algekulturer, med maksimal fluorescens ved 26 d har blitt opprettholdt i dette format (figur 2). For å minimalisere eventuelle 'kanteffekt', 1 x PBS (pH 7,4), eller en annen steril oppløsning blir alikvotert i brønner langs alle fire kanter (kolonnene A og H, p 1 og 6, figur 1).

Belysning innenfor en dagaktive kuvøse.

Mikrotiterskåler bør alle ha samme orientering i dagaktive kuvøse. For eksempel, i lengderetningen av mikrotiterplater i en inkubator betyr at platene er plassert langs den korte akse. Hvis denne orienteringen blir brukt, kan algekulturer langs den lange aksen BG (figur 1) opplevelea svak lys og temperatur-gradient på grunn av variasjonen i avstanden fra lyskilden (lyspæren er en kilde til både lys og varme). Dette har blitt observert å påvirke temperatur analyser av alger ved ekstreme av deres temperaturområde. Følgelig dette antas ikke å påvirke de fleste alger dyrket på sitt optimale temperatur. For å minimere virkningen av dette lyset og temperaturgradient sikre at større flasker ikke skaper skyggelegging, sted plater på en konsekvent avstand fra lysene, bruker skygge klut for å redusere lysnivået om nødvendig, og kontroller lysintensitet over lange aksen av dagaktive kuvøse for å sikre at det reiser jevnt.

Mørk tilpasning av algeprøver for VANN PAM fluorometri.

Før gjennomføring VANN-PAM opplesninger er det viktig å tilpasse mørk-algeprøver slik at PSII reaksjonssentre er helt åpen og lysindusert transthylakoidal pH gradient er fullstendig forsvunnet, thoss å gi ekte F o og F m verdier for å beregne F v / F m. Prøvetaking algen fra analysen for VANN-PAM-målinger i midten av den mørke fasen av diurnal syklus (dvs. for en 16: 8 timers lys: mørke syklus, vil en 2 timers prøvetaking utføres fra T (mørk) = 3-5 timer) gjør mørk tilpasning kortere tid (3-5 minutter) i forhold til midten av det lys syklus (T (lys) = 7 - 9 timer) når det er mørkt tilpasning er lengre (> 20 min) 17. Algen mørke adaption tid vil også variere avhengig av algearter, vekstforhold og lysforholdene i sitt naturlige habitat rekkevidde.

Følsomhet av VANN PAM fluorometri avlesninger.

WATER-PAM er designet for å være en ultra fluorometer stand til å oppdage F, F 0 og F m fra lave klorofyll prøver som havets overflate vann 16. Derfor det er ideelt for en miniaturized bioassay hvor prøvene kan bli utvannet. På grunn av denne følsomhet er det viktig å forstå at de vann PAM Maskinen har en øvre grense på fluorescens-målinger (dvs. F, F 0, og / eller F m) dersom prøven ikke er tilstrekkelig fortynnet (figur 4). Innenfor WinControl programvare er maksimumsverdiene først merkbar etter å ha trykket F 0 og lese F 0 (direkte etter mørk tilpasning). Følgelig F og F m er i den maksimale verdien 4056 (figur 4, nr. 2286). De maksimale verdier av F og F m avhenger av typen av algemedium som brukes til å kalibrere VANN-PAM, men prøvene over deteksjonsgrensen lett kan identifiseres fordi gjentatte målinger med den samme maksimumsverdien oppstår inntil prøven er tilstrekkelig fortynnet . Etter en 1: 1 fortynning i algemateriale, er den mindre konsentrerte prøven mørketilpasset igjen og F 0-målingen ble gjentatt. F-verdien enppears å bli målt nøyaktig, men F m er fortsatt leser den maksimale verdien 4056 (figur 4, nr. 2287). Denne prøve ble på nytt fortynnet 1: (Fig. 4, no 2288) 1 i algemateriale igjen og mørke tilpasset for en ytterligere 3 min lot en annen F 0 lesing og gyldige avlesninger ble oppnådd, slik at den neste måling (F) er tatt og F v / F m beregningen er gyldig. I dette eksempel, ble prøven fortynnet to ganger i forholdet 1: 1 med medium, som må regnes med i beregningen av F m og F 0. Det er viktig å merke seg at F v / F m, som en direkte funksjon av F 0 og F, m, er feil beregnes dersom prøvene er for konsentrert til tross for at en dimensjonsløs ekspresjon av fotosyntese helse.

Figur 4
Figur 4. WinControl visning av flere vann-PAM fluorometri lesninger av et algeprøve blir fortynnet i rekkefølge for å oppnå den riktige fortynning. Denne figur viser alge fluorescens opplesninger som når den øvre grense av det vann PAM maskin (rød boks), og de ​​hvor en passende fortynning av prøven har blitt oppnådd (grønn boks). I tillegg viser dette tallet noen av de andre variablene som denne metoden beregner, men disse er ikke diskutert i detalj her (se vurderinger 13,16,20-22). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Bakteriell forurensning.

I alle alge eksperimenter, alge kontroller er nødvendig som et utgangspunkt på alge helse, så det er viktig at den er fri for bakteriell forurensning gjennom hele forsøket. Bakteriell forurensning oppstår lett som det ikke erutvalg (for eksempel antibiotika) og fotosyntese stadig nytt organisk karbon for bakterievekst. De to viktigste måtene å unngå forurensning er å sikre sterilitet av alle løsninger (for eksempel alge media, 1x PBS, pH 7,4) og utstyr ved T = 0 d av forsøket og for å opprettholde aseptisk teknikk ved håndtering av mikrotiterplater. Forsøket bør overvåkes for forurensning på hvert tidspunkt ved å plate en 20 mL delmengde fra alle algekontrollbrønner. Dersom forurensning observeres fra en hvilken som helst av de algekontrollbrønner da disse VANN-PAM fluorometri avlesninger bør bemerkes og ekskludert fra dataanalysen. Hvis en løsning som brukes til å sette opp eksperimentet får hele eksperiment for å være forurenset, og deretter kaste eksperimentet og alle forurensede reagenser og starte på nytt. Bakteriekontroll og bakteriell-alge co-kulturer kan også bli forurenset og agar plater som brukes til bakterielle cfu tellinger bør overvåkes for alternative koloni morphologies. Godt å vel krysskontaminering kan skje når du fjerner mikrotiterplate lokket, men er lett unngås ved å ikke vippe eller riste av platene og syssels aseptisk teknikk i en laminær hette eller i nærheten av en flamme.

Fremtidige Programmer.

Dette lille volum bioassay gir en hurtig screening-metode for mikroalger ved å kombinere en mikrotiter plateformat med vann-PAM fluorometri. Eksempler på fremtidige søknader er forskjellige, og kan omfatte Imaging PAM fluorometri, som gir innblikk i celle-celle variant av PSII helse innenfor en befolkning som den utfører PAM fluorometri på individuelle celler 24. Den biologiske metode kan også kombineres med mikroskopi og flowcytometri som tidligere diskutert. En annen kombinasjon med potensial til å gi ytterligere innsikt er cellefarging for flowcytometri og mikroskopi for å belyse morfologiske variasjon innenfor subpopulasjoner av algekultur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cu. ft. Diurnal incubator (6012-1) Caron Corporate 112310-6012-1-11 www.caronproducts.com
Nunc EasYFlask 25 cm2, Vent/Close Cap, 7 ml working volume, 200/cs Thermo Fisher Scientific N156340 www.fishersci.ca
Multiwell TC Plates – 48-well BD Biosciences Discovery Labware 353078 www.bdbiosciences.com
P1000 Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman Mandel Scientific Company Inc. GF-F123602 www.mandel.ca
P10mL Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman Mandel Scientific Company Inc. GF-F161201 www.mandel.ca
Wide Orifice Tips nonsterile [100–1,250 µl] VWR International 89079-468 www.ca.vwr.com
Ultrafine Tips nonsterile [100–1,250 µl] VWR International 89079-470 www.ca.vwr.com
Finntip 10 ml [Vol: 1 - 10 ml] Thermo Fisher Scientific 9402151 www.fishersci.ca
WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED) Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany EDEE0232 www.walz.com
15 mm diameter quartz glass cuvette (WATER-K) Caron Corporate www.caronproducts.com
Sodium chloride (crystalline/certified ACS), Fisher Chemical Thermo Fisher Scientific Thermo Fisher Scientific www.fishersci.ca
BD Difco Marine Broth 2216 BD Biosciences Discovery Labware BD Biosciences Discovery Labware www.bdbiosciences.com
BD Bacto Agar BD Biosciences Discovery Labware BD Biosciences Discovery Labware www.bdbiosciences.com
L1 Medium Kit, 50 L NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota www.ncma.bigelow.org

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scarratt, M. G., Marchetti, A. Assessing microbial responses to iron enrichment in the Subarctic Northeast Pacific: Do microcosms reproduce the in situ condition? Deep Sea Res Part II Top. Stud. Oceanogr. 53 (20-22), 2182-2200 (2006).
  2. Bidle, K. D., Haramaty, L., Barcelos E Ramos, J., Falkowski, P. Viral activation and recruitment of metacaspases in the unicellular coccolithophore, Emiliania huxleyi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (14), 6049-6054 (2007).
  3. Moore, L. R., Goericke, R., Chisholm, S. W. Comparative physiology of Synechococcus and Prochlorococcus: influence of light and temperature on growth, pigments, fluorescence and absorptive. Mar. Ecol. Prog. Ser. 116, (1995).
  4. Iglesias-Rodriguez, M. D., Halloran, P. R. Phytoplankton calcification in a high-CO2 world. Science. 320 (5874), 336-340 (2008).
  5. Chen, M., Tang, H., Ma, H., Holland, T. C., Ng, K. Y. S., Salley, S. O. Effect of nutrients on growth and lipid accumulation in the green algae Dunaliella tertiolecta. Bioresour. Technol. 102 (2), 1649-1655 (2011).
  6. Lv, J. -M., Cheng, L. -H., Xu, X. -H., Zhang, L., Chen, H. -L. Enhanced lipid production of Chlorella vulgaris by adjustment of cultivation conditions. Bioresour. Technol. 101 (17), 6797-6804 (2010).
  7. Geider, R., Graziano, L., McKay, R. M. Responses of the photosynthetic apparatus of Dunaliella tertiolecta (Chlorophyceae) to nitrogen and phosphorus limitation. Eur. J. Phycol. 33 (4), 315-332 (1998).
  8. MacIntyre, H. L., Cullen, J. J. Using Cultures to Investigate the Physiological Ecology of Microalgae. Algal Cult. Tech. , 287-326 (2005).
  9. Blaise, C., Vasseur, P. Algal microplate toxicity test. Small-scale Freshw. Toxic. Investig. Vol. 1 Toxic. Test Methods. , 137-179 (2005).
  10. Skjelbred, B., Edvardsen, B., Andersen, T. A high-throughput method for measuring growth and loss rates in microalgal cultures. J. Appl. Phycol. 24, 1589-1599 (2012).
  11. Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicol. Environ. Saf. 94, 37-44 (2013).
  12. Seyedsayamdost, M. R., Case, R. J., Kolter, R., Clardy, J. The Jekyll-and-Hyde chemistry of Phaeobacter gallaeciensis. Nat. Chem. 3 (4), 331-335 (2011).
  13. Schreiber, U., Schliwa, U., Bilger, W. Continuous recording of photochemical and non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometer. Photosynth. Res. 10 (1-2), 51-62 (1986).
  14. Jones, R. J., Ward, S., Amri, A. Y., Hoegh-Guldber, O. Changes in quantum efficiency of photosystem II of symbiotic dinoflagellates of corals after heat stress, and of bleached corals sampled after the 1998 Great Barrier Reef mass bleaching event. Mar. Freshw. Res. 51 (345), 659-668 (1998).
  15. Beer, S., Larsson, C., Poryan, O., Axelsson, L. Photosynthetic rates of Ulva (Chlorophyta) measured by pulse amplitude modulated fluorometry. Eur. J. Phycol. 35 (1), 69-74 (2000).
  16. WATER-PAM Chlorophyll Fluorometer. Instrument Description and Information for Users. , Heinz Walz GmbH. Germany. Available at: http://www.walz.com/downloads/manuals/water-pam/waterp3e.pdf (2013).
  17. Maxwell, K., Johnson, G. M., Heers, J. Chlorophyll fluorescence--a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
  18. Herigstad, B., Hamilton, M., Heersink, J. How to optimize the drop plate method for enumerating bacteria. J. Microbiol. Methods. 44 (2), Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11165341 121-129 (2001).
  19. Kooten, O., Snel, J. The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology. Photosynth. Res. 25 (3), Available at: http://www.springerlink.com/index/r3689k5w72782r50.pdf 147-150 (1990).
  20. Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence--a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
  21. Schreiber, U. Pulse-Amplitude-Modulation (PAM) Fluorometry and Saturation Pulse Method: An Overview. Chlorophyll a Fluoresc. A Signat. Photosynth. , 279-319 (2004).
  22. Roháček, K., Barták, M. Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters, and some applications. Photosynthetica. 37 (3), 339-363 (1999).
  23. Da Silva, J. M., da Silva, A. B., Pádua, M. Modulated chlorophyll a fluorescence: a tool for teaching photosynthesis. J. Biol. Educ. 41 (4), 178-183 (2007).
  24. Vieira, S., Ribeiro, L., Jesus, B., Cartaxana, P., da Silva, J. M. Photosynthesis assessment in microphytobenthos using conventional and imaging pulse amplitude modulation fluorometry. Photochem. Photobiol. 89 (1), 97-102 (2013).

Tags

Environmental Sciences planteplankton mikroalger co-kultur bakterier VANN-Pulse-amplitydemodulerte (VANN PAM) fluorometri foto yield klorofyll mikrotiterplate analysen høy gjennomstrømming bioassay
Et lite volum Bioassay å Vurdere Bakteriell / Planteplankton Co-kultur Bruke VANN-Pulse-amplitydemodulerte (VANN PAM) Fluorometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bramucci, A. R., Labeeuw, L.,… More

Bramucci, A. R., Labeeuw, L., Mayers, T. J., Saby, J. A., Case, R. J. A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) Fluorometry. J. Vis. Exp. (97), e52455, doi:10.3791/52455 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter