Abstract
Konventionella metoder för experimentell manipulering av mikroalger har utnyttjat stora volymer av odling (20 ml till 5 L), så att odlingen kan delsamplas under experimentet 1-7. Delsampling av stora volymer kan vara problematisk av flera skäl: 1) det orsakar variation i den totala volymen och ytarean: volymförhållande av kulturen under experimentet; 2) pseudo-replikering (dvs, replikera prover från samma behandlingskolven 8) ofta används i stället för riktiga replikat (dvs, provtagning från upprepade behandlingar); 3) att hela experimentet begränsas av den totala volymen; och 4) axenisk kulturer eller den vanliga bakteriefloran är svåra att upprätthålla under långtidsförsök som kontaminering sker vanligen under delstickprov.
Användningen av mikrotiterplattor möjliggör 1 ml kulturvolymer som skall användas för varje replikera, med upp till 48 separata behandlingar inomen 12,65 x 8,5 x 2,2 cm platta och därmed minskar den experimentella volymen och möjliggör omfattande replikering utan subsampling någon behandling. Dessutom kan denna teknik modifieras för att passa en mängd olika experimentella format inklusive: bakteriellt-algal samkulturer, alger physiology tester och toxin screening 9-11. Enskilda brunnar med en alg, bakterie och / eller co-kulturer kan samplas för många laboratorieförfaranden inklusive, men inte begränsat till: VATTEN-Pulse-amplitudmodulerad (WATER-PAM) fluorometri, mikroskopi, bakteriekolonibildande enhet (CFU) räknas och flödescytometri. Kombinationen av mikrotiterplattformat och VATTEN PAM fluorometri tillåter flera snabba mätningar av fotokemisk avkastning och andra fotokemiska parametrar med låg variabilitet mellan prover, hög reproducerbarhet och undviker de många fallgropar delstickprov en damejeanne eller konisk kolv under loppet av ett experiment .
Introduction
Växtplankton fysiologi har traditionellt studerats i meso skaleförsök från 20 ml i koniska kolvar till 5 L i dunkar 1-7. Denna experimentella skala kräver subsampling för experimentell övervakning, så offra replikatprover för varje tidpunkt skapar en ohanterlig experimentuppställning.
Förmågan att öka antalet oberoende försök medan du använder samma dygns inkubatorn utrymme genom miniatyrisera den experimentella volym för alger fysiologiska experiment kommer att minska eller eliminera de begränsningar av subsampling och pseudo replikering från stora volymer. En mikrotiterplattformat har utvecklats för alger bioanalyser med en 1 ml odlingsvolym för experimentellt manipulera alger i varierande förhållanden. Denna lilla experiment volymen gör att antalet replikat ökas, ökar experimentell reproducerbarhet på grund av en minskad variabilitet mellan replikatprover ochexperiment och tillåter sann replikering bibehållen experimentella kontroller (dvs. axenisk alger kulturer) för 140 dagar (Figur 2) 12.
Denna mikrotiterplattformat är lätt anpassas för en mängd olika experimentella frågor, till exempel: gör en bakterie har ett symbiotiskt, neutral eller patogen interaktion med sin alger värd? Är tillsatsen av en förening stimulerande eller toxiska för en alg? Dessa och andra frågor kan behandlas i en snabb hög genomströmning sätt att använda denna nya formatet 9-11.
En 48-brunnars mikrotiterplatta med odlingsplatta tillåter vardera 1 ml väl att vara en oberoende försöksuppställning som samplas vid en enda tidspunkt. Olika parametrar kan samplas från 1 ml volym inklusive, men inte begränsat till: klorofyllfluorescens och fotokemiska parametrar använder WATER-Pulse-amplitudmodulerad (WATER-PAM) fluorometri (se Material och utrustning tabell) 13. WATER-PAM fluorometri är en snabb och icke-invasiv teknik som kan användas för att övervaka experiment utförda med alger 13. Den tillåter mätning av foto effektivitet och PSII hälsa från en liten odlingsvolym (150-300 pl kultur utspätt i medium till en 2-4 ml volym för WATER-PAM) 14,15. Förutom vatten-PAM fluorometri, kan denna inställning användas för att mäta en mängd olika andra parametrar, inklusive, men inte begränsat till: mikroskopi för att visualisera bakterierna knutna till algceller och förändringar i algceller morfologi; bakteriekolonibildande enhet (cfu) räknas; och flödescytometri för alger celler och identifiera subpopulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beräkningar för Experimentell Setup
- Beräkna volymen av alger och / eller bakteriekulturer som behövs för kontroller som kommer att krävas för hela experimentet genom att använda ekvation 1:
Där y är lika med antalet kontroller som behövs per dag och z är lika med antalet dagar. - Beräkna volymen av alg- och / eller bakteriekulturer som behövs för samkulturer för experimentet genom användning av ekvation 2:
OBS: Det är möjligt att ersätta "co-kultur" experiment med någon förening skärmen; bara justera den slutliga föreningen, lösningsmedel och algkoncentrationen för att passa den experimentella designen. - Använd Ekvationer 1 och 2 för att beräkna den slutliga volymen av tidig-exponentiell algodlingens (vanligen fem dagar för ~ 10 4 celler / ml, men detta bör bestämmas av performing en algtillväxt kurva) som krävs för experimentet (denna volym behövs för steg 2,3) med användning av ekvation 3:
- Använd Ekvationer 1 och 2 för att beräkna den slutliga volymen av 10 4 cfu / ml bakteriekultur (eller önskad inokulering koncentration) erfordras för experimentet (denna volym behövs för steg 4,2) med användning av ekvation 4:
OBS: Använd ytterligare 10 ml i steg 1.3 och 1.4 för att redovisa pipettering fel och eventuella tester som utförs (t.ex. VATTEN PAM, flödescytometri, mikroskopi, etc.) på 0 d. Öka denna volym om det behövs för att passa den experimentella designen.
OBS: För ett exempel beräkning av en 8-dagars experiment se avsnitt 10. Se kompletterande tabell för medie recept.
2. Växande algceller för Experimentell Setup
- Isolera eller erhålla enaktivt växande axenisk algkulturen.
- Överför aseptiskt 10% av den slutliga volymen av algodlingens i sterilt alger medium (t.ex., L1 eller liknande marina alger medium, se Material och utrustning tabell), vilket garanterar en 1: 9 utspädning algodlingsmedium i färskt medium. Odla den utspädda algen i en dygns inkubator använder tidigare bestämda tillväxtbetingelser för den stam (t.ex. 18 ° C med en 16: 8 h ljus: mörker-cykel är vanligt förekommande).
- När kulturen har nått tidig exponentiell fas, åter-kultur algen i samma sterila alger medium (t.ex., L1 eller liknande marina alger medium), säkerställa den slutliga koncentrationen är en 1: 9 utspädning och att den slutliga volymen av alger är lika med V ^ beräknas (steg 1.3).
OBS: Det är viktigt att se till att dessa kulturer är axenisk. Testa alla alger medier och alger lagerflaskor för förorening med plätering en 20 ul alikvot på en allmän marin bakteriell medium (t.ex., MarineBroth 2216 kompletterad med 1,5% agar eller liknande). - Odla algkulturen till tidig exponentiell fas (~ 10 4 celler / ml).
OBS: Varje algernas stam har en unik tillväxtkurva beroende på odlingsbetingelser. Tidigt-exponentiella fasen (~ 10 4 celler / ml) kan bestämmas genom att utföra en algtillväxt kurva baserad på celltäthet (dvs. med hjälp av flödescytometri eller mikroskopi).
3. Förbereda bakterieceller för Ympning
- Pre-bestämma bakteriekoncentrationen (cfu / ml) och optisk densitet (OD) av bakterien vid stationär fas genom att göra en tillväxtkurva i de valda bakteriemedel och tillväxtbetingelser (t.ex. Marine Broth 2216 vid 25 ° C och 160 rpm, eller liknande). Använd denna information för att odla cellerna (steg 3.3) och senare för att späda cellerna korrekt i steg 3.7.
- Överför aseptiskt en isolerad och nyligen vuxit bakteriekoloni från en 1,5% agarplatta (t.ex. Marine Broth 2216 smidigterad med 1,5% agar eller liknande marina bakterie fast medium) i 5 ml bakteriellt vätskemedium (t.ex., Marine Broth 2216 eller liknande marina bakteriemedium).
- Odla bakterien till stationär fas på rullande trumma eller shaker (~ 12-36 timmar, beroende på bakterien). Plan experimentet så att bakterien når stationär fas (~ 8 Oktober - 9 oktober cfu / ml) på samma gång som de algceller har nått den tidiga exponentiella fasen (~ 10 4 celler / ml).
- Med pipett skölja ner eventuella biofilm fäst provröret i mediet. Pipettera 1 ml välblandad bakteriekultur i en steril 1,5 ml mikrorör. Centrifugera under 1 min vid 14000 x g.
- Avlägsna och kassera supernatanten (bakteriell media) utan att störa pelleten (bakterieceller). Tillsätt 1 ml steril alger medier (t.ex., L1 eller liknande) till mikrorör (med pellet). Vortex mikrorör att suspendera pelleten i alg- medier.
- Andra tvätt:Upprepa steg 3,5.
OBS: Det är viktigt att tvätta bakteriecellerna med alger media för att grundligt ta bort alla bakterie medier, cell detritus, utsöndras proteiner och små molekyler från cellerna före ympning algerna med dem, eftersom detta skulle kunna förändra närings sammansättning algernas medier eller införa bioaktiva molekyler till skärmen. - Seriellt späda de tvättade bakterieceller i alg- medier, till en slutlig koncentration som är 100 gånger mer koncentrerad än den önskade slutliga bakteriekoncentration (cfu / ml). Spara mikrorör innehåller celler som har tvättats och efter utspädning i alger media för steg 4.2.
OBS: Planera experimentet bygger på att ha en 1: 1-förhållande av alger till bakterier på 0 d. För att göra detta den önskade initiala bakteriekoncentration för experimentet är 10 4 cfu / ml, så i steg 3.7 bör de initiala cellerna seriespäddes till 10 6 cfu / ml.
4. Utarbetande Bakterier för Experimental Setup
- Förbered fyra sterila autoklaveras glas koniska kolvar och märka dem: a) "alger kontroll kolven", b) "utspätt bakterieaktie kolv", c) bakteriekontroll kolven ", och d) 'co-kultur kolv".
- Späd bakteriesuspensionen från steg 3,7 1:99 med sterila algal media till en slutlig volym = V B (steg 1,4). Gör utspädningen i kolven märkt utspädda bakteriell lager (steg 4,1).
OBS: I det föregående exemplet (steg 4,2), ger detta 1:99 utspädning en slutlig koncentration av 10 4 cfu / ml. Swirl kolv för att blanda celler. - Pipett V kontroll (steg 1.1) från de utspädda bakterie lager och lägga den i det bakteriella kontrollen kolven.
- Pipettera Vcontroi sterilt alger mediet i bakteriestyrkolven (detta är en 1: 1 utspädning). Swirl kolv för att blanda celler och ställ åt sidan för steg 7.3.
- Pipett V samodling från de utspädda bakterie lagerkolv till samodlingssystemet kolv, ställ kolven åt sidan för steg 6.1.
OBS: När du gör flera samkulturer på samma algen på en gång (dvs, en co-kultur av två olika bakterieisolat med ett reglage) är det nödvändigt att på nytt beräkna V co-kultur för varje stam för sig och sedan upprepa steg 4.5 för varje samodling separat. Det är också nödvändigt att öka V ^ som beräknats i steg 1,3 för att inkludera båda samodlingar visas i ekvation 5:
5. Förbereda Alger för experimentell Setup
- Blanda försiktigt tidig exponentiell algkulturen (från steg 2,4) med en bred mun pipettspetsen tills celler verkar väl blandat.
- Pipette V styrning från alger aktie flaskan till algernas styrkolven. Försiktigt pipett med en 10 ml pipett. Tillbaka sedan alger aktie flaskan i dygns inkubator.
- Pipettera V fortsrol sterilt alger medium till alg- styrkolven (detta är en 1: 1 utspädning). Snurra att blanda kolv och placera i dygns inkubatorn, tills det behövs för steg 7,4.
6. Förbereda Experimentell Co-kultur
- Pipett försiktigt V samodling från alger aktie kolven i bakterie samodlingssystemet kolv från steg 4,5. Återgå samodling kolven till dygns inkubatorn tills de behövs för steg 7,5.
OBS: Koncentrationen av bakterier i den bakteriella kontroll bör vara lika bakteriekoncentrationen i den experimentella samodlingen. På samma sätt bör koncentrationen av alger i alger kontroll lika med koncentrationen av alger i den experimentella samodlingen. Genom att ha samma initiala bakteriella och algkoncentrationen kan befolkningstäthet jämföras genom hela experimentet.
7. Konfigurera mikrotiterplattor
- Dela upp en steril 48-brunnsmikrotiterplatta per figur 1.Märk ovan yttre brunnarna innehåller antingen sterila spädnings eller icke-fotosyntetiska prover.
OBS: Randomisering av plattbrunnar kan göras för prover tagna på samma dag. Till exempel kommer kvadrant 1 samplas vid ett d i experimentet; brunnarna som bör randomiserade är B2 - 4 och C2 - 4. Låt omkretsen av plattan fylldes med steril lösning som visas i figur 1.
. Figur 1. Schematisk representation av prov placering i en 48-brunnars mikrotiterplatta Wells skall fyllas enligt följande: kolumnerna 1 och 6, brunnarna A till F ( 
) Är fyllda med 1 ml 1x PBS (eller annan steril lösning / media). Rader A och F, brunnarna 2-8 ( 
) Är fyllda med 1 ml bakteriekontroll; roWS B och E brunnar 2-8 ( 
) Är fyllda med 1 ml alger kontroll; rader C och D, brunnar 2-8 ( 
) Är fyllda med 1 ml co-kultur. Plattan är indelad i fyra kvadranter (A2, A5, D2 och D5) dessa kvadranter är varje specifikt provtagningsdagar 1-4, bör detta randomiserade hela plattor och märkta i enlighet därmed. Inom varje dag råder vi randomisera alger kontroll ( 
) Och co-kultur ( 
) brunnarna med en slumpgenerator. Märk locket över 1 x PBS och / eller bakteriekontrollbrunnar för att förhindra skuggning av alg- kulturer.
- Pipettera 1 ml 1x fosfatbuffertlösning (PBS, pH 7,4) eller annan steril lösning i lämpliga brunnar som anges i figur 1. Utför denna långsamt och med omsorg. PBS kommer chanGE jonstyrkan av alg- och / eller sam-odlingsmedium, om den stänker i andra brunnar så hantera försiktigt.
- Pipettera 1 ml bakteriekontrollkultur i brunnar märkta bakteriell kontroll (Figur 1). Snurra den bakteriella kolven innan pipettering varje platta för att undvika bakteriesedimente.
- Pipettera 1 ml alger kontrollkultur i brunnar märkta alger kontroll med hjälp av en bred mun pipettspetsen (Figur 1). Snurra alg- kolven så regelbundet som bakterie kolven. Om algen tenderar att sjunka eller flyta, snurra så regelbundet som det behövs för att upprätthålla en visuellt enhetlig kultur.
- Med hjälp av en bred mun pipettspets, pipett 1 ml samodling i lämpliga brunnar (Figur 1). Virvlande samodlingssystemet kolv så regelbundet som alg- kolven.
- Täta varje platta med parafilm och lägg i en dygns inkubator vid önskad temperatur och dygnsljuscykel (18 ° C med en 16: 8 h ljus: mörker-cykel är vanligt förekommande). Lämnaplattorna i dygns inkubator tills den ska ta PAM avläsningar (avsnitt 8). Se till alla plattor är orienterade i samma riktning för att möjliggöra enhetligt ljusexponering.
- Ta en 20 pl alikvot från PBS, alg- medier, alger lager och alger kontroll och släppa plattan på en lämplig icke-selektivt medium (t.ex., Marine Broth 2216 kompletterad med 1,5% agar) och inkubera plattorna vid 18-25 ° C under 72 hr för att testa för kontamination. Om tillväxten verkar i någon av de lösningar som inte bör innehålla bakterier, då dessa uppgifter bör inte användas.
- Ta PAM fluorometri avläsningar använder resterande prov från de alger kontroll- och co-odlingsflaskor för experimentella 0 d PAM fluorometri behandlingen (se steg 8.1). Alla andra mätningar 0 d bör också utföras med den återstående alger kontroll, bakteriell kontroll och co-kultur prover.
8. Ta PAM fluorometri Read från Aktie Prover
- Nollställ VATTEN PAMmed sterila alger medier i en ren kyvett innan du tar avläsningar 8.
- Pipettera 300 | il från alg- styr- eller sam-odlingsflaskor i en ren kyvett innehållande 2,7 ml av samma alger medium som används i experimentet. Blanda provet och utspädningsmedlet försiktigt med en bred mun pipettspetsen.
- Torka-off alla fingeravtryck från utsidan av kyvetten med en vävnad innan du placerar kyvetten i VATTEN PAM.
- Placera kyvetten i VATTEN PAM. Täck provet med locket och låt det mörk anpassa för 3 min. Mörka anpassningsTiderna varierar beroende på art av alger och måste bestämmas för den specifika algen används i experimentet. Undvik långa mörka anpassningstider (> 20 min) genom att ta VATTEN PAM avläsningar under mitten av den mörka cykeln av alger dagaktiva inkubatorer 16,17.
- After dark anpassning, slog F 0-knappen. Om fluorescens avläsningar är över 3.900, späd provet 1: 1 i algernas medium. Dark-anpassa för ytterligare 3 min och takea ny läsning. Om F 0 eller F m avläsningar är fortfarande över 3.900, fortsätter att späda provet 1: 1 i algernas mediet tills F 0 och F m avläsningar är under 3.900.
OBS: Se till att redogöra för dessa späd vid inspelning slutliga fluorescens: exempelvis om alger provet späds 1: 9 under den inledande överföringen från brunnen till utspädningsröret, då alger fluorescens läsning av 500 multipliceras med inversen av utspädningsfaktorn (i detta fall 10) och den faktiska fluorescensen av röret är sedan 5000. - Efter inställning F 0, ta en mättande puls (SAT-Pulse) läser varje 90 sek genom att slå SAT-knappen för att ta F m avläsningar. Tidsintervallet mellan mätningarna kan justeras beroende på alger stam. Släng prov.
- Upprepa steg 8,1-8,6 för de återstående proverna.
9. Ta PAM fluorometri Read från mikrotiterplattor
- Etikett6 sterila provrör av> 3 ml volym för brunnar B2 - 4 för alger kontroll och brunnar C2 - 4 för bakterie samodlingen (se plattan layout i figur 1).
- Alikvotera 2,7 ml sterilt alger mediet i varje rör.
- Placera rören i dygns inkubator och tillåta dem att anpassa sig till temperaturen algen odlades vid 30 min.
- Innan du tar bort mikrotiterplattan från inkubatorn säkerställa att ljuset penetration i de mörka acklimatiserade brunnarna begränsas genom att täcka plattan med aluminiumfolie (eller liknande), bara ta bort folien samtidigt aktivt överföra kulturen från brunnarna till utspädningsrören (steg 9,5 - 9,7).
- Aseptiskt blanda första mikrotiterplattan väl (väl B2) med en bred mun pipettspetsen genom att långsamt pipettera upp och ned.
- Skaffa utspädningsrören från inkubatorn och aseptiskt överföring 300 ^ från brunn B2 (Figur 1) till dess motsvarande provrör med en bred mun pipettspetsen (detta är en 1: 9 utspädning av provet i alger medium).
- Upprepa steg 9,5-9,6 för de återstående brunnarna (B3,4 och C2 - 4).
- Täck provrör med aluminiumfolie och returnera dem till dygns inkubatorn tills redo för VATTEN PAM.
- Utför VATTEN PAM avläsningar som beskrivs i steg 8,1-8,7. Täta mikrotiterplattan med parafilm innan det återsänds till inkubatorn.
- Upprepa avläsningar med planerade tidsintervall under hela experimentet. Frekvensen och längden på provtagning bör planeras i början av experimentet.
10. Prov Experiment
Provet Experimentet är en 10 dagars samodling av en bakterie (Phaeobacter gallaeciensis BS107) och en mikroalg (Emiliania huxleyi stam (CCMP3266)). Den innehåller en alg kontroll, bakteriell kontroll och en bakterie alger experimentell co-kultur.
- Beräkna volymer bakteriella och alger bestånd krävs (steg 1.1-1,4)
- Förbered alg- lager, en V-A i 40 ml, genom inokulering av 4 ml av algen i 36 ml medium och inkuberades tills tidig exponentiell tillväxt uppnås med en celldensitet av ~ 10 4 celler / ml (steg 2,1-2,4).
- Förbered bakteriella lager kolven genom att späda 400 | il av de 10 6 cfu / ml bakterier som erhållits i avsnitt 3 till en V-B i 40 ml med alg- media (slutlig koncentration av bakterier kommer att vara 10 4 cfu / ml).
- Överföring halv (20 ml) av den bakteriella lager till den bakteriella kontroll kolv och tillsätt 20 ml av alger medier för att göra den bakteriella kontrollen. Transfer hälften (20 ml) alg- lager till alger kontroll kolv och tillsätt 20 ml alger medier för att ge alger kontroll (avsnitt 5). Överför de återstående 20 ml bakterie lager till samodlingssystemet kolv och blanda med de återstående 20 ml alger lager för att fastställa samodling (avsnitt6).
- Pipett 1x PBS (pH 7,4), kontroller, och co-kultur i två pre-märkta mikrotiterplattor (Figur 1), 1 ml per brunn. Använd 3 ml av de återstående kontrollerna och co-kulturer att göra 0 d mätningar (cfu räknas, VATTEN PAM (8 §), mikroskopisk observation av algceller morfologi och algceller fixa för flödescytometri).
- Ta VATTEN PAM avläsningar för alger kontroll och samodling gång dagligen under 10 d, och alltid vid samma tidpunkt som de 0 d mätningarna gjordes (§ 8).
11. Övriga parametrar av intresse
- Bestäm bakteriell cfu koncentration: utför en seriespädning av den bakteriella kontrollen och co-kultur i sterila 1x PBS (eller liknande), sedan släppa plattan på Marine Broth 2216 kompletterad med 1,5% agar (eller liknande) och observera antalet cfu som växer att bestämma de bakteriella cfu / ml för varje brunn 18.
- För att utvärdera alger cellkoncentrationen: fixa alger kontroll och samarbetekultur med en 0,15% slutlig koncentration av glutaraldehyd. Inkubera i 10 minuter i mörker, då flash frysa i flytande kväve, och förvara vid -80 ° C. Process alla prover på en flödescytometer (FACS Calibur eller liknande) för att räkna algceller.
- Beakta algceller morfologi: alg- kulturer och bakterie alger samodling med användning av mikroskopi (dvs., Ijusmikroskopi, epifluorescens, eller liknande).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
VATTEN PAM fluorometri avläsningar.
VATTEN Pulse-amplitudmodulerad (PAM) fluorometri är en snabb och effektiv metod för att bestämma fluorescens (en proxy för klorofyllhalt) och foto avkastning (PSII hälsa) av alger kulturer. PAM WinControl programvara genererar ett kalkylblad av rå datavärden för (följande är de grundläggande parametrarna för mörka anpassad alger prover):
F 0 = fluorescens av mörka anpassade celler
F m = maximal fluorescens efter mätt lysdioder (LED) puls
F v / F m = (F m -F 0) / F m = potentiell kvantutbyte av en mörk anpassad prov 19
PAM fluorometri har många användningsområden och kan ge en hel del information om fotosystem och hälsa algae. Dessutom finns det andra parametrar som är viktiga när man testar ljus anpassat prov. För vidare läsning dessa diskuteras i detalj i dessa recensioner 13,16,20-23. Dessa data kan överföras till ett kalkylblad eller grafritande programvara för att generera grafer över den initiala alger fluorescens (F 0), den maximala alger fluorescens (F m), och den potentiella kvantutbytet (F v / F m, figurer 2 och 3) . Diagrammen i figur 3 avbildar hur alger fluorescens och F v / F m påverkas av bakterien genom att jämföra algen växt enbart (kontroll) till den odlas med bakterien i samarbete kultur i hela 10-dagars samodling experiment (Figur 3C). I detta exempel framställdes en två-sample t-testet användes för att jämföra de parametrar statist mellan de två behandlingarna på varje dag. Likaså för experiment där fler än två behandlingar är närvarande, en ANOVA kundeanvändas. F m behandlingen (Figur 3B) tas direkt efter bottnande LED pulsen, vilket innebär den primära PSII elektronacceptor QA är helt reducerad och kan inte acceptera några fler elektroner från PSII reaktionscentrum P680, och som sådan, är alla reaktionscentra " stängd "17. Detta hindrar den fotokemiska användning av ljusenergi, vilket fluorescens utsläpp till ett maximum. Detta ger då maximal fluorescens (F m) läsning. Figur 3C visar en dramatisk nedgång i PSII hälsa mellan 5 d och 10 d vid samtidig odlade med bakterien jämfört växer enbart (kontroll). Standard felstaplar härrör från tredubbla mikrotiterbrunnar, som är oberoende experiment från samma föräldra bakterie- och alger kulturer. Den genomgående små standardfel bekräftar robusthet och reproducerbarhet mikrotiterplattformat för alger bioassayer eftersom det tillåter oberoende experiment som ska användas som replifikat och eliminerar behovet av att delprov den experimentella enheten under hela experimentet.
Figur 2. Representativa VATTEN PAM fluorometri grafer av en 140 d tillväxtkurvan för axenisk Emiliania huxleyi (CCMP3266). (A) Läsningar för den initiala alger fluorescens (F 0), (B) maximal alger fluorescens (F m), och ( C) potentiella kvantutbyte (F v / F m) för E. huxleyi visas som svarta cirklar. Den linje som passar bäst för F 0 och F m var normalt log 3 parameter (Sigmaplot) R2 = 0,94, 0,95 respektive. Potentiell kvantutbyte (F v / F m) är ett dimensions uttryck för foto hälsa, vilket beräknas som (F m - F 0) / F m. Den linje som passar bäst för F v / F m kurvan var en 3 faktor polynom R2 = 0,6. Felstaplar representerar standardfelet mellan tre brunnar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Representativa VATTEN PAM fluorometri grafer av en 10 d co-odling experimentet Emiliania huxleyi (CCMP3266) med Phaeobacter gallaeciensis BS107. (A) Den inledande alger fluorescens (F 0), (B) maximal alger fluorescens (F m) och (C) potentiella kvantutbyte (F v / F m) plottas för control alger (öppna cirklar) och alg samodlades med en bakterie (svarta cirklar). Potentiell kvantutbyte (F v / F m) är ett dimensions uttryck för foto hälsa, vilket beräknas som (F m - F 0) / F m. Felstaplar representerar standardfelet mellan triplikatbrunnar. En asterisk (*) betecknar dagar då parametrarna för kontroll- och co-kultur behandlingar väsentligen skilde. Skillnader mellan behandlingar för alla dagar var icke-signifikanta utom för 10 d i alla tre parametrar (10 d - F 0: t-test, df = 2,5, t-ratio = -15, p = 0,0017 *; F m: t- testet, df = 2,1, t-ratio = -16,15, p = 0,003 *; F v / F m:. t-test, df = -18,68, t-ratio = 2,0, p = 0,0028 *) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Algtillväxt i en miniatyriserad format.
Miniatyriseringen av alg- kulturer till en 1 ml odlingsvolym i en mikrotiterplatta medger replikering inom ett experiment för att ökas. Det är viktigt att säkerställa att algen är frisk hela ett experiment; utföra en tillväxtkurva (figur 2), med hjälp av mikrotiterplattformat att bedöma olika alger medier, för att säkerställa näringsbehov algen uppfylls. Dessutom kan det vara viktigt att optimera dygnscykel (ljusa och mörka perioder) och temperatur. Korrekt optimering för en given alg kan tillåta för att upprätthålla sunda alger kulturer på topp fluorescens för 26 d och för att upptäcka potentiella kvantutbyte efter 140 dagar (Figur 2).
Minimering evaporativa effekter.
Det är viktigt att minimera avdunstnings effekterna av vätskebaserade analyser som en "kanteffekt" är vanligen observed där det finns större indunstning i brunnar vid kanten av mikrotiterplattan än i brunnar placerade i riktning mot mitten av plattan. Medan avdunstning har observerats vid kanten av plattor, gör förångningshastigheten inte begränsa den experimentella varaktighet som friska alg- kulturer, med topp fluorescens vid 26 d har behållits i detta format (Figur 2). För att minimera eventuella "kanteffekt", 1x PBS (pH 7,4), eller annan steril lösning, alikvoteras i brunnar längs alla fyra kanterna (kolumnerna A och H, rader 1 och 6, Figur 1).
Belysning inom en dygns inkubator.
Mikrotiterplattor bör alla ha samma orientering i dygns inkubator. Till exempel, i längd orientering av mikrotiterplattor i en inkubator innebär att plattorna placeras längs den korta axeln. Om denna orientering används kan alg- kulturer längs den långa axeln BG (figur 1) experiencea liten ljus och temperaturgradient grund av variationen i avståndet från ljuskällan (lampan är en källa till både ljus och värme). Detta har observerats att påverka temperaturanalyser på alger vid extrema av deras temperaturområde. Följaktligen är detta sannolikt inte att påverka de flesta alger odlas på optimal temperatur. För att minimera effekterna av detta ljus och temperaturgradient se till att större flaskor inte skapar skuggning, placera plattor på ett konsekvent avstånd från lamporna, använd skugga trasa för att sänka ljusnivån vid behov och kontrollera ljusintensiteten över längdaxel dygns inkubator för att säkerställa att den färdas jämnt.
Mörk anpassning av alger prover för WATER-PAM fluorometri.
Innan bedriva VATTEN PAM avläsningar är det viktigt att mörk anpassa alger prover så att PSII reaktionscentrum är helt öppna och Ijusinducerad transthylakoidal pH-gradienten är helt försvunnit, thoss ger sann Fo och F m värden för att beräkna F v / F m. Provtagning algen från analysen för WATER-PAM mätningar i mitten av den mörka fasen av dygnscykeln (dvs för en 16: 8 h ljus: mörker-cykel, skulle en 2 tim provtagning utföras från T (mörkret) = 3-5 tim) gör mörka anpassning tiden kortare (3 - 5 min) jämfört med mitten av den ljuscykeln (T (ljus) = 7-9 timmar) när det är mörkt anpassning är längre (> 20 min) 17. Algen mörka anpassning tiden kommer också att variera beroende på algarter, tillväxtförhållanden och ljusförhållandena i dess naturliga livsmiljö intervall.
Känslighet för VATTEN PAM fluorometri avläsningar.
Den VATTEN PAM var avsedd att vara en ultra fluorometer kan detektera F, F 0 och F m från låga klorofyllprov som havsyta vatten 16. Följaktligen är idealisk för en miniatu-auktoriserad bioassay där prover kan spädas. På grund av denna känslighet är det viktigt att förstå att den vatten PAM maskin har en övre gräns av fluorescensavläsningar (dvs., F, F 0 och / eller F m) om provet inte är tillräckligt utspädd (figur 4). Inom WinControl programvaran maxvärdena är första märkbara efter att ha tryckt F 0 och läsa F 0 (direkt efter mörkrets inbrott anpassning). Följaktligen F och F m är vid det maximala värdet 4056 (figur 4, nr. 2286). De maximala värdena för F och F m beror på vilken typ av alger medium som används för att kalibrera VATTEN PAM, men prover över detektionsgränsen kan lätt identifieras eftersom upprepade avläsningar med samma maximala värdet inträffar tills provet är tillräckligt utspädd . Efter en 1: 1 spädning i alg- medier, är det mindre koncentrerade provet mörk anpassad igen och F 0 mätning upprepades. F-värdet ettppears som skall mätas korrekt, men F m är fortfarande läser maximivärdet 4056 (figur 4, nr. 2287). Detta prov igen utspätt 1: (. Figur 4, nr 2288) 1 i alger media igen och mörk anpassade för ytterligare 3 min innan du tar en annan F 0 läsning och giltiga avläsningar erhölls, så nästa mätning (F) tas och F v / F m beräkning är giltigt. I detta exempel späddes provet två gånger i en 1: 1-förhållande med medium, som måste vägas in i beräkningen av F m och F 0. Det är viktigt att notera att Fv / F m, som en direkt funktion av F 0 och F m, beräknas felaktigt om proverna alltför koncentrerad trots att en dimensionslös uttryck för foto hälsa.
Figur 4. WinControl visning av flera VATTEN PAM fluorometri läsningar av ett alger prov är sekventiellt utspätt att uppnå rätt utspädning. Denna siffra visar alger fluorescens avläsningar som når den övre gränsen för VATTEN PAM maskin (röd ruta) och sådana där en lämplig utspädning av provet har uppnåtts (grön ruta). Dessutom visar denna siffra några av de andra variabler som denna metod beräknar, men dessa är inte diskuteras i detalj här (se recensioner 13,16,20-22). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bakteriell kontaminering.
I alla alger experiment, alger kontroller är nödvändiga som en baslinje av alger hälsa, så det är absolut nödvändigt att det förblir fri från bakteriell kontamination under hela experimentet. Bakteriell kontaminering sker lätt som det inte finns någonurval (t.ex. antibiotika) och fotosyntes ständigt producerar ny organiskt kol för bakterietillväxt. De två viktigaste sätten att undvika kontaminering är att säkerställa steriliteten hos alla lösningar (t.ex. alger media, 1x PBS, pH 7,4) och utrustning vid T = 0 d av experimentet och att bibehålla aseptisk teknik vid hantering av mikrotiterplattor. Experimentet bör övervakas för förorening vid varje tidpunkt genom plätering ett 20 pl alikvot från alla alger kontrollbrunnar. Om kontamination observeras från någon av de alger kontrollbrunnar då dessa VATTEN PAM fluorometri avläsningar bör noteras och uteslutas från dataanalys. Om en lösning som används för att ställa in experimentet gör att hela experimentet vara kontaminerat, sedan kasta experimentet och alla förorenade reagenser och börja om igen. Bakterie kontroller och bakterie alger samkulturer kan också bli förorenat och agarplattor används för bakteriella cfu räknas bör övervakas för alternerande koloni Morpholker. Well-to-väl korskontamine kan inträffa när du tar bort locket mikrotiterplattan, men är lätt undvikas genom att inte luta eller skakning av plattorna och sysselsätter aseptisk teknik i ett laminärt flöde huva eller nära en eld.
Framtida tillämpningar.
Denna lilla volym bioassay ger en snabb screeningmetod för mikroalger genom att kombinera en mikrotiterplattformat med VATTEN-PAM fluorometri. Exempel på framtida tillämpningar är olika, och kan omfatta Imaging PAM fluorometri, vilket ger en inblick i cell-cell variant av PSII hälsa inom en population som den presterar PAM fluorometri på enskilda celler 24. Bioanalysen kan också kombineras med mikroskopi och flödescytometri såsom tidigare diskuterats. En annan kombination med potential att ge ytterligare insikt är cellfärgning för flödescytometri och mikroskopi att belysa morfologisk variation inom subpopulationer av algkulturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cu. ft. Diurnal incubator (6012-1) | Caron Corporate | 112310-6012-1-11 | www.caronproducts.com |
| Nunc EasYFlask 25 cm2, Vent/Close Cap, 7 ml working volume, 200/cs | Thermo Fisher Scientific | N156340 | www.fishersci.ca |
| Multiwell TC Plates – 48-well | BD Biosciences Discovery Labware | 353078 | www.bdbiosciences.com |
| P1000 Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F123602 | www.mandel.ca |
| P10mL Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F161201 | www.mandel.ca |
| Wide Orifice Tips nonsterile [100–1,250 µl] | VWR International | 89079-468 | www.ca.vwr.com |
| Ultrafine Tips nonsterile [100–1,250 µl] | VWR International | 89079-470 | www.ca.vwr.com |
| Finntip 10 ml [Vol: 1 - 10 ml] | Thermo Fisher Scientific | 9402151 | www.fishersci.ca |
| WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED) | Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany | EDEE0232 | www.walz.com |
| 15 mm diameter quartz glass cuvette (WATER-K) | Caron Corporate | www.caronproducts.com | |
| Sodium chloride (crystalline/certified ACS), Fisher Chemical | Thermo Fisher Scientific | Thermo Fisher Scientific | www.fishersci.ca |
| BD Difco Marine Broth 2216 | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| BD Bacto Agar | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| L1 Medium Kit, 50 L | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | www.ncma.bigelow.org |
References
- Scarratt, M. G., Marchetti, A. Assessing microbial responses to iron enrichment in the Subarctic Northeast Pacific: Do microcosms reproduce the in situ condition? Deep Sea Res Part II Top. Stud. Oceanogr. 53 (20-22), 2182-2200 (2006).
- Bidle, K. D., Haramaty, L., Barcelos E Ramos, J., Falkowski, P. Viral activation and recruitment of metacaspases in the unicellular coccolithophore, Emiliania huxleyi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (14), 6049-6054 (2007).
- Moore, L. R., Goericke, R., Chisholm, S. W. Comparative physiology of Synechococcus and Prochlorococcus: influence of light and temperature on growth, pigments, fluorescence and absorptive. Mar. Ecol. Prog. Ser. 116, (1995).
- Iglesias-Rodriguez, M. D., Halloran, P. R. Phytoplankton calcification in a high-CO2 world. Science. 320 (5874), 336-340 (2008).
- Chen, M., Tang, H., Ma, H., Holland, T. C., Ng, K. Y. S., Salley, S. O. Effect of nutrients on growth and lipid accumulation in the green algae Dunaliella tertiolecta. Bioresour. Technol. 102 (2), 1649-1655 (2011).
- Lv, J. -M., Cheng, L. -H., Xu, X. -H., Zhang, L., Chen, H. -L. Enhanced lipid production of Chlorella vulgaris by adjustment of cultivation conditions. Bioresour. Technol. 101 (17), 6797-6804 (2010).
- Geider, R., Graziano, L., McKay, R. M. Responses of the photosynthetic apparatus of Dunaliella tertiolecta (Chlorophyceae) to nitrogen and phosphorus limitation. Eur. J. Phycol. 33 (4), 315-332 (1998).
- MacIntyre, H. L., Cullen, J. J. Using Cultures to Investigate the Physiological Ecology of Microalgae. Algal Cult. Tech. , 287-326 (2005).
- Blaise, C., Vasseur, P. Algal microplate toxicity test. Small-scale Freshw. Toxic. Investig. Vol. 1 Toxic. Test Methods. , 137-179 (2005).
- Skjelbred, B., Edvardsen, B., Andersen, T. A high-throughput method for measuring growth and loss rates in microalgal cultures. J. Appl. Phycol. 24, 1589-1599 (2012).
- Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicol. Environ. Saf. 94, 37-44 (2013).
- Seyedsayamdost, M. R., Case, R. J., Kolter, R., Clardy, J. The Jekyll-and-Hyde chemistry of Phaeobacter gallaeciensis. Nat. Chem. 3 (4), 331-335 (2011).
- Schreiber, U., Schliwa, U., Bilger, W. Continuous recording of photochemical and non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometer. Photosynth. Res. 10 (1-2), 51-62 (1986).
- Jones, R. J., Ward, S., Amri, A. Y., Hoegh-Guldber, O. Changes in quantum efficiency of photosystem II of symbiotic dinoflagellates of corals after heat stress, and of bleached corals sampled after the 1998 Great Barrier Reef mass bleaching event. Mar. Freshw. Res. 51 (345), 659-668 (1998).
- Beer, S., Larsson, C., Poryan, O., Axelsson, L. Photosynthetic rates of Ulva (Chlorophyta) measured by pulse amplitude modulated fluorometry. Eur. J. Phycol. 35 (1), 69-74 (2000).
- WATER-PAM Chlorophyll Fluorometer. Instrument Description and Information for Users. , Heinz Walz GmbH. Germany. Available at: http://www.walz.com/downloads/manuals/water-pam/waterp3e.pdf (2013).
- Maxwell, K., Johnson, G. M., Heers, J. Chlorophyll fluorescence--a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
- Herigstad, B., Hamilton, M., Heersink, J. How to optimize the drop plate method for enumerating bacteria. J. Microbiol. Methods. 44 (2), Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11165341 121-129 (2001).
- Kooten, O., Snel, J. The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology. Photosynth. Res. 25 (3), Available at: http://www.springerlink.com/index/r3689k5w72782r50.pdf 147-150 (1990).
- Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence--a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
- Schreiber, U. Pulse-Amplitude-Modulation (PAM) Fluorometry and Saturation Pulse Method: An Overview. Chlorophyll a Fluoresc. A Signat. Photosynth. , 279-319 (2004).
- Roháček, K., Barták, M. Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters, and some applications. Photosynthetica. 37 (3), 339-363 (1999).
- Da Silva, J. M., da Silva, A. B., Pádua, M. Modulated chlorophyll a fluorescence: a tool for teaching photosynthesis. J. Biol. Educ. 41 (4), 178-183 (2007).
- Vieira, S., Ribeiro, L., Jesus, B., Cartaxana, P., da Silva, J. M. Photosynthesis assessment in microphytobenthos using conventional and imaging pulse amplitude modulation fluorometry. Photochem. Photobiol. 89 (1), 97-102 (2013).
