Abstract
Herkömmliche Verfahren für die experimentelle Manipulation von Mikroalgen haben große Volumen der Kultur (20 ml bis 5 l) verwendet, so daß die Kultur kann während des ganzen Versuchs 1-7 unterabgetastet werden. Subsampling großer Mengen kann aus verschiedenen Gründen problematisch: 1) es Veränderung der Gesamtmenge und dem Oberflächenbereich bewirkt: Volumenverhältnis der Kultur während des Experiments; 2) pseudo-Replikation (dh Parallelproben aus der gleichen Behandlung Kolben 8) wird häufig nicht wahr Wiederholungen (dh Probenahme von Wiederholungsbehandlungen) eingesetzt wird; 3) die Dauer des Experiments durch das Gesamtvolumen begrenzt ist; und 4) axenische Kulturen oder die übliche bakterielle Mikroflora sind schwierig während der Langzeitversuche beizubehalten als Verunreinigung häufig während Unterabtasten auftritt.
Die Verwendung von Mikrotiterplatten können 1 ml Kulturvolumen für jede verwendet werden repliziert, mit bis zu 48 separaten Behandlungen innerhalbein 12,65 x 8,5 x 2,2 cm Platte, wodurch der experimentellen Volumen verringert und ermöglicht so ein umfassendes Replikation ohne Unterabtastung eine Behandlung. Zusätzlich kann diese Technik modifiziert, um eine Vielzahl von Versuchsformate einschließlich passen: bakterielle Algen Kokulturen, Algen Physiologie Tests und Toxinscreening 9-11. Einzelne Vertiefungen mit einer Alge, Bakterie und / oder Co-Kulturen können für zahlreiche Laborverfahren einschließlich abgetastet werden, aber nicht beschränkt auf: Wasser-Puls-Amplitudenmoduliertes (WATER-PAM) Fluorometrie, Mikroskopie, bakterielle Kolonie bildenden Einheit (cfu) zählt und Durchflusszytometrie. Die Kombination aus dem Mikrotiterplattenformat und WASSER-PAM Fluorometrie ermöglicht mehrere schnelle Messungen der photochemischen Ausbeuten und andere photochemische Parameter mit geringer Variabilität zwischen den Proben, hohe Reproduzierbarkeit und vermeidet die vielen Fallstricke der Unterabtastung eine Glasballon oder Erlenmeyerkolben im Verlauf eines Experiments .
Introduction
Phytoplankton Physiologie ist traditionell in mesoskaligen Experimente im Bereich von 20 ml in Erlenmeyerkolben bis 5 l in Glasballons 1-7 untersucht. Diese experimentellen Maßstab erfordert Abtastung für experimentelle Beobachtung, da opfern Parallelproben für jeden Zeitpunkt erzeugt eine unüberschaubare Versuchsaufbau.
Die Fähigkeit, die Anzahl der unabhängigen Versuche erhöhen, während die gleiche Tages Inkubator Raum durch Miniaturisieren des Versuchsvolumens für Algen Physiologie Experimente verringern oder beseitigen die Grenzen der Unterabtastung und Pseudo-Replikation aus großen Volumina. Ein Mikrotiterplattenformat für Algen Bioassays unter Verwendung einer 1 ml Kulturvolumen zum experimentellen Manipulation Algen in verschiedenen Bedingungen entwickelt. Diese kleinen Versuchsvolumen ermöglicht die Anzahl der Wiederholungen erhöht wird, erhöht experimentelle Reproduzierbarkeit aufgrund einer verringerten Variabilität zwischen Wiederholungsproben undExperimente und ermöglicht echte Replikation während experimentelle Kontrollen (dh axenischen Algenkulturen) 140 Tage (Figur 2) 12.
Diese Mikrotiterplattenformat wird leicht für eine Vielzahl von experimentellen Fragen angepasst, wie: Bietet ein Bakterium haben eine symbiotische, neutral oder pathogenen Wechselwirkung mit seinem Algen Host? Ist die Zugabe einer Verbindung zu stimulieren oder toxisch einer Alge? Diese und andere Fragen können in einer schnellen Hochdurchsatz-Art und Weise mit diesem neuen Format 9-11 angesprochen werden.
Ein 48-Loch-Mikrotiterplatten Kulturplatte ermöglicht je 1 ml und eine unabhängige Versuchsanordnung, die zu einem einzigen Zeitpunkt Punkt abgetastet werden. Verschiedene Parameter können von diesem 1 ml Volumen einschließlich abgetastet werden, aber nicht beschränkt auf: Chlorophyllfluoreszenz und photochemische Parameter mit Wasser-Pulse-amplitudenmodulierten (WATER-PAM) Fluorometrie (siehe Materialien und Geräte-Tabelle) 13. WATER-PAM-Fluorometrie ist eine schnelle und nicht-invasive Technik, die verwendet werden können, um Versuche mit Algen 13 ausgeführt überwachen. Es erlaubt die Messung der photosynthetischen Effizienz und PSII Gesundheit von einem kleinen Kulturvolumen (150 bis 300 & mgr; l der Kultur in Medium zu einer 2 verdünnt - 4 ml Volumen für WATER-PAM) 14,15. Neben Wasser-PAM Fluorometrie kann dieser Aufbau verwendet werden, um eine Vielzahl von weiteren Parametern zu messen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: Mikroskopie, um die Bakterien zu Algenzellen und Veränderungen in der Algenzellmorphologie befestigt visualisieren; bakterielle koloniebildende Einheit (CFU) zählt; und Durchflusszytometrie für Algenzellzahlen und die Ermittlung Subpopulationen.
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Protocol
1. Berechnungen für Versuchsaufbau
- Berechnen des Volumens der Algen- und / oder Bakterienkulturen für Steuerelemente, die unter Verwendung von Gleichung 1 für das gesamte Experiment benötigt werden benötigt:
Wobei y gleich der Anzahl der Steuerungen pro Tag benötigt und z gleich der Anzahl von Tagen. - Berechnen des Volumens der Algen- und / oder Bakterienkulturen, die unter Verwendung von Gleichung 2 für die Co-Kulturen für den Versuch benötigt werden:
HINWEIS: Es ist möglich, "Co-Kultur-Experimente mit jeder Verbindung Bildschirm zu ersetzen; nur stellen Sie die letzte Verbindung, Lösungsmittel und Algenkonzentrationen um das experimentelle Design passen. - Verwenden der Gleichungen 1 und 2, um das Endvolumen des frühen exponentiellen Algenkultur berechnen (üblicherweise 5 Tage für ~ 10 4 Zellen / ml, aber diese sollten durch performi bestimmt werdenng eine Algenwachstumskurve) für das Experiment erforderlich ist (in diesem Band für Schritt 2.3) mit der Gleichung 3 benötigt wird:
- Verwenden der Gleichungen 1 und 2, um das Endvolumen von 10 4 KBE / ml Bakterienkultur (oder gewünschte Animpfkonzentration) für das Experiment erforderlich ist unter Verwendung der Gleichung 4 (das Volumen für den Schritt 4.2 benötigt wird) zu berechnen:
HINWEIS: Verwenden Sie die zusätzlichen 10 ml in Schritten 1.3 und 1.4 bis zum Pipettieren Fehler ausmachen und alle Tests, die durchgeführt werden (zB Wasser-PAM, Durchflusszytometrie, Mikroskopie, etc.) auf 0 d. Erhöhen Sie diese Lautstärke, wenn notwendig, um die Versuchsplanung passen.
HINWEIS: Für ein Rechenbeispiel eines 8-Tage-Experiment finden Sie in Abschnitt 10. Siehe zusätzliche Tabelle für Medien Rezepte.
2. Wachsende Algenzellen für Versuchsaufbau
- Isolieren oder zu erhalten einaktiv wachsenden axenischen Algenkultur.
- Aseptisch Transfer 10% des Endvolumens der Algenkultur in sterile Algenmedium (zB L1 oder ähnliche marine Algenmedium, siehe Materialien und Ausrüstung Tabelle), wodurch ein 1: 9 Verdünnung der Algenkultur in frischem Medium. Wachsen die verdünnte Alge in einer Tages Inkubator mit vorher festgelegten Wachstumsbedingungen für diesen Stamm (zB 18 ° C mit einem 16: 8 Stunden Licht: Dunkel-Zyklus wird häufig verwendet).
- Wenn die Kultur wurde frühen exponentiellen Phase, Wiederkultur erreicht die Alge in der gleichen sterilen Algenmedium (zB L1 oder ähnliche Meeresalgen mittel), gewährleisten die Endkonzentration einer 1: 9-Verdünnung und daß das Endvolumen von Algen ist gleich der V A berechnet (Schritt 1.3).
HINWEIS: Es ist wichtig, sicherzustellen, dass diese Kulturen sind axenischen. Testen Sie alle Algen Medien und Algenvorratsflaschen für Verunreinigungen durch Plattieren einer 20 ul-Aliquot auf eine allgemeine Meeresbakterienmedium (zB Marine-Broth 2216 mit 1,5% Agar oder ähnlich) ergänzt. - Wachsen Algenkultur zu frühen exponentiellen Phase (~ 10 4 Zellen / ml).
HINWEIS: Jeder Algenstamm hat eine einzigartige Wachstumskurve je nach Kulturbedingungen. Frühen exponentiellen Phase (~ 10 4 Zellen / ml) kann durch Durchführen einer Algenwachstumskurve, basierend auf der Zelldichte (dh unter Verwendung von Durchflusszytometrie oder Mikroskopie) bestimmt werden.
3. Vorbereitung Bakterienzellen zur Impfung
- Pre-Bestimmung der Bakterienkonzentration (cfu / ml) und die optische Dichte (OD) des Bakteriums bei der stationären Phase um dabei eine Wachstumskurve in der ausgewählten Bakterienmedium und Wachstumsbedingungen (zB Meeres Broth 2216 bei 25 ° C und 160 Umdrehungen pro Minute, oder ähnliches). Verwenden Sie diese Informationen, um die Zellen (Schritt 3.3) wachsen und später, um die Zellen korrekt in Schritt 3.7 verdünnen.
- Unter aseptischen Bedingungen wird eine isolierte und frisch gewachsenen Bakterienkolonie aus einem 1,5% Agar-Platte (zB Marine-Broth 2216 geschmeidigmentiert mit 1,5% Agar oder ähnliche marinen Bakterien festen Mediums) in 5 ml Bakterien flüssige Medium (beispielsweise Meeres Broth 2216 oder ähnlichen marinen Bakterien Medium).
- Wachsen die Bakterien bis zur stationären Phase auf einer Rolltrommel oder Schüttler (~ 12 bis 36 Stunden, abhängig von dem Bakterium). Planen der Versuch, daß das Bakterium der stationären Phase (~ 10. AUGUST - 10. SEPTEMBER cfu / ml) erreicht zur gleichen Zeit, dass die Algenzellen haben die frühen exponentiellen Phase (~ 10 4 Zellen / ml) erreicht.
- Mit einer Pipette waschen unten keine Biofilm in das Teströhrchen in das Medium angebracht. Pipette 1 ml der gut gemischten Bakterienkultur in ein steriles 1,5 ml Mikroröhrchen. Zentrifuge für 1 min bei 14.000 x g.
- Entfernen und entsorgen Sie den Überstand (bakterielle Medien), ohne dass der Pellet (Bakterienzellen). 1 ml der sterilen Algen Medien (zB L1 oder ähnlich) zu dem Mikroröhrchen (mit Pellets). Vortex Mikroröhrchen zu Pellets in Algenmedium zu resuspendieren.
- Zweiten Wasch:wiederholen Sie Schritt 3.5.
HINWEIS: Es ist wichtig, um die Bakterienzellen mit Algenmittel waschen, um vor dem Impfen der Algen mit ihnen gründlich entfernen Sie alle bakteriellen Medien, Zelltrümmer, ausgeschieden Proteinen und kleinen Molekülen aus den Zellen, da dies die Nährstoffzusammensetzung ändern die Algenmedium oder einzuführen bioaktiver Moleküle auf den Bildschirm. - Seriell verdünnt den gewaschenen Bakterienzellen in Algen Medien bis zu einer Endkonzentration, die 100-fach konzentrierter als die gewünschte endgültige Konzentration der Bakterien (cfu / ml) ist. Speichern Sie die Mikroröhrchen, die Zellen, die für Schritt 4.2 gewaschen wurden und in Algenmedium verdünnt.
HINWEIS: Planen Sie, das Experiment auf der Grundlage, die eine 1: 1-Verhältnis von Algen, Bakterien auf 0 d. Um diese die gewünschten Anfangsbakterienkonzentration für das Experiment zu tun ist 10 4 KBE / ml, so wird in Schritt 3.7 die ersten Zellen sollten in Serie bis 10 6 cfu / ml verdünnt werden.
4. Vorbereitung Bakterien zum Experimental-Setup
- Bereiten Sie 4 steril autoklaviert Glaserlenmeyerkolben und beschriften: a) "Algensteuerkolben", b) "verdünnt bakterielle Lager Kolben", c) "bakterielle Steuerkolben", und d) "Co-Kulturflasche".
- Verdünnen Sie die Bakteriensuspension aus Schritt 3.7 1:99 mit sterilem Algenmedium auf ein Endvolumen = V B (Schritt 1.4). Machen Sie die Verdünnung im Kolben bezeichnet verdünnten Bakterien Lager (Schritt 4.1).
HINWEIS: In dem vorherigen Beispiel (Schritt 4.2), diese 1:99 Verdünnung ergibt eine Endkonzentration von 10 4 KBE / ml. Swirl Kolben, um Zellen zu mischen. - Pipette V Steuerung (Schritt 1.1) aus der verdünnten Bakterien Lager und steckte es in die bakterielle Steuerkolben.
- Pipette Vcontrol steriler Algenmedium in das bakterielle Steuerkolben (dies ist ein 1: 1-Verdünnung). Swirl Kolben auf Zellen mischen und beiseite stellen für Schritt 7.3.
- Pipette V Co-Kultur aus dem verdünnten Bakterien LagerKanne auf die Co-Kultur-Kolben für Schritt 6.1 Kolben zur Seite.
HINWEIS: Bei der mehreren Co-Kulturen auf demselben Alge auf einmal (das heißt, eine Co-Kultur von zwei verschiedenen bakteriellen Isolate mit einer Kontrolle) ist es erforderlich, neu zu berechnen, V Co-Kultur für jeden Stamm einzeln und dann Schritt 4,5 für jeden Co-Kultur getrennt. Es ist auch notwendig, die V A in Schritt 1.3 berechnet zu erhöhen, um sowohl in der Gleichung 5 gezeigt Kokulturen umfassen:
5. Vorbereitung Algen für Versuchsaufbau
- Vorsichtig mischen den frühen exponentiellen Algenkultur (aus Schritt 2.4) mit einem Weithals-Pipettenspitze, bis die Zellen gut gemischt auftreten.
- Pipette V Steuerung von der Algenvorratsflasche mit dem Algensteuerkolben. Gently Pipette mit einer 10 ml Pipette. Dann im Tages Inkubator senden Sie das Algenvorratsflasche.
- Pipette V control steriler Algenmedium zur Algensteuerkolben (dies ist ein 1: 1-Verdünnung). Schwenken Sie den Kolben und in den Tages Inkubator zu mischen, bis zur Stufe 7.4 benötigt.
6. Vorbereitung Experimental Co-Kultur
- Pipette vorsichtig V Co-Kultur von der Algen Lager Kolben in die Bakterien Co-Kulturflasche mit Schritt 4.5. Zurück Zusammenarbeit Kulturflasche an den Tages Inkubator, bis zur Stufe 7.5 benötigt.
HINWEIS: Die Konzentration der Bakterien in der Bakterienkontrolle sollte die Konzentration der Bakterien in dem experimentellen Kokultur entsprechen. In ähnlicher Weise sollte die Konzentration der Algen im Algenkontrolle der Konzentration von Algen im experimentellen Kokultur entsprechen. Durch die mit den gleichen Ausgangskeim und Algenkonzentrationen kann die Bevölkerungsdichte während des gesamten Experiments verglichen werden.
7. Einrichten Mikrotiterplatten
- Teilen Sie eine sterile 48-Well-Mikrotiterplatte nach Abbildung 1.Beschriften Sie oben äußeren Vertiefungen, die entweder steriles Verdünnungsmittel oder nicht-photo Proben.
HINWEIS: Die Randomisierung der Plattenvertiefungen können für Proben, die am selben Tag durchgeführt werden. Zum Beispiel wird Quadranten 1 in 1 d im Experiment abgetastet werden; die Brunnen, die randomisiert werden sollten, sind B2 - 4 und C 2 - 4. Lassen Sie den Umfang der mit steriler Lösung gefüllt Platte wie in Abbildung 1 dargestellt.
. Abbildung 1: Schematische Darstellung der Probenplatzierung in einem 48-Loch-Mikrotiterplatte Wells zu füllen sind, wie folgt: Spalten 1 und 6, Brunnen A bis F ( 
) Werden mit 1 ml 1x PBS (oder einem anderen sterilen Lösung / Medium gefüllt). Zeilen A und F, Brunnen 2-8 ( 
) Werden mit 1 ml Bakterienkontrolle gefüllt; rows B und E Brunnen 2-8 ( 
) Werden mit 1 ml Algenkontrolle gefüllt; Zeilen C und D, Brunnen 2-8 ( 
) Werden mit 1 ml Co-Kultur. 4, sollte dies im gesamten Platten randomisiert und entsprechend zu kennzeichnen - Die Platte ist in 4 Quadranten (A2, A5, D2 und D5) diese Quadranten jeweils spezifische Probenahme Tage 1 unterteilt. Innerhalb eines jeden Tages werden wir raten Randomisierung der Algenkontrolle ( 
) Und Co-Kultur ( 
) Vertiefungen unter Verwendung eines Zufallszahlengenerators. Beschriften Sie den Deckel über das 1 × PBS und / oder bakterielle Kontrollvertiefungen, um Schattierung Algenkulturen zu verhindern.
- Je 1 ml 1x Phosphatpufferlösung (PBS, pH 7,4) oder einem anderen sterilen Lösung in die entsprechenden Vertiefungen wie in Abbildung 1 dargestellt. Führen Sie diese langsam und mit Vorsicht. PBS wird change die Ionenstärke der Algen- und / oder Co-Kulturmedium, wenn es spritzt in anderen Vertiefungen so sorgfältig behandeln.
- Je 1 ml der Bakterienkontrollkultur in Bohrlöcher bezeichnet Bakterienkontrolle (Abbildung 1). Die bakterielle Kolben wirbeln vor dem Pipettieren jede Platte um bakterielle Absetzen zu vermeiden.
- Wird 1 ml Algenkontrollkultur in Bohrlöcher Algenkontrolle mit einem breiten Mund Pipettenspitze (Abbildung 1) gekennzeichnet. So regelmäßig Swirl das Algenkolben als bakterielle Kolben. Wenn die Alge tendenziell sinken oder schwimmen, wirbeln so regelmäßig wie benötigt wird, um eine optisch einheitliche Kultur zu erhalten.
- Mit einem breiten Mund Pipettenspitze Pipette 1 ml Co-Kultur in die entsprechenden Vertiefungen (Abbildung 1). Schwenken der Co-Kultur-Kolben so regelmäßig wie der Algenkolben.
- Verschließen Sie jede Platte mit Parafilm und in einen Tages Inkubator bei der gewünschten Temperatur und Tageslichtzyklus (18 ° C mit einem 16: 8 Stunden Licht: Dunkel-Zyklus wird häufig verwendet). Stehen Lassendie Platten in der Tages Inkubator, bis Sie sie PAM Messwerte (§ 8) zu nehmen. Stellen Sie sicher, alle Platten sind in der gleichen Richtung ausgerichtet sind, um für eine konsistente Belichtung ermöglichen.
- Nehmen Sie ein 20 ul-Aliquot aus dem PBS, Algen Medien, Algen Lager und Algenkontrolle und Drop Platte auf eine geeignete nicht-selektivem Medium (zB Marine-Broth 2216 mit 1,5% Agar) und Inkubation Platten bei 18 - 25 ° C für 72 h bis auf Verunreinigungen zu testen. Wenn das Wachstum in jeder der Lösungen, die nicht die Bakterien enthalten sollte erscheint, dann werden diese Daten nicht verwendet werden sollte.
- Nehmen PAM Fluorometrie Werte mit Hilfe der verbleibenden Probe aus den Algenkontrolle und Co-Kulturflaschen für die experimentelle 0 d PAM Fluorometrie lesen (siehe Schritt 8.1). Alle anderen 0 d Messungen sollten auch mit den restlichen Algenkontrolle, Bakterienkontrolle und Co-Kultur-Proben durchgeführt werden.
8. Unter PAM Fluorometrie Lesungen ab Lager Proben
- Null die WATER-PAMmit sterilem Algen Medien in einer sauberen Küvette vor der Einnahme von Lesungen 8.
- Je 300 & mgr; l von Algenkontrolle oder Co-Kulturkolben in eine saubere Küvette, die 2,7 ml des gleichen Algenmedium in dem Experiment verwendet. Die Probe und Verdünnungsmittel vorsichtig mit einem breiten Mund Pipettenspitze.
- Abreiben alle Fingerabdrücke von außerhalb der Küvette mit einem Tuch, bevor Sie die Küvette in das Wasser-PAM.
- Zeigen Küvette in WASSER-PAM. Decken Sie die Probe mit der Kappe und lassen Sie es dunkel Anpassung für 3 min. Adaptionszeiten variieren abhängig von den Arten von Algen abhängig und muss für die spezifische Alge in dem Experiment verwendet wird, bestimmt werden. Vermeiden Sie lange Adaptionszeiten (> 20 min), indem WASSER-PAM Lesungen während der Mitte der Nacht-Rhythmus der Algen Tageszentren 16,17.
- Nach Einbruch der Dunkelheit Adaption, schlug F 0-Taste. Wenn Fluoreszenzmesswerte sind vor 3900, verdünnte Probe 1: 1 in Algenmedium. Dark-Anpassung für weitere 3 min und takea neue Lesart. Wenn die F 0 oder F m die Anzeige noch immer über 3900, weiterhin die Probe zu verdünnen 1: 1 in Algenmedium, bis die F 0 und F m Werte unter 3900.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie für diese Verdünnungen bei der Aufnahme endgültige Fluoreszenz Konto: zum Beispiel, wenn der Algenprobe wird im Verhältnis 1: 9 bei der ersten Übertragung von der gut mit dem Verdünnungsröhrchen, dann ist die Algenfluoreszenzmesswert von 500 sollte mit der inversen multipliziert werden der Verdünnungsfaktor (in diesem Fall 10) und der Ist-Fluoreszenz der Schlauch wird dann 5,000. - Nach der Einstellung F 0, werfen Sie einen sättigenden Impuls (SAT-Pulse) Lesung alle 90 Sekunden durch Drücken der TV-Taste, um F m Messungen vornehmen. Das Zeitintervall zwischen den Ablesungen je Algenstamm eingestellt werden. Verwerfen Probe.
- Wiederholen Sie die Schritte 8,1 bis 8,6 für die übrigen Proben.
9. Da PAM Fluorometrie Lesungen von Mikrotiterplatten
- Beschriftung6 sterile Probenröhrchen von> 3 ml Volumen für Brunnen B2 - 4 für die Algenkontrolle und Vertiefungen C2 - 4 für die bakterielle Co-Kultur (siehe Plattenlayout in Abbildung 1).
- Aliquoten 2,7 ml sterile Algenmedium in jedes Röhrchen.
- Die Röhrchen in Tages Inkubator und es ihnen ermöglichen, auf die Temperatur der Alge wurde für 30 Minuten angewachsen akklimatisieren.
- Vor dem Entfernen der Mikrotiterplatte aus dem Inkubator sicher, dass die Lichtdurchlässigkeit in die dunklen gewöhnt Brunnen wird durch Abdecken der Platte mit Aluminiumfolie (oder ähnlich), nur entfernen Sie die Folie, während aktiv Übertragung Kultur aus den Vertiefungen zu den Verdünnungsröhrchen (Schritte 9.5 beschränkt - 9.7).
- Aseptisch mischen die erste Mikrotiterplatte (gut B2) mit einem breiten Mund Pipettenspitze durch langsames Auf- und Abpipettieren.
- Besorgen Sie sich die Verdünnungsröhrchen aus dem Inkubator und aseptisch Transfer 300 ul von gut B2 (Abbildung 1) zu dem entsprechenden Probenröhrchen mit einem breiten Mund Pipettenspitze (dies ist eine 1: 9 Verdünnung der Probe in Algenmedium).
- Wiederholen Sie die Schritte 9,5-9,6 für die restlichen Bohrlöcher (B3,4 und C2 - 4).
- Bedecken Sie Probenröhrchen mit Aluminiumfolie und bringt sie zu den Tages Inkubator, bis sie zur WASSER-PAM.
- Führen Sie WASSER-PAM Messwerte wie in den Schritten 8.1 - 8.7. Verschließen Sie die Mikrotiterplatte mit Parafilm vor der Rückgabe an den Inkubator.
- Die Messungen in festgelegten Zeitintervallen für die Dauer des Experiments. Die Frequenz und die Länge der Probenahme sollten zu Beginn des Experiments geplant werden.
10. Versuchsbeispiel
Die Probe Experiment ist eine 10 Tage Co-Kultur eines Bakteriums (Phaeobacter gallaeciensis BS107) und Mikroalgen (Emiliania huxleyi Stamm (CCMP3266)). Er enthält einen Algenkontrolle, bakterielle Kontrolle, und eine bakterielle Algen experimentellen Kokultur.
- Berechnen Sie Volumen von Bakterien- und Algenbestände erforderlich (Schritt 1.1-1,4)
- Vorbereiten des Algen Lager, eine V A von 40 ml, durch Inokulieren 4 ml Alge in 36 ml Medium inkubiert und bis zum frühen exponentiellen Wachstums bei einer Zelldichte von ~ 10 4 Zellen / ml (Schritte von 2,1 bis 2,4) erreicht.
- Vorbereiten des bakteriellen Lager Kolben durch Verdünnen 400 ul der 10 6 cfu / ml Bakterien in Abschnitt 3 zu einer V B von 40 ml mit Algenmedium erhalten (Endkonzentration von Bakterien 10 4 cfu / ml).
- Über Hälfte (20 ml) des bakteriellen Lager an die bakterielle Steuerkolben und 20 ml Algen Medien, um die Bakterienbekämpfung zu machen. Über Hälfte (20 ml) der Algen Lager an die Algensteuerkolben und 20 ml Algen Medien bilden das Algenkontrolle (Abschnitt 5). Übertragen Sie die restlichen 20 ml der Bakterien Lager an die Co-Kultur-Kolben und mit den restlichen 20 ml Algen Lager mischen, um die Co-Kultur zu etablieren (Abschnitt6).
- Pipettieren 1x PBS (pH 7,4), Steuerelemente und die Co-Kultur in zwei voretikettierten Mikrotiterplatten (Abbildung 1), 1 ml pro Vertiefung. Verwenden Sie 3 ml der verbleibenden Kontrollen und Co-Kulturen auf 0 d Messungen (Keimzahl, WASSER-PAM (§ 8), mikroskopische Beobachtung von Algenzellmorphologie und Algenzellfixierung für die Durchflusszytometrie) stellen.
- Nehmen Sie WASSER-PAM Lesungen für die Algenkontrolle und Co-Kultur einmal täglich für 10 d, und immer zur gleichen Zeit wie die 0 d Messungen wurden (§ 8) übernommen.
11. Andere Parameter von Interesse
- Bestimmen bakterielle KBE-Konzentration: führen Sie eine serielle Verdünnung der Bakterienkontrolle und Co-Kultur in sterile 1x PBS (oder ähnlich), dann fallen Platte auf die Marine Broth 2216 mit 1,5% Agar (oder ähnlich) ergänzt und beobachten Sie die Anzahl der KBE, die wachsen die bakteriellen CFU / ml für jede Vertiefung 18 bestimmen.
- Zur Bewertung der Algenzellkonzentration: fix Algenkontrolle und ZusammenarbeitKultur mit einer 0,15% igen Endkonzentration von Glutaraldehyd. Inkubieren für 10 Minuten im Dunkeln, dann Flash Einfrieren in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. Bearbeiten Sie alle Proben mit einem Durchflusszytometer (FACS Calibur oder ähnliches) zu Algenzellen zu zählen.
- Beachten Algenzellmorphologie: Algenkulturen und Bakterien-Algen-Co-Kultur mit Hilfe der Mikroskopie (dh die Lichtmikroskopie, Epifluoreszenz, oder ähnliches).
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Representative Results
WASSER-PAM Fluorometrie Lesungen.
WASSER-Puls-Weiten-Modulierte (PAM) Fluorometrie ist eine schnelle und effiziente Methode, um die Fluoreszenz (stellvertretend für Chlorophyllgehalt) und photosynthetische Ausbeute (PSII Gesundheit) von Algenkulturen zu bestimmen. Die PAM WinControl Software generiert eine Tabelle der Rohdatenwerte für (die folgenden sind die grundlegenden Parameter für dunkle angepasst Algenproben):
F 0 = Fluoreszenz dunkeladaptierten Zellen
F m = maximale Fluoreszenz nach sättigenden Leuchtdioden (LED) Puls
F v / F m = (F m F 0) / F m = potenziellen Quantenausbeute eines dunklen angepasst Probe 19
PAM Fluorometrie ist vielseitig einsetzbar und kann eine Menge an Informationen über das Photosystem und die Gesundheit der al gebengae. Darüber hinaus gibt es andere Parameter, die wichtig sind bei der Prüfung Licht angepasst Proben. Weitere Lektüre diese werden im Detail in dieser Bewertungen 13,16,20-23 diskutiert. Diese Daten können in eine Tabellenkalkulation oder Graphik-Software übertragen werden, um Diagramme der anfänglichen Algen Fluoreszenz (F 0), die maximale Algen Fluoreszenz (F m), und das Potential Quantenausbeute (F v / F m; 2 und 3) zu erzeugen, . Die Graphen in Figur 3 zeigen, wie die Algen Fluoreszenz und F v / F m sind von dem Bakterium durch Vergleichen der Alge allein (Kontrolle) gezüchtet, es beeinflußt die mit dem Bakterium in Co-Kultur in der 10-Tage-Kokultur Experiment gezüchtet (3C). In diesem Beispiel wurde ein Zwei-Stichproben-t-Test verwendet, um die Parameter statistisch zwischen den beiden Behandlungen an jedem Tag zu vergleichen. Ähnlich wird für Experimente, in denen mehr als zwei Anwendungen vorhanden sind, eine ANOVA konnteverwendet werden. Die F m Lesen (3B) wird direkt nach dem Sättigungs LED Impuls, dh die primäre PSII Elektronenakzeptor QA vollständig reduziert und kann keine mehr Elektronen aus dem PSII Reaktionszentrum P680 nicht akzeptieren, und als solche sind alle Reaktionszentren "genommen geschlossenen "17. Dies behindert die photochemische Verwendung von Lichtenergie, wodurch die Fluoreszenzemission auf ein Maximum. Dies ergibt dann die maximale Fluoreszenz (F m) Lesen. 3C zeigt einen dramatischen Rückgang in PSII Gesundheit zwischen 5 d und 10 d, wenn co-kultiviert mit dem Bakterium im Vergleich zu allein wächst (Kontrolle). Die Standardfehlerbalken sind aus Dreifach Mikrotitervertiefungen, die unabhängigen Experimenten von den gleichen Eltern Bakterien und Algenkulturen sind abgeleitet. Die durchweg kleine Standardfehler bestätigt die Robustheit und Reproduzierbarkeit der Mikrotiterplatten-Format für Algen Biotests denn sie ermöglicht unabhängigen Experimenten als repli verwendet werdenkate und beseitigt die Notwendigkeit, das Versuchsgerät über die Dauer des Experiments unterabzutasten.
Abbildung 2. Repräsentative WATER-PAM Fluorometrie Graphen einer 140 d Wachstumskurve von axenischen Emiliania huxleyi (CCMP3266). (A) Messwerte für die Anfangsalgen Fluoreszenz (F 0), (B) höchstens Algen Fluoreszenz (F m) und ( C) Potenzial Quantenausbeute (F v / F m) für E. huxleyi sind als schwarze Kreise dargestellt. Die Ausgleichsgerade für F 0 und F m war normal log 3 Parameter (SigmaPlot) R 2 = 0,94, 0,95 beziehungsweise. Potential Quantenausbeute (F v / F m) ist eine dimensionslose Ausdruck photo Gesundheit, die wie folgt berechnet wird (F m 0 - F) / F m. Die Ausgleichsgerade für die F v / F m Kurve war ein 3-Faktor Polynom R 2 = 0,6. Fehlerbalken stellen den Standardfehler von drei Vertiefungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Repräsentative WASSER-PAM Fluorometrie Graphen einer 10 d Cokultivieren Experiment Emiliania huxleyi (CCMP3266) mit Phaeobacter gallaeciensis BS107. (A) Die erste Algenfluoreszenz (F 0), (B) maximal Algenfluoreszenz (F m) und (C) Potenzial Quantenausbeute (F v / F m) für contro grafisch dargestelltmit einem Bakterium, (schwarze Kreise) l Algen (offene Kreise) und Algen co-kultiviert. Potential Quantenausbeute (F v / F m) ist eine dimensionslose Ausdruck photo Gesundheit, die wie folgt berechnet wird (F m 0 - F) / F m. Fehlerbalken stellen den Standardfehler von drei Vertiefungen. Ein Sternchen (*) bezeichnet Tage, an denen die Parameter für die Steuerung und Cokultur Behandlungen unterschieden sich signifikant. Unterschiede zwischen den Behandlungen für alle Tage waren nicht signifikant mit Ausnahme der 10 d in allen drei Parametern (10 d - F 0: t-Test, df = 2,5, t-Verhältnis = -15, p = 0,0017 *; F m: t- Test, df = 2,1, t-Verhältnis = -16,15, p = 0,003 *; F v / F m:. t-Test, df = -18,68, t-Verhältnis = 2,0, p = 0,0028 *) Bitte klicken Sie hier zur Ansicht eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Algenwachstum in Miniaturformat.
Die Miniaturisierung der Algenkulturen zu einer 1 ml Kulturvolumen in einer Mikrotiterplatte ermöglicht die Replikation innerhalb eines Experiments erhöht werden. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Alge ist im gesamten Experiment gesund; führen eine Wachstumskurve (Figur 2), unter Verwendung des Mikrotiterplatten-Format, um verschiedene Algenmittel daraufhin überprüfen, den Nahrungsbedarf der Alge erfüllt sind. Darüber hinaus kann es wichtig sein, die Tagesgang (helle und dunkle Perioden) und Temperatur zu optimieren. Proper-Optimierung für eine bestimmte Algen kann für die Erhaltung gesunder Algenkulturen zu Spitzen Fluoreszenz für 26 d und zur Erfassung von potentialQuantenAusbeute nach 140 Tagen (Abbildung 2) zu ermöglichen.
Die Minimierung Verdunstungseffekte.
Es ist wichtig, um die Verdampfungseffekte der Flüssigkeit basierende Tests als "Kanteneffekt" zu minimieren, ist üblicherweise observed wo es eine größere Verdampfung in Vertiefungen am Rand der Mikrotiterplatte als in Vertiefungen in Richtung der Mitte der Platte befindet. Während die Verdunstung an der Kante von Platten beobachtet worden sind, führt die Verdampfungsgeschwindigkeit nicht die Versuchsdauer als gesunde Algenkulturen zu begrenzen, mit Peak-Fluoreszenz bei 26d in dieser Form gehalten ist (Figur 2). Um mögliche "Randeffekt" zu minimieren, 1x PBS (pH 7,4), oder einem anderen sterilen Lösung wird in die Vertiefungen an allen vier Kanten (Spalten A und H, die Zeilen 1 und 6, Figur 1) aliquotiert.
Beleuchtung in einem Tages Inkubator.
Mikrotiterplatten sollten alle die gleiche Ausrichtung in der täglichen Inkubator. Zum Beispiel, in der Längsausrichtung der Mikrotiterplatten in einem Inkubator bedeutet, daß die Platten entlang der kurzen Achse angeordnet. Wenn diese Orientierung wird verwendet, Algenkulturen entlang der langen Achse BG (Abbildung 1) kann Experiencea leichten Licht und Temperaturgradienten aufgrund der Variation in Abstand von der Lichtquelle (die Glühbirne ist eine Quelle von Licht und Wärme). Dies wurde beobachtet, dass Temperatur-Assays auf Algen am äußersten ihrer Temperaturbereich beeinflussen. Folglich ist es unwahrscheinlich, um die meisten Algen ihre optimale Temperatur aufgewachsen beeinflussen. Um die Auswirkungen dieses Licht und Temperaturgradienten zu minimieren gewährleisten, dass größere Flaschen nicht schaffen Schattierung, Ort Platten in einem konstanten Abstand von den Lichtern, Schatten Tuch verwenden, um die Lichtstärke bei Bedarf zu reduzieren und überprüfen Sie die Lichtintensität über der langen Achse der Tages Inkubator, um sicherzustellen, dass es gleichmäßig fährt.
Dunkeladaptation von Algenproben für WASSER-PAM Fluorometrie.
Vor der Durchführung WASSER-PAM Lesungen ist es wichtig, dunkel passen die Algenproben, so dass die PSII Reaktionszentren sind vollständig geöffnet und die lichtinduzierte transthylakoidal pH-Gradienten vollständig abgeführt wird, thuns einen wirklichen F o und F m-Werte, von denen F v / F m zu berechnen. Abtasten der Alge aus dem Test für WASSER-PAM-Messungen in der Mitte der Dunkelphase des Tageszyklus (dh für eine 16: 8 Stunden Licht: Dunkel-Zyklus würde ein 2 h Verkostung von T (dunkel durchgeführt werden) = 3-5 h) macht Dunkeladaptation Zeit kürzer (3-5 min) gegenüber der Mitte des Lichtzyklus (T (hell) = 7-9 h) bei Dunkeladaptation ist länger (> 20 min) 17. Dunkeladaption Zeit des Alga wird auch in Abhängigkeit von der Algenarten, Wachstumsbedingungen und die Lichtverhältnisse von ihrem natürlichen Lebensraum Bereich abhängig.
Empfindlichkeit des WATER-PAM Fluorometrie Lesungen.
Die WASSER-PAM wurde entworfen, um eine hochempfindliche Fluorometer zum Aufspüren von F, F 0 und F m vom niedrigen Chlorophyll Proben wie Ozeanoberfläche Wasser 16 sein. Folglich ist es ideal, um eine miniaturisierte geeignettigten Bioassay, wo Proben können verdünnt werden. Aufgrund dieser Empfindlichkeit ist es wichtig zu verstehen, dass das Wasser-PAM-Maschine hat einen oberen Grenzwert von Fluoreszenzmesswerte (dh F, F 0 und / oder F m), wenn die Probe nicht ausreichend verdünnt (Abbildung 4). Innerhalb der Software WinControl die Maximalwerte sind zunächst spürbar nach Drücken F 0 und das Lesen der F 0 (direkt nach Dunkeladaptation). Folglich ist die F und F m sind auf den maximalen Wert 4.056 (Abbildung 4, Nr. 2286). Die Maximalwerte von F und F m abhängig von der Art des Algenmedium, das verwendet wird, um das Wasser-PAM kalibrieren, aber Proben oberhalb der Nachweisgrenze kann leicht identifiziert werden, weil wiederholte Messungen mit demselben Maximalwert auf, bis die Probe ausreichend verdünnt . Nach einer 1: 1-Verdünnung in Algenmedium ist, desto weniger konzentrierte Probe dunkeladaptierten wieder und der F 0 Messung wurde wiederholt. Der F-Wert einppears korrekt gemessen werden, aber die F m ist immer noch das Lesen der Maximalwert 4056 (Abbildung 4, Nr. 2287). Diese Probe wurde erneut im Verhältnis 1: (. 4, Nr 2288) 1 in Algen Medien wieder und dunklen weitere 3 min angepasst, bevor sie eine weitere F 0 Lesen und gültige Messwerte erhalten wurden, so dass die nächste Messung (F) aufgenommen wird und die F v / F m Berechnung gültig ist. 1-Verhältnis mit dem Medium, die in die Berechnung von F m und F 0 berücksichtigt werden müssen: In diesem Beispiel wurde die Probe zweimal in 1 verdünnt. Es ist wichtig, dass die F v / F m, als eine direkte Funktion der F 0 und F m, falsch berechnet, wenn die Proben zu, obwohl sie eine dimensionslose Ausdruck der photo Gesundheit konzentriert.
Abbildung 4. WinControl Darstellung mehrerer WASSER-PAM Fluorometrie Lesungen eines Algenprobe sequentiell verdünnt, um die korrekte Verdünnung zu erzielen. Diese Zahl zeigt die Algenfluoreszenzmesswerte an der oberen Grenze des WATER-PAM-Maschine (rotes Feld), und solche, bei denen ein geeignete Verdünnung der Probe erreicht ist (green box). Darüber hinaus zeigt diese Figur einige der anderen Variablen, dass diese Methode berechnet, aber diese sind hier nicht im Detail diskutiert (siehe Bewertungen 13,16,20-22). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Eine bakterielle Kontamination.
In aller Algen Experimenten sind Algenkontrollen erforderlich als Grundlinie von Algen Gesundheit, so ist es unerlässlich, dass dieser frei von bakterieller Kontamination während des gesamten Experiments. Verunreinigung durch Bakterien erfolgt leicht, da es keineSelektion (zB Antibiotika) und die Photosynthese produziert ständig neue organischem Kohlenstoff für das Bakterienwachstum. Die zwei wichtigsten Wege, um Verunreinigungen zu vermeiden ist, um die Sterilität aller Lösungen (zB Algenmedium, 1x PBS, pH 7,4) und Geräte bei T = 0 d des Experiments und aseptisch zu halten, während der Handhabung der Mikrotiterplatten zu gewährleisten. Das Experiment auf Verunreinigung zu jedem Zeitpunkt durch Plattieren eines 20 ul Aliquots von allen Algenkontrollvertiefungen beobachtet werden. Wird eine Verschmutzung von einer der Algenkontrollvertiefungen beobachtet dann jene WATER-PAM Fluorometrie Ablesungen sollte bemerkt und aus der Datenanalyse ausgeschlossen werden. Wenn eine Lösung verwendet werden, um das Experiment bewirkt, dass die gesamte Experiment, die kontaminiert sein, so entsorgen Sie das Experiment und alle kontaminierten Reagenzien und erneut zu starten. Die Bakterienkontrollen und bakterielle Algen Co-Kulturen können auch verunreinigt werden und Agar-Platten für bakterielle Keimzahl verwendet werden, sollten für eine alternative Kolonie morphol überwacht werdengien. Well-to-gut kann eine Kreuzkontamination beim Entfernen der Mikrotiterplatte Deckel, wird aber nicht einfach durch Kippen oder Schütteln der Platten und Anwendung aseptischer Techniken in einer Sterilbank oder in der Nähe einer Flamme vermieden auftreten.
Zukünftige Anwendungen.
Dieses kleine Volumen Bioassay stellt ein schnelles Screeningverfahren zur Mikroalgen durch Kombinieren einer Mikrotiterplattenformat mit Wasser-PAM Fluorometrie. Beispiele für zukünftige Anwendungen sind vielfältig, und konnte Imaging PAM Fluorometrie, die Einblick in die Zell-Zell-Variante des PSII Gesundheit bietet innerhalb einer Population, wie es PAM Fluorometrie an Einzelzellen 24 führt sind. Der Bioassay kann auch mit Mikroskopie kombiniert werden und Durchflusszytometrie, wie zuvor diskutiert. Eine weitere Verbindung mit der Möglichkeit, zusätzlichen Einblick bereitzustellen Zellfärbung für die Durchflusszytometrie und Mikroskopie morphologische Variation innerhalb Subpopulationen der Algenkultur aufzuklären.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cu. ft. Diurnal incubator (6012-1) | Caron Corporate | 112310-6012-1-11 | www.caronproducts.com |
| Nunc EasYFlask 25 cm2, Vent/Close Cap, 7 ml working volume, 200/cs | Thermo Fisher Scientific | N156340 | www.fishersci.ca |
| Multiwell TC Plates – 48-well | BD Biosciences Discovery Labware | 353078 | www.bdbiosciences.com |
| P1000 Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F123602 | www.mandel.ca |
| P10mL Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F161201 | www.mandel.ca |
| Wide Orifice Tips nonsterile [100–1,250 µl] | VWR International | 89079-468 | www.ca.vwr.com |
| Ultrafine Tips nonsterile [100–1,250 µl] | VWR International | 89079-470 | www.ca.vwr.com |
| Finntip 10 ml [Vol: 1 - 10 ml] | Thermo Fisher Scientific | 9402151 | www.fishersci.ca |
| WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED) | Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany | EDEE0232 | www.walz.com |
| 15 mm diameter quartz glass cuvette (WATER-K) | Caron Corporate | www.caronproducts.com | |
| Sodium chloride (crystalline/certified ACS), Fisher Chemical | Thermo Fisher Scientific | Thermo Fisher Scientific | www.fishersci.ca |
| BD Difco Marine Broth 2216 | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| BD Bacto Agar | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| L1 Medium Kit, 50 L | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | www.ncma.bigelow.org |
References
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