Aislamiento, cultivo y mantenimiento a largo plazo de Primaria mesencefálico neuronas dopaminérgicas a partir de cerebros de embriones de roedores
Summary
The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson’s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.
Abstract
Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson’s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.
Introduction
La pérdida de neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra pars compacta conduce a los síntomas motores cardinal de la enfermedad de Parkinson (PD), el segundo trastorno neurodegenerativo más frecuente. La causa subyacente de la desaparición de esta población neuronal mesencephalic no se conoce. Para el estudio de las vías bioquímicas responsables del desarrollo y la modulación de las propiedades neurofisiológicas y la supervivencia de las neuronas Mesda, varios de cultivo de células y sistemas de modelos animales se han utilizado. Las líneas celulares inmortalizadas, incluyendo la línea celular de rata dopaminérgica 1RB 3 AN 27 (N27), el dopaminérgica línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y, la línea celular híbrida de ratón dopaminérgica MN9D y mesencefálico humana LUHMES células se han utilizado para estudios mecanísticos bioquímicos y limitadas 1 -5. Para el estudio de la pérdida específica de neuronas Mesda, varios neurotoxina y basados en modelos genéticos se han desarrollado 6-8. Culturas mesencéfalo ventral primaria, Proporcionar una herramienta indispensable para el estudio de las propiedades neuronales y sinápticas de las neuronas dopaminérgicas y las vías implicadas en la patogénesis de esta enfermedad común.
Aquí presentamos un protocolo detallado para el aislamiento de las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas, que contiene modificaciones resultantes en una mayor capacidad de supervivencia y el aumento de rendimiento de cubreobjetos por embrión. El uso del mesencéfalo E12.5 ratón prematuro (E14.5 en rata) mejora la supervivencia. A esta edad las neuronas no se han desarrollado todavía los axones, lo que deja las células intactas durante la disección y minimiza el estrés aumentando así significativamente la viabilidad. Además, la disección cuidadosa del mesencéfalo ventral, como se describe en la sección 2 de este protocolo, mejora aún más la capacidad de supervivencia. Para aumentar el número de cubreobjetos por embrión, una técnica de siembra alternativa se presenta en la sección 4 de este protocolo. Esto conduce a un rendimiento de hasta 10 cubreobjetos por embrión en comparación con 4 cubreobjetos bajocondiciones de chapado estándar reduciendo así la cantidad de animales por experimento.
Las neuronas en la cultura de exposiciones consecuencia de los axones y dendritas, forman conexiones sinápticas y revelan la presencia de marcadores neuronales y sinápticas que hacen estas culturas adecuado para imágenes de células vivas, inmunocitoquímica y estudios electrofisiológicos. Además, el uso de cultivos neuronales facilita la manipulación genética y farmacológica. Excrecencia de neuritas a partir del día 2 in vitro permite estudios de desarrollo. Por otra parte, la supervivencia a largo plazo de las culturas (hasta seis semanas) hace que sean adecuadas para el estudio de la degeneración progresiva y lenta de estas neuronas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las neuronas dopaminérgicas en el mesencéfalo son la principal fuente de dopamina en el sistema nervioso central. Se dividen en tres grupos, sustancia negra pars compacta (SNpc), el área ventral tegmental (VTA) y el campo retrorubral (FRR) 10, 11. Las neuronas SNpc VTA y dan lugar a importantes vías dopaminérgicas, mesocorticales, mesolímbico y nigro-estriado, que participan en funciones como el control de las emociones, la motivación y el comportamiento motor. Desaparición de las neuronas en SNpc y a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was performed using the Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London startup funds to K.N.A.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12 | Invitrogen | 11330 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 24020-117) | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS) | Invitrogen | 16140 | |
| N2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048) | |
| D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water | Sigma | G8769 | |
| Bovine serum albumin BSA | Sigma | A9430 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Trypsin (0.05% (wt/vol) | Invitrogen | 25300 | |
| Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested | Sigma | A9418 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody | Pel-Freez Biologicals | P60101-0 | |
| Poly-L-ornithine, 0.01% solution | Sigma | P4957 | |
| Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody | Millipore | MAB3418 | |
| Anti-Synapsin-1 antibody | Millipore | AB1543P | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21206 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11016 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A-21203 | |
| Trypan blue solution (0.4% (wt/vol) | Biowhittaker | 17-942E | |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Inverted phase contrast microscope | Carl Zeiss | Axiovert 40 C | |
| Dumont Forceps | Fine Scientific Tools | May-45 | |
| Cover Slip Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11251-33 | |
| Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11245-30 | |
| Blade Holder/Breaker Flat Grip – 11cm | Fine Scientific Tools | 10052-11 | |
| Student Iris Scissors – Straight 11.5cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | |
| Fiber optic halogen illuminator | Nikon | MKII | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20C | |
| Hemocytometer | Proscitech | SVZ2NIOU | |
| 0.2 µm sterile filter units | Nalgene | NL-CE-156-4020 | |
| 100x20mm Petri dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12mm | Bellco Glass | 1943-10012 |
References
- Prasad, K. N., et al. Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).
- Fall, C. P., Bennett, J. P. Characterization and time course of MPP+ -induced apoptosis in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. J Neurosci Res. 55, 620-628 (1999).
- Choi, H. K., Won, L., Roback, J. D., Wainer, B. H., Heller, A. Specific modulation of dopamine expression in neuronal hybrid cells by primary cells from different brain regions. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 8943-8947 (1992).
- Alavian, K. N., Sgado, P., Alberi, L., Subramaniam, S., Simon, H. H. Elevated P75NTR expression causes death of engrailed-deficient midbrain dopaminergic neurons by Erk1/2 suppression. Neural Dev. 4, 11 (2009).
- Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain. 133, 2022-2031 (2010).
- Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Animal models of Parkinson’s disease. Bioessays. 24, 308-318 (2002).
- Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson’s disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Res. 318, 215-224 (2004).
- Chesselet, M. F., Richter, F. Modelling of Parkinson’s disease in mice. Lancet neurology. 10, 1108-1118 (2011).
- Takeshima, T., Johnston, J. M., Commissiong, J. W. Mesencephalic type 1 astrocytes rescue dopaminergic neurons from death induced by serum deprivation. J Neurosci. 14, 4769-4779 (1994).
- Sgado, P., et al. Slow progressive degeneration of nigral dopaminergic neurons in postnatal Engrailed mutant mice. PNAS. 103, 15242-15247 (2006).
- Alavian, K. N., et al. The lifelong maintenance of mesencephalic dopaminergic neurons by Nurr1 and engrailed. J Biomed Sci. 21, 27 (2014).
- Simon, H. H., Bhatt, L., Gherbassi, D., Sgado, P., Alberi, L. Midbrain dopaminergic neurons: determination of their developmental fate by transcription factors. Ann N Y Acad Sci. 991, 36-47 (2003).
- Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson’s disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
- Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radic Biol Med. 62, 132-144 (2013).
- Schapira, A. H. Aetiopathogenesis of Parkinson’s disease. J Neurology. 258, S307-S310 (2011).
- Chung, C. Y., et al. Cell type-specific gene expression of midbrain dopaminergic neurons reveals molecules involved in their vulnerability and protection. Hum Mol Gen. 14, 1709-1725 (2005).
