Introduction
Verlies van dopaminerge neuronen van de substantia nigra pars compacta leidt naar de kardinale motorische symptomen van de ziekte van Parkinson (PD), de tweede meest voorkomende neurodegeneratieve ziekte. De onderliggende oorzaak van de ondergang van deze mesencefale neuronale populatie is niet bekend. Om de biochemische routes die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling en neurofysiologische modulerende eigenschappen en overleving van neuronen mesDA verschillende celkweek en diermodellen zijn gebruikt bestuderen. Onsterfelijk gemaakte cellijnen, zoals de rat dopaminerge cellijn 1RB 3 AN 27 (N27), menselijke dopaminerge neuroblastoom cellijn SH-SY5Y, de muis dopaminerge hybride cellijn MN9D en menselijke mesencefale LUHMES cellen zijn gebruikt voor biochemische en beperkte mechanistische studies 1 -5. Voor de studie van het specifieke verlies van mesDA neuronen, verschillende neurotoxine gebaseerd en genetische modellen ontwikkeld 08/06. Primaire ventrale middenhersenen culturen, Bieden een onmisbaar instrument voor het bestuderen van de neuronale en synaptische eigenschappen van de dopaminerge neuronen en het betrokken zijn bij de pathogenese van deze veel voorkomende aandoening paden.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van mesencefale dopaminerge neuronen, die modificaties resulteert in hogere overlevingskansen en verhoogde opbrengst van dekglaasjes per embryo bevat. Het gebruik van pre-mature E12.5 muis mesencephalon (E14.5 in rat) verhoogt de overlevingskansen. Op deze leeftijd neuronen zijn nog niet axonen ontwikkeld, welke cellen intact laat tijdens dissectie en minimaliseert de stress waardoor aanzienlijke verhoging van levensvatbaarheid. Daarnaast zorgvuldige dissectie van de ventrale middenhersenen, zoals beschreven in paragraaf 2 van dit protocol, een verdere versterking van de overlevingskansen. Om de nummers van dekglaasjes per embryo te verhogen, wordt een alternatieve plating methode gepresenteerd in hoofdstuk 4 van dit protocol. Dit leidt tot een opbrengst van 10 dekglaasjes per embryo vergeleken met 4 dekglaasjes onderstandaard plating worden dus het aantal dieren per experiment verminderen.
Neuronen in cultuur tentoonstelling uitgroei van axonen en dentrites, vormen synaptische verbindingen en onthullen de aanwezigheid van neuronale en synaptische markers maken van deze culturen geschikt voor live cell imaging, immunocytochemische en elektrofysiologische studies. Bovendien is het gebruik van neuronale kweken vergemakkelijkt genetische en farmacologische manipulatie. Uitgroei van neurieten van dag 2 in vitro zorgt voor ontwikkelingsstudies. Bovendien is de lange termijn overleving van culturen (maximaal zes weken) maakt ze geschikt voor onderzoek van de langzame, progressieve degeneratie van deze neuronen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: De dieren zijn gehouden en behandeld in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door het Imperial College en dierenwelzijn en ethische toetsingscommissie (AWERB) en het Ministerie van Binnenlandse Zaken en Harvard University Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC), in overeenstemming met landelijke en regionale wetgeving.
1. reagentia en apparatuur Setup
- Dooi, hoeveelheid en op te slaan 1 mg / ml Laminin oplossing bij -80 ºC. Los 2 gl in 1 ml DMEM / F12, resulterend in een coating concentratie van 1-2 ug / cm 2.
OPMERKING: Thaw Laminin langzaam op ijs en op te lossen in koud DMEM / F12 en direct toevoegen aan de platen / dekglaasjes. - Verdun 75 ml van 0,01% poly-L-ornithine in 425 ml PBS en bewaar bij 4 ° C.
OPMERKING: De houdbaarheid van de werkende oplossing is maximaal een maand. - Los 25% (gew / vol) BSA in PBS, pH 7,4 en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal een year.
- Bereid 50% FBS (in HBSS) deactivering media.
- Bereid volledig medium door toevoeging van 50 U / ml penicilline en streptomycine, 1x N2 supplement, 5% (vol / vol) FBS, 0,36% D - (+) - glucose (w / v), 0,25% BSA (gew / vol) om DMEM / F12 en bewaar bij 4 ºC.
OPMERKING: De houdbaarheid is maximaal 10 dagen. - Plaats dekglaasjes in kokend 70% (vol / vol) ethanol gedurende ten minste 30 min aan een vet- en autoclaaf verwijderd.
- Plaats dekglaasjes in 24-well platen en voeg 500 pl poly-L-ornithine oplossing in elk putje. Incubeer 1 uur onder de weefselkweek kap bij RT en dan, was 3 maal met 500 pi water. Voeg 500 ul laminine oplossing aan elke plaat en incubeer O / N in het bevochtigde weefselcultuur incubator bij 37 ° C.
OPMERKING: Hoewel geen wassen nodig na laminine behandeling, was de poly-L-ornithine minder dan drie keer tot de dood van de cellen 24 uur na het kweken. - Polijsten de tips van glazen pipetten dan aardgas of fakkel flame.
OPMERKING: Na deze stap de diameter van de punt moet ongeveer de helft van de normale grootte. - Snijd de kapjes van 1,5 ml microcentrifugebuisjes, met behulp van een geautoclaveerd schaar en autoclaaf.
2. Dissectie van embryonale ventrale middenhersenen
- Narcotiseren timed-zwangere (E12.5) dammen door CO 2 inademing en dan euthanaseren door cervicale dislocatie.
- Spuit de buik met 70% ethanol en maak een abdominale incisie totdat de baarmoeder zakjes alle blootgesteld. Behulp van een tang snijd de vaginale bevestiging en te verwijderen baarmoeder. Plaats de baarmoeder in ijskoude HBSS, in een 100 mm petrischaal.
- Verwijder embryo uit de baarmoeder en de vruchtzak, met behulp van een tang (figuur 1C). Plaats embryo's in verse ijskoude HBSS.
OPMERKING: De rechthoek in figuur 1D geeft de locatie van de embryonale ventrale middenhersenen. - Plaats de embryo's onder een dissectie microscoop (10x vergroting) en ontleden de mesencefaleboog door het snijden van de hersenen op de landengte en mesencefale-diencephalic grensgebied, met behulp van de bioscissor en pincet (Figuur 1E, verwijzen wij u naar figuur 1A voor de lijnen van de incisie).
- Na het nemen van het volledige middenhersenen, maak een snede in de mediodorsal middenhersenen (Figuur 1F).
- Verwijder hersenvliezen, met twee tang (figuur 1H).
OPMERKING: Kritische stap: Deze stap is essentieel voor een optimale neuronale opbrengst en overleving. Omdat de kweekomstandigheden zijn optimaal voor hersencellen meeste cellen van het omringende weefsel sterven na plateren en apoptose signaal van dit weefsel integriteit van de kweken beschadigen. - Vlak de middenhersenen weefsel op de petrischaal op de vlindervorm observeren en snijd ongeveer de helft van elke vleugel, met behulp van een gesteriliseerde scheren mes (figuur 1 H, I).
OPMERKING: Figuur 1J toont de geïsoleerde ventrale middenhersenen. - Breng destuk van de ventrale middenhersenen in ijskoud HBSS in een 15 ml conische buis en ga verder met de volgende embryo.
OPMERKING: De stappen 2,1-2,8 mag niet meer dan 1 uur duren. Het houden van de embryo's na dit tijdsbestek op ijs vermindert levensvatbaarheid van de cellen aanzienlijk.
3. dissociatie van ventrale middenhersenen Cellen
- Breng de stukken van de ventrale middenhersenen onder een laminaire stroming kap. Verwijder de HBSS en voeg 1 ml voorverwarmde (37 ° C) 0,05% trypsine-EDTA in de conische buis (volume voldoende voor 12 stuks ventrale middenhersenen). Incubeer het weefsel bij 37 ° C gedurende 5-10 min.
- Verwijder trypsine-EDTA onder de kap en voeg 1 ml deactivering medium (het serum trypsine deactiveer) aan het weefsel.
- Verwijder de deactivering medium en was het weefsel in 1 ml compleet medium tweemaal.
OPMERKING: Vermijd het verwijderen van al het medium uit de buis en pipetteren het weefsel, om te voorkomen dat het teruggooien van de gedissocieerde cellen. - Voeg 1 ml compleet medium en triturate het weefsel met een vuur gepolijste glazen pipet. De vorming van bellen en verder tritureren tot enkele celsuspensie wordt verkregen.
OPMERKING: Meestal 8-10 gaat door de beperkte tip nodig zijn voor volledige dissociatie. - Centrifugeer de cellen bij 400 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het medium.
- Resuspendeer de pellet in 1 ml compleet medium door langzaam en neer te pipetteren tot vier keer.
4. Plating Ventral Middenhersenen Cellen
- Meng 10 ul van de celsuspensie met 90 pi trypan blauwe oplossing en tel het aantal cellen met een hemocytometer.
OPMERKING: Levensvatbaarheid van de cellen kan in deze fase worden gecontroleerd. - Plaats gesteriliseerde microcentrifugebuis caps 100 mm petrischalen en breng de poly-L-ornithine / laminine beklede dekglaasjes, via tang, één voor één boven op de doppen.
OPMERKING: Niet de dekglaasjes te wassen en te voorkomen dat het drogen van de laminin, aangezien dit uneve kan veroorzakenn culturen en afname overlevingskansen van de cellen. - Stel het volume op 1.500 cellen per 1 pl door toevoeging volledig medium en voeg 100 ul (totaal 150.000 cellen) van de celsuspensie op elkaar dekglaasje (het volume optimaal aan het oppervlak van het dekglaasje zonder morsen te dekken). Sluit de Petrischalen en incubeer ze gedurende 1 uur in een bevochtigde weefselcultuur incubator (37 ° C, 5% CO2).
OPMERKING: Kritische stap: Deze stap is nodig ter verbetering van de hechting en de levensvatbaarheid van de cellen en voor het verhogen van het aantal dekglaasjes per embryo. Als alternatief kunnen de cellen worden overgebracht direct in de putjes (met dekglaasjes), maar het aantal cellen te verhogen tot 350.000 per putje (in plaats van 150.000). Met andere woorden, deze methode kan 8-10 dekglaasjes worden verkregen, terwijl de directe overdracht levert ongeveer 3-4 dekglaasjes door de cellen die hechten aan de platen (naast of onder de dekglaasjes). De gemiddelde viability van de culturen met deze werkwijze was ongeveer 90%.
5. Cultuur Groei en Onderhoud
- Na 1 uur incubatie voorzichtig overdragen dekglaasjes inclusief het medium in platen met 24 putjes, die 400 pl voorverwarmde (37 ° C) volledig medium (totaal volume 500 ui). Incubeer de cellen O / N bij 37 ºC.
- Binnen 24 uur na incubatie van de putjes voorzichtig voeg 500 ul volledig medium in elk putje.
OPMERKING: De eerste uren is de meest kritieke fase van overleving van de dopaminergische neuronen en het aantal overlevende cellen niet significant verandert voorbij dit punt. - Geen extra media toevoegen aan de kweken gedurende de eerste twee weken of totdat het medium wordt geel. Als kweken gedurende meer dan twee weken of medium kleurveranderingen geel, uitwisseling helft van het medium (500 ui) met vers compleet voorverwarmde media (meestal elke twee weken).
OPMERKING: dopaminerge neuronen in deculturen zou overleven langer dan 6 weken onder deze omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Immunohistochemie tegen tyrosine hydroxylase (TH) blijkt dat tussen 0,5-1% van de cellen in cultuur dopaminerge. Neuronale uitsteeksels verschijnen binnen 2 uur na plateren en op de eerste dag, axonen en dendrieten onderscheiden (figuur 2), met tyrosine hydroxylase (TH) en microtubule-geassocieerd eiwit 2 (Map2) antilichamen (Figuur 3). De neuronen overleven voor meer dan zes weken en tonen uitgebreide uitgroei. De neuron-glia verhouding in de kweken is direct gerelateerd aan de concentratie van serum in het medium, zoals eerder aangegeven. Terwijl het elimineren van FBS uit de culturen kunnen relatief zuivere neuronale culturen opleveren, hebben wij en anderen vonden dat de toevoeging van serum verhoogt de overlevingskansen van dopaminerge neuronen in cultuur 9.
Figuur 1. Procedure voor isolatie vanembryonale ventrale middenhersenen. De schematische weergave van E12.5 hersenen van muizen, middenhersenen grenzen (stippellijnen), en de globale positie van de regio van belang, ventrale middenhersenen, binnen de rode rechthoek (A) en de gereedschappen voor dissectie van de ventrale middenhersenen , een bioscissor, foreceps, en een mes houder (B) getoond. De embryo's worden uit vliezen door het verbreken (C). De regio van belang, ventrale middenhersenen, wordt getoond door de rechthoek (D). Middenhersenen wordt geïsoleerd door te snijden in de landengte (links van de snede stuk) en de middenhersenen-voorhersenen grens (rechts; E). Het mediodorsal deel van de middenhersenen wordt gesneden (F) en is afgeplat, een vlindervorm (G, H) lijken. Vervolgens worden meninges gescheiden van hersenen (H) en ventrale middenhersenen (rechthoek) wordt geïsoleerd uit het dorsale gedeelte door het afsnijden van de helft van de vleugels met een scheermesje
Figuur 2. Vertegenwoordiger helderveld beelden van ventrale middenhersenen culturen. Foto's werden genomen op DIV1 (links), DIV2 (midden), en DIV15 (rechts). Schaalbalk:. 50 pm Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Lange termijn overleving, uitgroei van processen en synaptogenese in twee weken old ventrale middenhersenen culturen. dopaminerge neuronen, die door tyrosine hydroxylase antilichaam groeien uitgebreide axonen en dendrieten, die door Map2 antilichaam in de ventrale middenhersenen kweken twee weken na dissociatie van E12.5 embryo. Dendrieten kunnen worden onderscheiden door overlap van Th en Map2-positieve processen, waar alleen Th-positieve vezels vertegenwoordigen axonen. Antilichamen werden gebruikt in een verdunning van 1: 200. Schaalbalk:. 20 pm Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dopaminerge neuronen in de middenhersenen is de belangrijkste bron van dopamine in het centrale zenuwstelsel. Zij zijn verdeeld in drie groepen, substantia nigra pars compacta (SNpc), ventrale tegmental gebied (VTA) en retrorubral veld (RRF) 10, 11. De neuronen in SNpc en VTA aanleiding geven tot belangrijke dopaminerge paden, mesocorticale, mesolimbic en Nigro-striatum, die betrokken zijn bij functies zoals de controle van de emotie, motivatie en motorische gedrag. Verdwijnen van neuronen in SNpc en functionele verstoring van het nigrostriatale systeem de voornaamste pathologische kenmerk van de tweede meest prominente neurodegeneratieve stoornis, ziekte van Parkinson (PD) 12,13. Voor therapeutische benaderingen symptomen van de ziekte niet stoppen of vertragen degeneratie en de oorzaken van de langzame, progressieve celverlies nog onbekend 14-16. Daarom is de ontwikkeling van in vivo en in vitro technieken voor studie van de developmental, biochemische en fysiologische eigenschappen van deze neuronale populatie is kennis van de etiologie van PD en de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen.
Hier beschrijven we een geoptimaliseerde werkwijze voor dissectie, dissociatie en het kweken van primaire neuronen van embryonale muizen en ratten ventrale middenhersenen, waardoor langdurige in vitro overleving van de dopaminergische neuronen van dit gebied, waardoor bestuderen van de processen zoals differentiatie, axonale uitgroei en synaps formatie. Enkele voordelen van deze protocollen zijn toegenomen aantal dekglaasjes per embryo, onafhankelijk van groeifactoren en de lengte van in vitro overleving maximaliseren ontwikkeling van neuronen 4. Deze werkwijze kan in vivo studies aanvullen waardoor het begrijpen van de onderliggende mechanismen van normale fysiologische functies van de dopaminerge neuronen en progressieve degeneratie van het neuronal populatie cytotoxische en genetische modellen van de ziekte van Parkinson.
Een van de belangrijkste nadelen van dit protocol is het gebrek aan onderscheid tussen SNpc en VTA dopaminerge neuronen. Dit probleem bestaat omdat bij het kweken (E12.5 bij muizen of ratten E14.5) terminal differentiatie van de neuronen en hun regionalisering niet volledig is en terwijl het gebruik van oudere embryo's mogelijk is, vermindert de overleving van de neuronen vanwege axotomy. Onderscheid maken tussen de twee populaties zou mogelijk zijn door middel van immunocytochemie, met behulp van antilichamen tegen specifieke markers voor elke populatie zoals GIRK2 (tot SNpc neuronen te identificeren) en Calbindin (naar VTA neuronen) 17.
De geoptimaliseerde plating in hoofdstuk 4 beschreven vermindert de hoeveelheid embryo's per experiment met meer dan 50% en dus bijdraagt aan de vermindering van het gebruik van dieren in het onderzoek. De meest kritische stappen voor de overlevingskansen van de cultusgrosso de tijd tussen euthanization van de dammen en volledige ontleding van de embryonale midbrains (stap 2,1-2,8), alsmede de volledige verwijdering van de hersenvliezen (stap 2.6 Figuur 1H).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12 | Invitrogen | 11330 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 24020-117 | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS) | Invitrogen | 16140 | |
| N2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water | Sigma | G8769 | |
| Bovine serum albumin BSA | Sigma | A9430 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Trypsin (0.05% (wt/vol) | Invitrogen | 25300 | |
| Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested | Sigma | A9418 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody | Pel-Freez Biologicals | P60101-0 | |
| Poly-L-ornithine, 0.01% solution | Sigma | P4957 | |
| Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody | Millipore | MAB3418 | |
| Anti-Synapsin-1 antibody | Millipore | AB1543P | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21206 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11016 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A-21203 | |
| Trypan blue solution (0.4% (wt/vol)) | Biowhittaker | 17-942E | |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Inverted phase contrast microscope | Carl Zeiss | Axiovert 40 C | |
| Dumont Forceps | Fine Scientific Tools | May-45 | |
| Cover Slip Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11251-33 | |
| Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11245-30 | |
| Blade Holder/Breaker Flat Grip - 11cm | Fine Scientific Tools | 10052-11 | |
| Student Iris Scissors - Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | |
| Fiber optic halogen illuminator | Nikon | MKII | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20C | |
| Hemocytometer | Proscitech | SVZ2NIOU | |
| 0.2 µm sterile filter units | Nalgene | NL-CE-156-4020 | |
| 100x20 mm Petri dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12 mm | Bellco Glass | 1943-10012 |
References
- Prasad, K. N., et al. Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).
- Fall, C. P., Bennett, J. P. Characterization and time course of MPP+ -induced apoptosis in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. J Neurosci Res. 55, 620-628 (1999).
- Choi, H. K., Won, L., Roback, J. D., Wainer, B. H., Heller, A. Specific modulation of dopamine expression in neuronal hybrid cells by primary cells from different brain regions. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 8943-8947 (1992).
- Alavian, K. N., Sgado, P., Alberi, L., Subramaniam, S., Simon, H. H. Elevated P75NTR expression causes death of engrailed-deficient midbrain dopaminergic neurons by Erk1/2 suppression. Neural Dev. 4, 11 (2009).
- Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain. 133, 2022-2031 (2010).
- Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Animal models of Parkinson's disease. Bioessays. 24, 308-318 (2002).
- Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson's disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Res. 318, 215-224 (2004).
- Chesselet, M. F., Richter, F. Modelling of Parkinson's disease in mice. Lancet neurology. 10, 1108-1118 (2011).
- Takeshima, T., Johnston, J. M., Commissiong, J. W. Mesencephalic type 1 astrocytes rescue dopaminergic neurons from death induced by serum deprivation. J Neurosci. 14, 4769-4779 (1994).
- Sgado, P., et al. Slow progressive degeneration of nigral dopaminergic neurons in postnatal Engrailed mutant mice. PNAS. 103, 15242-15247 (2006).
- Alavian, K. N., et al. The lifelong maintenance of mesencephalic dopaminergic neurons by Nurr1 and engrailed. J Biomed Sci. 21, 27 (2014).
- Simon, H. H., Bhatt, L., Gherbassi, D., Sgado, P., Alberi, L. Midbrain dopaminergic neurons: determination of their developmental fate by transcription factors. Ann N Y Acad Sci. 991, 36-47 (2003).
- Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
- Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radic Biol Med. 62, 132-144 (2013).
- Schapira, A. H. Aetiopathogenesis of Parkinson's disease. J Neurology. 258, S307-S310 (2011).
- Chung, C. Y., et al. Cell type-specific gene expression of midbrain dopaminergic neurons reveals molecules involved in their vulnerability and protection. Hum Mol Gen. 14, 1709-1725 (2005).
