Introduction
Verlust von dopaminergen Neuronen aus der Substantia nigra pars compacta führt zu den Kardinal motorischen Symptome der Parkinson-Krankheit (PD), die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung. Die zugrunde liegende Ursache für den Niedergang des Mittelhirn neuronalen Population ist nicht bekannt. Um die biochemischen Wege für die Entwicklung und Modulation neurophysiologischen Eigenschaften und das Überleben von Neuronen mesDA mehrere Zellkultur- und Tiermodellsystemen verantwortlich verwendet wurden studieren. Immortalisierte Zelllinien, einschließlich der Ratte dopaminergen Zelllinie 1RB 3 AN 27 (N27), der menschlichen dopaminergen Neuroblastom-Zelllinie SH-SY5Y, der Maus dopaminergen Hybridzellinie MN9D und Menschen mesencephalen LUHMES Zellen für biochemische und begrenzte mechanistische Studien 1 verwendet wurde -5. Für die Untersuchung des spezifischen Verlust mesDA Neuronen mehrere Neurobasis und genetische Modelle wurden entwickelt 6-8. Primäre ventralen Mittelhirn KulturenStellen ein unverzichtbares Werkzeug für die Untersuchung der neuronalen und synaptischen Eigenschaften der dopaminergen Neuronen und die Wege in der Pathogenese dieser häufige Erkrankung beteiligt.
Hier präsentieren wir Ihnen ein ausführliches Protokoll für die Isolierung von Mittelhirn dopaminergen Neuronen, die Änderungen zu höheren Überlebensfähigkeit und erhöhte Ausbeute an Deckgläsern pro Embryo enthält. Die Nutzung vorzeitige E12.5 Maushirn (E14.5 in rat) erhöht die Überlebensfähigkeit. In diesem Alter Neuronen nicht Axone entwickelt noch, die Zellen intakt beim Präparieren verlässt und den Stress dadurch deutlich erhöht Überlebensfähigkeit minimiert. Darüber hinaus sorgfältige Präparation der ventralen Mittelhirn, wie in Abschnitt 2 dieses Protokoll beschrieben, weiter verbessert Überlebensfähigkeit. Um die Anzahl der Deckgläser pro Embryo zu erhöhen, wird eine alternative Beschichtungsverfahren in Abschnitt 4 dieses Protokolls vorgestellt. Dies führt zu einer Ausbeute von bis zu 10 Deck pro Embryo im Vergleich zu 4 Deckgläser unterStandard Plattierungsbedingungen wodurch die Menge der Tiere pro Versuch.
Neuronen in Kultur zeigen Auswuchs von Axonen und Dendriten bilden synaptische Verbindungen und zeigen das Vorhandensein von neuronalen und synaptischen Marker machen diese Kulturen für Live Cell Imaging, immunzytochemischen und elektrophysiologische Untersuchungen geeignet. Weiterhin ist die Verwendung von neuronalen Kulturen erleichtert und pharmakologische Manipulation. Auswuchs von Neuriten von Tag 2 in vitro ermöglicht die Entwicklungsstudien. Ferner ermöglicht die langfristige Überlebensrate von Kulturen (bis zu sechs Wochen) für ein Studium des langsame, progressive Degeneration dieser Neuronen geeignet.
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Protocol
HINWEIS: Die Tiere wurden durch die Imperial Colleges und Tierschutz beibehalten und in Übereinstimmung behandelt mit den institutionellen Richtlinien und alle Tier Verfahren genehmigt und ethische Überprüfung zuständige Gremium (AWERB) und das Innenministerium und der Harvard University Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) in Übereinstimmung mit Bundes- und Landesvorschriften.
1. Reagenzien und Geräte-Setup
- Thaw, aliquoten und speichern 1 mg / ml Laminin-Lösung bei -80 ° C. Löse 2 ul in 1 ml DMEM / F12, was in einer Beschichtungskonzentration von 1-2 & mgr; g / cm 2.
HINWEIS: Thaw Laminin langsam auf Eis und lösen sich in kaltem DMEM / F12 und unmittelbar darauf an den Platten / Deck hinzuzufügen. - Verdünnen Sie 75 ml 0,01% Poly-L-Ornithin in 425 ml PBS und bei 4 ° C.
HINWEIS: Die Haltbarkeit der Arbeitslösung bis zu einem Monat. - Lösen Sie 25% (w / v) BSA in PBS, pH 7,4, und bei 4 ° C für bis zu eine year.
- Bereiten Sie 50% FBS (in HBSS) Deaktivierung Medien.
- Bereiten Komplettmedium durch Zugabe von 50 U / ml Penicillin und Streptomycin, 1x N2 Ergänzung, 5% (Vol / Vol) FBS, 0,36% D - (+) - Glucose (w / v), 0,25% BSA (w / v), um DMEM / F12 und bei 4 ° C.
HINWEIS: Die Haltbarkeitsdauer beträgt bis zu 10 Tage. - Ort Deck in kochendem 70% (vol / vol) Ethanol für mindestens 30 min, um jegliche Spuren von Fett und Autoklaven entfernen.
- Ort Deck in Platten mit 24 Vertiefungen und fügen 500 ul Poly-L-Ornithin-Lösung in jede Kammer. Inkubieren Sie 1 Stunde unter der Gewebekultur Haube bei RT und dann waschen 3 Mal mit 500 ul Wasser. Gib 500 ul Laminin-Lösung zu jeder Platte und Inkubation O / N in der befeuchteten Gewebekulturinkubator bei 37 ºC.
HINWEIS: Wenn keine Waschschritte nach Laminin Behandlung notwendig, Waschen der Poly-L-Ornithin weniger als dreimal führt zum Tod der Zellen nach 24 h Kultivierung. - Polieren Sie die Spitzen der Glaspipetten über Erdgas oder Taschenlampe flahm.
HINWEIS: Nach diesem Schritt wird der Durchmesser der Spitze sollte etwa die Hälfte seiner normalen Größe sein. - Schneiden Sie die Kappen von 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, mit einem autoklavierten Scheren und Autoklaven.
2. Präparation der embryonalen ventralen Mittelhirn
- Narkotisieren timed-schwangeren (E12.5) Dämme durch CO 2 Inhalation und durch Genickbruch einschläfern.
- Sprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol und eine Bauchschnitt, bis die Gebärmutter Säcke alle ausgesetzt sind. Mit einer Pinzette schneiden die vaginale Befestigung und entfernen Gebärmutter. Legen Sie die Gebärmutter in eiskaltem HBSS, in einer 100 mm Petrischale.
- Embryonen aus der Gebärmutter und Fruchtblase zu entfernen, mit einer Pinzette (Abbildung 1C). Platz Embryonen in frischem eiskaltem HBSS.
HINWEIS: Das Rechteck in Figur 1D zeigt die Stelle von embryonalen ventralen Mittelhirn. - Legen Sie die Embryonen unter Dissektionsmikroskop (10-fache Vergrößerung) und sezieren die MittelhirnBogen, indem das Gehirn an der Landenge und Mittelhirn-Zwischenhirn Randbereich, mit dem bioscissor und Pinzette (1E, siehe 1A für Linien der Einschnitt Abbildung).
- Nach dem Herausnehmen der gesamten Mittelhirn, einen Schnitt in der mediodorsal Mittelhirn (1F).
- Hirnhaut entfernen, mit zwei Zangen (Abbildung 1H).
HINWEIS: entscheidender Schritt: Dieser Schritt ist wichtig für eine optimale Ausbeute und neuronale Überleben. Da die Kulturbedingungen optimal für Gehirnzellen sind, die meisten der Zellen aus dem umgebenden Gewebe zu sterben nach der Plattierung und die apoptotische Signal dieses Gewebe kann die Integrität der Kulturen schädigen. - Glätten Sie das Mittelhirn Gewebe auf der Petrischale, die Schmetterlingsform beobachten und schneiden etwa die Hälfte eines jeden Flügels, mit einem sterilisierten Rasierklinge (Abbildung 1 H, I).
HINWEIS: Figur 1J zeigt die isolierte ventralen Mittelhirn. - Übertragen Sie dieStück ventralen Mittelhirn in eiskaltes HBSS in einem 15 ml konischen Rohr und fahren Sie mit dem nächsten Embryo.
Hinweis: Die Schritte 2,1-2,8 sollte nicht mehr als 1 Stunde. Halten Sie die Embryonen außerhalb dieses Zeitrahmens auf Eis sinkt die Lebensfähigkeit der Zellen deutlich.
3. Die Dissoziation von ventralen Mittelhirn-Zellen
- Übertragen Sie die Stücke von ventralen Mittelhirn unter einer Sterilbank. Entfernen Sie die HBSS und 1 ml vorgewärmten (37 ° C) 0,05% Trypsin-EDTA in das konische Röhrchen (Menge reicht für bis zu 12 Stück der ventralen Mittelhirn). Inkubieren des Gewebes bei 37 ° C für 5-10 min.
- Entfernen Trypsin-EDTA unter der Haube und 1 ml Deaktivierung Medium (das Serum wird Trypsin deaktivieren) auf das Gewebe.
- Entfernen Sie die Deaktivierung Medium und waschen Sie das Gewebe in 1 ml vollständigem Medium zweimal.
HINWEIS: Vermeiden Entfernen aller das Medium von der Röhre und Pipettieren der Gewebe, Verwerfen der dissoziierten Zellen zu verhindern. - In 1 ml Vollmedium und tritUrat das Gewebe mit einer feuerpolierten Glaspipette. Bildung von Blasen zu vermeiden, und weiterhin Verreiben bis einzelne Zellsuspension erreicht wird.
Hinweis: geht normalerweise 8-10 durch den verengten Spitze für vollständige Dissoziation erforderlich. - Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie das Medium.
- Re-suspendieren des Pellets in 1 ml Komplettmedium durch langsames Auf- und Abpipettieren mit bis zu viermal.
4. Überzug ventralen Mittelhirn-Zellen
- Nimm 10 & mgr; l der Zellsuspension mit 90 ul Trypan-Blau-Lösung und die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer.
HINWEIS: Die Lebensfähigkeit der Zellen kann auf dieser Stufe auch überprüft werden. - Zeigen sterilisierten Mikrozentrifugenröhrchen Caps in 100 mm Petrischalen und übertragen Sie die Poly-L-Ornithin / Laminin beschichtete Deckgläser, mit einer Pinzette, einer nach dem anderen auf der Oberseite der Caps.
HINWEIS: Waschen Sie die Deckgläser und vermeiden Trocknen des Laminin, da dies dazu führen uneven Kulturen und Abnahme der Überlebensfähigkeit der Zellen. - Die Lautstärke auf 1.500 Zellen pro 1 & mgr; l durch Zugabe von komplettem Medium und Zugabe von 100 & mgr; l (insgesamt 150.000 Zellen) der Zellsuspension auf jedes Deckglas (das Volumen ist optimal, um die Oberfläche des Deckglases ohne Verschütten zu bedecken). Schließen die Petrischalen und inkubieren für 1 h in einem befeuchteten Brutschrank (37 ° C, 5% CO 2).
HINWEIS: kritischer Schritt: Dieser Schritt ist für die Verbesserung der Befestigung und die Lebensfähigkeit der Zellen und zur Erhöhung der Anzahl der Deckplättchen pro Embryo erforderlich. Alternativ können die Zellen direkt in die Vertiefungen (mit Deckgläschen), aber die Anzahl von Zellen sollten bis 350.000 pro Well (statt 150.000) erhöht werden übertragen. In anderen Worten, mit dieser Methode können 8-10 Deck erworben werden, während die Direktübertragung ergibt etwa 3-4 Deck weil der Zellen, die an den Platten anzubringen (neben oder unterhalb der Deck). Die durchschnittliche viability der Kulturen, unter Verwendung dieses Verfahrens betrug etwa 90%.
5. Kultur Wachstum und Wartung
- Nach 1 Stunde Inkubation sorgfältig übertragen Sie die Deckgläser mit dem Medium in 24-Well-Platten, enthaltend 400 & mgr; l vorgewärmten (37 ° C) vollständigem Medium (Gesamtvolumen: 500 ul). Die Zellen O / N bei 37 ° C.
- Innerhalb von 24 Stunden nach der Inkubation die Wells vorsichtig fügen 500 ul Vollmedium in jede Vertiefung.
Hinweis: die ersten paar Stunden ist die kritischste Phase für das Überleben von dopaminergen Neuronen und die Anzahl der überlebenden Zellen nicht signifikant über diesen Punkt hinaus zu ändern. - Sie zusätzliche Medien hinzufügen, nicht zu den Kulturen in den ersten zwei Wochen, bis das Medium wird gelb. Wenn Kultivierung für mehr als zwei Wochen oder mittlere Farbumschlag nach gelb, Austausch Hälfte der Medien (500 ul) mit frischem Komplettvorgewärmten Medien (in der Regel alle zwei Wochen).
HINWEIS: Die dopaminerge Neuronen innerhalb derKulturen würden für mehr als 6 Wochen unter diesen Bedingungen zu überleben.
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Representative Results
Immunhistochemie gegen Tyrosinhydroxylase (Th) zeigt, dass zwischen 0,5-1% der Zellen in Kultur sind dopaminergen. Neuronale Projektionen erscheinen innerhalb von 2 Stunden nach dem Ausstreichen von dem ersten Tag, Axonen und Dendriten unterscheidbar sind (Abbildung 2), unter Verwendung von Tyrosin-Hydroxylase (TH) und Microtubule-Associated Protein 2 (Map2) Antikörper (Abbildung 3). Die Neuronen überleben länger als sechs Wochen zeigen umfangreiche Auswuchs. Das Neuron-Glia-Verhältnis in den Kulturen direkt mit der Konzentration von Serum im Medium in Beziehung, wie zuvor gezeigt. Während die Beseitigung FBS aus den Kulturen kann relativ rein neuronalen Kulturen ergeben, haben wir und andere gefunden, dass die Zugabe von Serum erhöht die Überlebensfähigkeit von dopaminergen Neuronen in Kultur 9.
Abbildung 1. Verfahren zur Isolierung vonembryonalen ventralen Mittelhirn. Die schematische Ansicht E12.5 Mäusehirn, Mittelhirn Grenzen (gestrichelte Linien) und die ungefähre Position des interessierenden Bereich, ventralen Mittelhirn, im roten Rechteck (A) und die Werkzeuge für die Präparation des ventralen Mittelhirn eine bioscissor, Foreceps und einen Klingenhalter (B) gezeigt. Die Embryonen werden aus Fruchtblase durch Aufbrechen es (C) entnommen. Die Region von Interesse, ventralen Mittelhirn wird durch das Rechteck (D) gezeigt. Mittelhirn wird durch Schneiden an der Landenge (links vom Zuschnitt) und das Mittelhirn-Vorderhirn-Grenze (; E rechts) isoliert. Die mediodorsal Teil des Mittelhirns geschnitten (F) und abgeflacht ist, um eine Schmetterlingsform (G, H) ähneln. Dann werden Hirnhäute aus Gehirn (H) und ventralen Mittelhirn (Rechteck) aus dem Rückenteil durch das Abschneiden der Hälfte der Flügel, mit einer Rasierklinge isoliert dissoziiert
Abbildung 2. Representative Hell Bilder von ventralen Mittelhirn Kulturen. Die Bilder wurden auf DIV1 (links) übernommen, DIV2 (Mitte), und DIV15 (rechts). Maßstab:. 50 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Langzeitüberleben, das Auswachsen von Prozessen und Synaptogenese in 2 Wochen old ventralen Mittelhirn Kulturen. dopaminergen Mittelhirnneuronen, durch Tyrosin-Hydroxylase-Antikörper identifiziert wachsen umfangreiche Axone und Dendriten, durch Map2 Antikörper identifiziert, in der ventralen Mittelhirn Kulturen von zwei Wochen nach der Dissoziation von E12.5 Embryonen. Dendriten kann durch Überlappung von Th und Map2-positive Prozesse, bei denen nur Th-positive Fasern darstellen Axone zu unterscheiden. 200: Antikörper wurden in einer Verdünnung von 1. Maßstab:. 20 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
Dopaminerge Neuronen im Mittelhirn sind die Hauptquelle von Dopamin im ZNS. Sie werden in drei Gruppen unterteilt, Substantia nigra pars compacta (SNpc), ventralen Tegmentum (VTA) und retrorubral Feld (RRF) 10, 11. Die Neuronen im VTA SNpc und führen zu großen dopaminergen Bahnen, mesocorticalen, mesolimbischen und nigrostriatalen, in Funktionen beteiligt wie die Kontrolle der Emotionen, Motivation und Verhalten des Motors. Untergang der Neuronen in SNpc und funktionellen Störung des nigrostriatalen Systems ist der wichtigste pathologische Merkmal der zweitprominenteste neurodegenerativen Störung, Parkinson-Krankheit (PD) 12,13. Aktuelle Therapieansätze befassen Symptome der Krankheit und nicht zu stoppen oder zu verlangsamen, Degeneration und die Ursachen für die langsame, progressive Zellverlust sind noch unbekannt 14-16. Deshalb ist die Entwicklung von in vivo und in vitro Techniken zur Untersuchung der developmental, biochemischen und physiologischen Eigenschaften dieser neuronalen Population ist zwingend notwendig, um das Verständnis der Ätiologie der PD und die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze.
Hier beschreiben wir ein optimiertes Verfahren für die Präparation, Dissoziation und Kultivierung von primären Neuronen aus embryonalen Maus und ventralen Rattenhirn, die in langfristigen in vitro das Überleben von dopaminergen Neuronen in dieser Region führt, wodurch Untersuchung der Prozesse wie Differenzierung, axonale Auswuchs und Synapsenbildung. Mehrere Vorteile dieses Protokolls die erhöhte Anzahl von Deck pro Embryo, Unabhängigkeit von Wachstumsfaktoren und die Länge der in vitro das Überleben und maximiert Entwicklung von Neuronen 4. Dieses Verfahren kann die in vivo-Studien in so dass für das Verständnis der Mechanismen, die normalen physiologischen Funktionen der dopaminergen Mittelhirnneuronen sowie fortschreitende Degeneration dieser Neuronen ergänzenal Bevölkerung zytotoxische und genetische Modelle der Parkinson-Krankheit.
Einer der Hauptnachteile dieses Protokolls ist die fehlende Unterscheidung zwischen SNpc und VTA dopaminergen Neuronen. Dieses Problem besteht, weil zum Zeitpunkt der Kultivierung (E12.5 in Mäusen oder E14.5 an Ratten) die terminale Differenzierung der Neuronen und deren Regionalisierung nicht abgeschlossen ist und während die Verwendung älterer Embryonen möglich ist, ist es wesentlich, das Überleben der reduziert Neuronen durch Axotomie. Unterscheidung der beiden Bevölkerungsgruppen würden durch Immunzytochemie möglich sein, mit Hilfe von Antikörpern gegen spezifische Marker für jede Population wie GIRK2 (bis SNpc Neuronen zu identifizieren) und Calbindin (VTA Neuronen zu identifizieren) 17.
Die in Abschnitt 4 beschriebenen optimierten Beschichtung verringert die Menge der Embryonen pro Experiment um mehr als 50% und trägt zur Verringerung der Verwendung von Tieren in der Forschung daher. Die wichtigsten Schritte für die Überlebensfähigkeit des Kultesmen sind die Zeit zwischen Euthanasie der Dämme und vollständige Zerlegung der embryonalen midbrains (Schritt 2,1 bis 2,8), wie auch die vollständige Entfernung der Hirnhaut (Schritt 2.6, Fig 1H).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12 | Invitrogen | 11330 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 24020-117 | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS) | Invitrogen | 16140 | |
| N2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water | Sigma | G8769 | |
| Bovine serum albumin BSA | Sigma | A9430 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Trypsin (0.05% (wt/vol) | Invitrogen | 25300 | |
| Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested | Sigma | A9418 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody | Pel-Freez Biologicals | P60101-0 | |
| Poly-L-ornithine, 0.01% solution | Sigma | P4957 | |
| Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody | Millipore | MAB3418 | |
| Anti-Synapsin-1 antibody | Millipore | AB1543P | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21206 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11016 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A-21203 | |
| Trypan blue solution (0.4% (wt/vol)) | Biowhittaker | 17-942E | |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Inverted phase contrast microscope | Carl Zeiss | Axiovert 40 C | |
| Dumont Forceps | Fine Scientific Tools | May-45 | |
| Cover Slip Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11251-33 | |
| Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11245-30 | |
| Blade Holder/Breaker Flat Grip - 11cm | Fine Scientific Tools | 10052-11 | |
| Student Iris Scissors - Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | |
| Fiber optic halogen illuminator | Nikon | MKII | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20C | |
| Hemocytometer | Proscitech | SVZ2NIOU | |
| 0.2 µm sterile filter units | Nalgene | NL-CE-156-4020 | |
| 100x20 mm Petri dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12 mm | Bellco Glass | 1943-10012 |
References
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