Introduction
Потеря дофаминергических нейронов из черного вещества Парс компактов приводит к симптомам кардинал моторных болезни Паркинсона (БП), второй наиболее распространенной нейродегенеративное заболевание. Основная причина гибели этого мезенцефалической нейронов населения, не известно. Для изучения биохимических путей, ответственных за разработку и модуляции нейрофизиологические свойства и выживание Mesda нейронов, несколько клеточной культуры и животных модельных систем были использованы. Иммортализованные клеточные линии, в том числе линии клеток 1RB крыса дофаминергической 3 Н. 27 (N27), в человеческий дофаминергической линии клеток нейробластомы SH-SY5Y, мыши дофаминергической линии гибридных клеток MN9D и человек теменной LUHMES клетки были использованы для биохимических и ограниченных механистических исследований 1 -5. Для изучения конкретной потери Mesda нейронов, несколько нейротоксин основе и генетические модели были разработаны 6-8. Основные брюшной среднего мозга культур, Является необходимым инструментом для изучения нейронов и синапсов свойства дофаминергических нейронов и путей, вовлеченных в патогенез этого общего беспорядка.
Здесь мы представляем подробный протокол для выделения среднего мозга дофаминергических нейронов, которая содержит изменения, приводящие к высокой живучести и увеличению выхода покровные в зачаточном состоянии. Использование преждевременного среднего мозга E12.5 мыши (E14.5 у крыс) повышает живучесть. В этом возрасте нейроны не разработали аксоны еще, что покидает клетки, неповрежденные во время вскрытия и сводит к минимуму стресс, тем самым, значительно повышая жизнеспособность. Кроме того, тщательное вскрытие брюшной мозга, как описано в разделе 2 настоящего Протокола, еще больше повышает живучесть. Для увеличения числа покровные в зародыше, альтернативный способ покрытия представлены в разделе 4 настоящего Протокола. Это приводит к выходу до 10 покровные в эмбрионе, по сравнению с 4 по покровныеСтандартные условия металлизации, таким образом, уменьшая количество животных в эксперименте.
Нейроны в культуре выставочная вырост аксонов и dentrites, образуют синаптические соединения и выявить наличие нейронов и синапсов маркеров делает эти культуры подходит для живого изображения клеток, иммуноцитохимических и электрофизиологических исследований. Кроме того, использование нейронных культур способствует генетической и фармакологической манипуляции. Вырост нейритов от 2 дня в пробирке позволяет исследованиях развития. Кроме того, долгосрочное выживание культур (до шести недель) делает их пригодными для исследования медленной, прогрессирующей дегенерацией этих нейронов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Животных содержали и обрабатываются в соответствии с ведомственным руководящим принципам и всех процедур животных были утверждены благосостояния животных в Имперском колледже и Этическая экспертиза тела (AWERB) и Home Office и Гарвардский университет Уходу за животными и использованию комитета (IACUC), в соответствии с федеральными и местными нормами.
1. Реагент и настройка оборудования
- Оттепель, аликвоту и магазин 1 решение мг / мл Ламинин при -80 ° С. Растворить 2 мкл в 1 мл DMEM / F12, в результате чего концентрации покрытия 1-2 мкг / см 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оттепель Ламинин медленно на льду и растворить в холодной DMEM / F12 и сразу же добавить его в пластинами / покровные. - Развести 75 мл 0,01% поли-L-орнитина в 425 мл PBS и хранить при температуре 4 ° С.
ПРИМЕЧАНИЕ: Срок годности рабочего раствора до одного месяца. - Растворите 25% (вес / объем) BSA в PBS, рН 7,4, и хранят при температуре 4 ° С на срок до одного уеAR.
- Подготовка 50% FBS (в HBSS) деактивации СМИ.
- Подготовка полной среды путем добавления 50 ед / мл пенициллина и стрептомицина, 1 N2 добавки, 5% (об / об) ФБС, 0,36% D - (+) - глюкозы (вес / объем), 0,25% БСА (вес / объем), чтобы DMEM / F12 и хранить при 4 ° С.
ПРИМЕЧАНИЕ: Срок годности до 10 дней. - Место покровные в кипящей 70% (об / об) этанола в течение по крайней мере 30 минут, чтобы удалить все следы жира и автоклав.
- Место покровные в 24-луночных планшетах и добавить 500 мкл поли-L-орнитин раствор ли в каждую лунку. Инкубируют 1 час под капот культуры ткани при комнатной температуре, а затем, промыть 3 раза 500 мкл воды. Добавить 500 мкл раствора ламинин к каждой пластине и инкубировать O / N в увлажненной инкубаторе для тканевых культур при 37 ° C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пока никаких моет не нужны после лечения ламининовым, мыть поли-L-орнитин менее чем в три раза приводит к смерти клеток через 24 ч после культивирования. - Польский советы стеклянных пипеток более природного газа горелки или Fхромой.
Примечание: После этой стадии диаметр наконечника должен быть около половины своего нормального размера. - Вырезать колпачки 1,5 мл микропробирок, используя в автоклаве ножницы и автоклав.
2. Препарирование эмбрионального Брюшной мозга
- Наркотизировать приурочен беременных (E12.5), сооружаемых CO 2 ингаляции, а затем усыпить путем смещения шейных позвонков.
- Спрей живота с 70% этанола и сделать брюшной разрез до тех пор, маточные мешки не все подвержены. Использование щипцов сократить влагалища привязанность и удаления матки. Поместите матки в ледяной HBSS, в 100 мм чашки Петри.
- Удалить эмбрионов из матки и амниотической, с помощью пинцета (рис 1в). Место эмбрионов в пресной ледяной HBSS.
ПРИМЕЧАНИЕ: прямоугольник на рисунке 1D показывает местоположение эмбрионального брюшной мозга. - Поместите эмбрионы Под микроскопом рассечение (10x) и анализировать среднего мозгаарки, сокращая мозг на перешейке и теменной-диэнцефальных граничной области, используя bioscissor и щипцы (рис 1E, пожалуйста, обратитесь к рисунку 1А для линий разреза).
- После изъятия весь средний мозг, сделать разрез в mediodorsal мозга (рис 1F).
- Удалить мозговые оболочки, с использованием двух щипцов (рис 1H).
ПРИМЕЧАНИЕ: Важным шагом: Этот шаг необходим для оптимального нейронов урожайности и выживания. Поскольку условия культивирования являются оптимальными для клеток головного мозга, большинство клеток от окружающей ткани умирают после посева и апоптоза сигнал от этой ткани может привести к повреждению целостности культур. - Свести мозга ткани на чашку Петри наблюдать форму бабочки и сократить примерно половину каждого крыла, используя стерилизованный нож для бритья (рис 1Н, I).
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1J изображает изолированный вентральной средний мозг. - Перевестичасть вентральной мозга в ледяную HBSS в 15 мл коническую трубку и перейти к следующему эмбриона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2.1-2.8 не должна занимать более 1 ч. Хранение эмбрионов за этот период времени на льду значительно снижает жизнеспособность клеток.
3. Диссоциация Брюшной мозга клеток
- Передача части брюшной мозга под капотом ламинарного потока. Снимите HBSS и добавить 1 мл подогретого (37 ° C) 0,05% трипсин-ЭДТА в конической трубе (объемы достаточно до 12 штук брюшной мозга). Инкубируйте ткани на 37 ° С в течение 5-10 мин.
- Удалить трипсин-ЭДТА под капотом и добавить 1 мл среды де-активации (сыворотка будет отключить трипсин) в ткани.
- Снимите деактивации среды и промыть ткань в 1 мл полной среды в два раза.
Примечание: Не все удаления среды из трубки и пипетки ткани, чтобы предотвратить отбрасывание диссоциированных клеток. - Добавить 1 мл полной среды и Тритуратов ткани с огневой полировкой стеклянной пипетки. Избегайте образования пузырьков и продолжить растирания до суспензии отдельных клеток не достигается.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно, 8-10 проходит через ограниченное наконечника требуются для полной диссоциации. - Центрифуга клетки при 400 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре и удалить носитель.
- Повторное приостановить осадок в 1 мл полной среды, медленно пипетки вверх и вниз на срок до четырех раз.
4. Покрытие Брюшной мозга Клетки
- Смешайте 10 мкл клеточной суспензии с 90 мкл раствора трипанового синего и подсчитывают число клеток с помощью гемоцитометра.
Примечание: Жизнеспособность клеток может быть также проверена на данном этапе. - Поместите стерилизовать крышки трубки микроцентрифужных в 100 мм чашки Петри и передачи / покровные Ламинин покрытые поли-L-орнитин, с помощью пинцета, по одному на верхней части крышки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не мойте покровные и избежать высушивания ламинином, так как это может привести к uneveп культур и снижение выживаемости клеток. - Настройка громкости в 1500 клеток на 1 мкл добавлением полной среды и добавить 100 мкл (всего 150000 клеток) клеточной суспензии в верхней части каждого покровное (объем является оптимальным, чтобы покрыть поверхность покровного стекла без утечки). Закройте чашки Петри и инкубируют их в течение 1 часа в увлажненной инкубаторе тканевых культур (37 ° C, 5% CO 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Важным шагом: Этот шаг необходим для повышения привязанность и жизнеспособности клеток и увеличение количества покровных в зачаточном состоянии. С другой стороны, клетки могут быть перенесены непосредственно в лунки, содержащие (покровные), но количество клеток должно быть увеличено до 350000 на лунку (вместо 150000). Другими словами, с помощью этого метода, 8-10 покровные могут быть приобретены, в то время как прямая передача дает около 3-4 покровные из-за клеток, которые прикрепляются к пластинам (рядом или под покровные). Средняя viabiliти культур, используя этот метод был около 90%.
5. Культура роста и поддержания
- После 1 ч инкубации, тщательно передачи покровные в том числе среды в 24-луночных планшетах, содержащий 400 мкл предварительно нагретой (до 37 ° С) в полной среде (общий объем: 500 мкл). Инкубируйте клетки O / N на 37 ° C.
- В 24 ч после инкубации в лунки осторожно добавить 500 мкл полной среды в каждую лунку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Первые несколько часов является наиболее важным этапом для выживания дофаминергических нейронов и количества выживших клеток существенно не изменится после этой точки. - Не следует добавлять дополнительное СМИ к культурам в течение первых двух недель или до среда становится желтым. Если культивирования в течение более чем двух недель или средних цвет меняется на желтый, обмен половина средств массовой информации (500 мкл) со свежими полных подогретого СМИ (как правило, каждые две недели).
ПРИМЕЧАНИЕ: дофаминергических нейронов в пределахкультуры были бы выжить в течение более чем 6 недель в этих условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Иммуногистохимическое против тирозин гидроксилазы (TH) показывает, что между 0,5-1% клеток в культуре дофаминергических. Нервные прогнозы появляются в течение 2 ч после посева и в первый день, аксоны и дендриты различимы (рис 2), используя Тирозингидроксилаза (TH) и ассоциированный с микротрубочками белка 2 (map2) антитела (рисунок 3). Нейроны выжить в течение более шести недель, и показать огромный нарост. Отношение нейрон-глиальных культур в напрямую связана с концентрацией сыворотки в среде, как было показано ранее. В то время как устранение FBS из культур может дать относительно чистые культуры нейронов, мы и другие обнаружили, что добавление сыворотки увеличивает выживаемость дофаминергических нейронов в культуре 9.
Рисунок 1. Порядок выделенияэмбриональных вентральной среднего мозга. схематический вид E12.5 мозга мыши, среднего мозга границы (пунктирные линии), и приблизительное положение области интереса, вентральный средний мозг, в красный прямоугольник (а) и инструментов для вскрытия брюшной мозга , bioscissor, foreceps, и держатель лезвия (В) показаны. Эмбрионы извлекают из амниотической оболочки путем разрыва его (С). Область интереса, брюшной мозга, показана прямоугольником (D). Мозга выделяют за счет сокращения на перешейке (слева от разреза куска) и среднего мозга, передний мозг границы (справа; E). Mediodorsal часть мозга режется (F) и она уплощена, чтобы походить на бабочке (G, H). Затем мозговых оболочек отделен от головного мозга (H) и вентральной мозга (прямоугольник) выдел ют из спинной части, отрезав половину крыльев, с помощью лезвия для бритья
Рисунок 2. Представитель светлого изображения брюшных среднего мозга культур. Изображения были приняты на Div1 (слева), div2 (в центре) и DIV15 (справа). Масштабная линейка:. 50 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. Длительное выживание, следствием процессов и синапсов в две недели OLD брюшной среднего мозга культур. мозга дофаминергических нейронов, которые были определены Тирозингидроксилаза антитела расти обширные аксоны и дендриты, выявленных map2 антитела, в вентральной среднего мозга культур через две недели после диссоциации от эмбрионов E12.5. Дендриты можно отличить по перекрытию й и map2-позитивных процессов, где только че-положительных волокон представляют аксоны. Антитела были использованы в разведении 1: 200. Масштабная линейка:. 20 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Дофаминергических нейронов в мозге, являются основным источником допамина в центральной нервной системе. Они делятся на три группы, черного вещества Парс компактов (SNPC), вентральной области покрышки (VTA) и retrorubral поле (СБР) 10, 11. Нейроны в SNPC и ВТА привести к основными путями дофаминергических, мезокортикальных, мезолимбических и Nigro-полосатой, участвующих в таких функциях, как контроль над эмоциями, мотивацией и поведением двигателя. Гибель нейронов в SNPC и функционального нарушения нигростриатной системы является основным патологическим характеристика второго наиболее известных нейродегенеративное расстройство, болезнь Паркинсона (PD) 12,13. Текущие терапевтические подходы решения симптомы заболевания и не остановить или замедлить дегенерацию и причины медленного, прогрессирующей потерей клеток до сих пор неизвестно 14-16. Таким образом, развитие в естественных условиях и в пробирке методов для изучения developmental, биохимические и физиологические характеристики этого нейронов населения необходимо для понимания этиологии PD и развитию новых терапевтических подходов.
Здесь мы опишем оптимизированный метод для вскрытия, диссоциации и культивирования первичных нейронов из эмбриональных мышей и крыс брюшной мозга, что приводит к долгосрочной перспективе в пробирке выживания дофаминергических нейронов из этого региона, что позволяет изучение процессов, таких как дифференциация аксонов следствием и формирование синапса. Несколько преимуществ данного протокола включают увеличение числа покровные в зародыше, независимость от факторов роста и продолжительность выживания в пробирке, максимизируя развитие нейронов 4. Этот метод может дополнять исследования в естественных, позволив для понимания механизмов, лежащих в основе нормальных физиологических функций среднего мозга дофаминергических нейронов, а также прогрессирующей дегенерацией нейронааль население цитотоксических и генетических моделей болезни Паркинсона.
Один из главных недостатков этого протокола является отсутствие различия между SNPC и VTA дофаминергических нейронов. Эта проблема существует потому, что в то время культивирования (E12.5 у мышей или у крыс E14.5) терминальной дифференцировки нейронов и их районирование не завершена, и в то время как использование старых эмбрионов можно, это значительно снижает выживаемость нейроны, связанные с аксотомии. Различение двух популяций можно было бы иммуноцитохимически, с использованием антител против специфических маркеров для каждой группы населения, такие как Girk2 (для выявления SNPC нейроны) и кальбиндин (для выявления VTA нейронов) 17.
Оптимизированный покрытие описано в разделе 4 уменьшает количество эмбрионов в эксперименте более чем на 50% и, следовательно, способствует снижению использование животных в научных исследованиях. Наиболее важные шаги для живучести культаОЭС являются время между euthanization плотин и полного вскрытия эмбриональных midbrains (шаг 2,1 - 2,8), а также полное удаление оболочек (шаг 2,6, рис 1H).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12 | Invitrogen | 11330 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 24020-117 | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS) | Invitrogen | 16140 | |
| N2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water | Sigma | G8769 | |
| Bovine serum albumin BSA | Sigma | A9430 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Trypsin (0.05% (wt/vol) | Invitrogen | 25300 | |
| Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested | Sigma | A9418 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody | Pel-Freez Biologicals | P60101-0 | |
| Poly-L-ornithine, 0.01% solution | Sigma | P4957 | |
| Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody | Millipore | MAB3418 | |
| Anti-Synapsin-1 antibody | Millipore | AB1543P | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21206 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11016 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A-21203 | |
| Trypan blue solution (0.4% (wt/vol)) | Biowhittaker | 17-942E | |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Inverted phase contrast microscope | Carl Zeiss | Axiovert 40 C | |
| Dumont Forceps | Fine Scientific Tools | May-45 | |
| Cover Slip Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11251-33 | |
| Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11245-30 | |
| Blade Holder/Breaker Flat Grip - 11cm | Fine Scientific Tools | 10052-11 | |
| Student Iris Scissors - Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | |
| Fiber optic halogen illuminator | Nikon | MKII | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20C | |
| Hemocytometer | Proscitech | SVZ2NIOU | |
| 0.2 µm sterile filter units | Nalgene | NL-CE-156-4020 | |
| 100x20 mm Petri dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12 mm | Bellco Glass | 1943-10012 |
References
- Prasad, K. N., et al. Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).
- Fall, C. P., Bennett, J. P. Characterization and time course of MPP+ -induced apoptosis in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. J Neurosci Res. 55, 620-628 (1999).
- Choi, H. K., Won, L., Roback, J. D., Wainer, B. H., Heller, A. Specific modulation of dopamine expression in neuronal hybrid cells by primary cells from different brain regions. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 8943-8947 (1992).
- Alavian, K. N., Sgado, P., Alberi, L., Subramaniam, S., Simon, H. H. Elevated P75NTR expression causes death of engrailed-deficient midbrain dopaminergic neurons by Erk1/2 suppression. Neural Dev. 4, 11 (2009).
- Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain. 133, 2022-2031 (2010).
- Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T.
- Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson's disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Res. 318, 215-224 (2004).
- Chesselet, M. F., Richter, F.
- Takeshima, T., Johnston, J. M., Commissiong, J. W. Mesencephalic type 1 astrocytes rescue dopaminergic neurons from death induced by serum deprivation. J Neurosci. 14, 4769-4779 (1994).
- Sgado, P., et al. Slow progressive degeneration of nigral dopaminergic neurons in postnatal Engrailed mutant mice. PNAS. 103, 15242-15247 (2006).
- Alavian, K. N., et al. The lifelong maintenance of mesencephalic dopaminergic neurons by Nurr1 and engrailed. J Biomed Sci. 21, 27 (2014).
- Simon, H. H., Bhatt, L., Gherbassi, D., Sgado, P., Alberi, L. Midbrain dopaminergic neurons: determination of their developmental fate by transcription factors. Ann N Y Acad Sci. 991, 36-47 (2003).
- Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
- Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radic Biol Med. 62, 132-144 (2013).
- Schapira, A. H.
- Chung, C. Y., et al. Cell type-specific gene expression of midbrain dopaminergic neurons reveals molecules involved in their vulnerability and protection. Hum Mol Gen. 14, 1709-1725 (2005).
