Summary

Isolatie, Cultuur en onderhoud op lange termijn van de Primary mesencefale dopaminerge neuronen uit embryonale knaagdieren Brains

Published: February 19, 2015
doi:

Summary

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson’s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Abstract

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson’s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

Introduction

Verlies van dopaminerge neuronen van de substantia nigra pars compacta leidt naar de kardinale motorische symptomen van de ziekte van Parkinson (PD), de tweede meest voorkomende neurodegeneratieve ziekte. De onderliggende oorzaak van de ondergang van deze mesencefale neuronale populatie is niet bekend. Om de biochemische routes die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling en neurofysiologische modulerende eigenschappen en overleving van neuronen mesDA verschillende celkweek en diermodellen zijn gebruikt bestuderen. Onsterfelijk gemaakte cellijnen, zoals de rat dopaminerge cellijn 1RB 3 AN 27 (N27), menselijke dopaminerge neuroblastoom cellijn SH-SY5Y, de muis dopaminerge hybride cellijn MN9D en menselijke mesencefale LUHMES cellen zijn gebruikt voor biochemische en beperkte mechanistische studies 1 -5. Voor de studie van het specifieke verlies van mesDA neuronen, verschillende neurotoxine gebaseerd en genetische modellen ontwikkeld 08/06. Primaire ventrale middenhersenen culturen, Bieden een onmisbaar instrument voor het bestuderen van de neuronale en synaptische eigenschappen van de dopaminerge neuronen en het betrokken zijn bij de pathogenese van deze veel voorkomende aandoening paden.

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van mesencefale dopaminerge neuronen, die modificaties resulteert in hogere overlevingskansen en verhoogde opbrengst van dekglaasjes per embryo bevat. Het gebruik van pre-mature E12.5 muis mesencephalon (E14.5 in rat) verhoogt de overlevingskansen. Op deze leeftijd neuronen zijn nog niet axonen ontwikkeld, welke cellen intact laat tijdens dissectie en minimaliseert de stress waardoor aanzienlijke verhoging van levensvatbaarheid. Daarnaast zorgvuldige dissectie van de ventrale middenhersenen, zoals beschreven in paragraaf 2 van dit protocol, een verdere versterking van de overlevingskansen. Om de nummers van dekglaasjes per embryo te verhogen, wordt een alternatieve plating methode gepresenteerd in hoofdstuk 4 van dit protocol. Dit leidt tot een opbrengst van 10 dekglaasjes per embryo vergeleken met 4 dekglaasjes onderstandaard plating worden dus het aantal dieren per experiment verminderen.

Neuronen in cultuur tentoonstelling uitgroei van axonen en dentrites, vormen synaptische verbindingen en onthullen de aanwezigheid van neuronale en synaptische markers maken van deze culturen geschikt voor live cell imaging, immunocytochemische en elektrofysiologische studies. Bovendien is het gebruik van neuronale kweken vergemakkelijkt genetische en farmacologische manipulatie. Uitgroei van neurieten van dag 2 in vitro zorgt voor ontwikkelingsstudies. Bovendien is de lange termijn overleving van culturen (maximaal zes weken) maakt ze geschikt voor onderzoek van de langzame, progressieve degeneratie van deze neuronen.

Protocol

OPMERKING: De dieren zijn gehouden en behandeld in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door het Imperial College en dierenwelzijn en ethische toetsingscommissie (AWERB) en het Ministerie van Binnenlandse Zaken en Harvard University Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC), in overeenstemming met landelijke en regionale wetgeving. 1. reagentia en apparatuur Setup Dooi, hoeveelheid en op te slaan 1 mg / ml Lami…

Representative Results

Immunohistochemie tegen tyrosine hydroxylase (TH) blijkt dat tussen 0,5-1% van de cellen in cultuur dopaminerge. Neuronale uitsteeksels verschijnen binnen 2 uur na plateren en op de eerste dag, axonen en dendrieten onderscheiden (figuur 2), met tyrosine hydroxylase (TH) en microtubule-geassocieerd eiwit 2 (Map2) antilichamen (Figuur 3). De neuronen overleven voor meer dan zes weken en tonen uitgebreide uitgroei. De neuron-glia verhouding in de kweken is direct gerelateerd aan de concent…

Discussion

Dopaminerge neuronen in de middenhersenen is de belangrijkste bron van dopamine in het centrale zenuwstelsel. Zij zijn verdeeld in drie groepen, substantia nigra pars compacta (SNpc), ventrale tegmental gebied (VTA) en retrorubral veld (RRF) 10, 11. De neuronen in SNpc en VTA aanleiding geven tot belangrijke dopaminerge paden, mesocorticale, mesolimbic en Nigro-striatum, die betrokken zijn bij functies zoals de controle van de emotie, motivatie en motorische gedrag. Verdwijnen van neuronen in SNpc en function…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was performed using the Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London startup funds to K.N.A.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12 Invitrogen 11330
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid Invitrogen 24020-117)
Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS) Invitrogen 16140
N2 Supplement (100X), liquid Invitrogen 17502-048)
D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water Sigma G8769
Bovine serum albumin BSA Sigma A9430
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane Sigma L2020
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15070
Trypsin (0.05% (wt/vol) Invitrogen 25300
Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested Sigma  A9418
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma P3813
Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody Pel-Freez Biologicals P60101-0 
Poly-L-ornithine, 0.01% solution Sigma P4957
Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody Millipore MAB3418
Anti-Synapsin-1 antibody Millipore AB1543P
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG   antibody Molecular Probes A-21206
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG   antibody Molecular Probes A-21207
Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG   antibody Molecular Probes A-11015
Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG   antibody Molecular Probes A-11016
Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG   antibody Molecular Probes A-21203
Trypan blue solution (0.4% (wt/vol) Biowhittaker 17-942E
Stereo Microscope Carl Zeiss Stemi 2000-C
Inverted phase contrast microscope Carl Zeiss Axiovert 40 C
Dumont Forceps Fine Scientific Tools May-45
Cover Slip Forceps – Dumoxel Fine Scientific Tools 11251-33
Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel Fine Scientific Tools 11245-30
Blade Holder/Breaker Flat Grip – 11cm Fine Scientific Tools 10052-11
Student Iris Scissors – Straight 11.5cm Fine Scientific Tools 91460-11
Fiber optic halogen illuminator Nikon MKII
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes Fisherbrand 13-678-20C
Hemocytometer Proscitech SVZ2NIOU
0.2 µm sterile filter units Nalgene NL-CE-156-4020
100x20mm Petri dishes BD Biosciences 351005
Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12mm Bellco Glass 1943-10012 

References

  1. Prasad, K. N., et al. Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).
  2. Fall, C. P., Bennett, J. P. Characterization and time course of MPP+ -induced apoptosis in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. J Neurosci Res. 55, 620-628 (1999).
  3. Choi, H. K., Won, L., Roback, J. D., Wainer, B. H., Heller, A. Specific modulation of dopamine expression in neuronal hybrid cells by primary cells from different brain regions. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 8943-8947 (1992).
  4. Alavian, K. N., Sgado, P., Alberi, L., Subramaniam, S., Simon, H. H. Elevated P75NTR expression causes death of engrailed-deficient midbrain dopaminergic neurons by Erk1/2 suppression. Neural Dev. 4, 11 (2009).
  5. Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain. 133, 2022-2031 (2010).
  6. Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Animal models of Parkinson’s disease. Bioessays. 24, 308-318 (2002).
  7. Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson’s disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Res. 318, 215-224 (2004).
  8. Chesselet, M. F., Richter, F. Modelling of Parkinson’s disease in mice. Lancet neurology. 10, 1108-1118 (2011).
  9. Takeshima, T., Johnston, J. M., Commissiong, J. W. Mesencephalic type 1 astrocytes rescue dopaminergic neurons from death induced by serum deprivation. J Neurosci. 14, 4769-4779 (1994).
  10. Sgado, P., et al. Slow progressive degeneration of nigral dopaminergic neurons in postnatal Engrailed mutant mice. PNAS. 103, 15242-15247 (2006).
  11. Alavian, K. N., et al. The lifelong maintenance of mesencephalic dopaminergic neurons by Nurr1 and engrailed. J Biomed Sci. 21, 27 (2014).
  12. Simon, H. H., Bhatt, L., Gherbassi, D., Sgado, P., Alberi, L. Midbrain dopaminergic neurons: determination of their developmental fate by transcription factors. Ann N Y Acad Sci. 991, 36-47 (2003).
  13. Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
  14. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson’s disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
  15. Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radic Biol Med. 62, 132-144 (2013).
  16. Schapira, A. H. Aetiopathogenesis of Parkinson’s disease. J Neurology. 258, S307-S310 (2011).
  17. Chung, C. Y., et al. Cell type-specific gene expression of midbrain dopaminergic neurons reveals molecules involved in their vulnerability and protection. Hum Mol Gen. 14, 1709-1725 (2005).

Play Video

Cite This Article
Weinert, M., Selvakumar, T., Tierney, T. S., Alavian, K. N. Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains. J. Vis. Exp. (96), e52475, doi:10.3791/52475 (2015).

View Video