Introduction
La perte de neurones dopaminergiques de la substantia nigra pars compacta conduit à des symptômes moteurs cardinal de la maladie de Parkinson (MP), le deuxième trouble neurodégénératif le plus répandu. La cause sous-jacente de la disparition de cette population neuronale mésencéphalique ne est pas connu. Pour étudier les voies biochimiques responsables du développement et de moduler les propriétés neurophysiologiques et la survie des neurones MESDA, plusieurs culture cellulaire et des systèmes de modèles animaux ont été utilisés. Les lignées cellulaires immortalisées, y compris la dopaminergique chez le rat lignée cellulaire 1RB 3 AN 27 (N27), le dopaminergique humain lignée cellulaire de neuroblastome SH-SY5Y, la lignée cellulaire hybride dopaminergique de la souris MN9D et mésencéphalique humaine LUHMES cellules ont été utilisées pour des études mécanistiques biochimiques et limitées 1 -5. Pour l'étude de la perte spécifique de neurones MESDA, plusieurs neurotoxine-fondées et les modèles génétiques ont été développés 6-8. Cultures mésencéphale ventrales primaires, Fournir un outil indispensable pour étudier les propriétés neuronales et synaptiques des neurones dopaminergiques et les voies impliquées dans la pathogenèse de cette maladie fréquente.
Ici, nous présentons un protocole détaillé pour l'isolement des neurones dopaminergiques mésencéphaliques, qui contient des modifications résultant en la capacité de survie plus élevé et un rendement accru de lamelles par embryon. L'utilisation de la souris E12.5 mésencéphale pré-mature (E14.5 chez le rat) améliore la survie. À cet âge neurones ne ont pas encore développé axones, ce qui laisse des cellules intactes lors de la dissection et minimise la contrainte augmentant ainsi considérablement la viabilité. En outre, dissection minutieuse du mésencéphale ventral, tel que décrit dans l'article 2 de ce protocole, améliore encore la capacité de survie. Pour augmenter le nombre de lamelles par embryon, une méthode de placage de remplacement est présenté dans la section 4 de ce protocole. Cela conduit à un rendement allant jusqu'à 10 lamelles par embryon par rapport aux lamelles de moins de 4conditions de placage classiques réduisant ainsi la quantité d'animaux par expérience.
Neurones en culture exposition excroissance des axones et des dendrites, forment des connexions synaptiques et révèlent la présence de marqueurs neuronaux et synaptiques faisant ces cultures appropriée pour l'imagerie de cellules vivantes, immunocytochimique et des études électrophysiologiques. En outre, l'utilisation de cultures de neurones facilite la manipulation génétique et pharmacologique. Excroissance de neurites de deux jours in vitro permet d'études sur le développement. En outre, la survie à long terme des cultures (jusqu'à six semaines) les rend appropriés pour l'étude de la lente, de la dégénérescence progressive de ces neurones.
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Protocol
REMARQUE: Les animaux ont été maintenus et manipulés en conformité avec les directives institutionnelles et toutes les procédures d'animaux ont été approuvés par la protection des animaux de l'Imperial College et le Home Office et de l'Université Harvard institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité (IACUC) examen éthique du corps (de AWERB) et, en conformité avec les règlements fédéraux et étatiques.
1. réactif et le matériel Setup
- Thaw, aliquote et stocker 1 mg / ml solution à -80 ºC laminine. Dissoudre 2 pi dans 1 ml de DMEM / F12, résultant en une concentration de revêtement de 1-2 mg / cm 2.
REMARQUE: Thaw laminine lentement sur la glace et se dissoudre dans le froid DMEM / F12 et immédiatement ajouter aux plaques / lamelles. - Diluer 75 ml de 0,01% Poly-L-ornithine dans 425 ml de PBS et conserver à 4 ºC.
REMARQUE: La durée de conservation de la solution de travail est à un mois. - Dissoudre 25% (poids / volume) de BSA dans du PBS, pH 7,4, et conserver à 4 ° C jusqu'à un year.
- Préparer 50% de FBS (dans HBSS) Moyens de désactivation.
- Préparer un milieu complet par addition de 50 U / ml de pénicilline et de la streptomycine, 1x supplément N2, 5% (vol / vol) de FBS, 0,36% de D - (+) - glucose (poids / volume), 0,25% de SAB (poids / volume) de DMEM / F12 et conserver à 4 ºC.
REMARQUE: La durée de conservation est de 10 jours. - La place des lamelles à 70% (vol / vol) d'éthanol bouillant pendant au moins 30 minutes pour éliminer toute trace de graisse et autoclave.
- La place des lamelles dans des plaques à 24 puits et ajouter 500 ul de solution de poly-L-ornithine à chaque puits. Incuber 1 h sous le capot de culture de tissus à la température ambiante puis, laver 3 fois avec 500 pi d'eau. Ajouter la solution de laminine 500 ul à chaque plaque et incuber O / N dans le humidifié incubateur de culture tissulaire à 37 ° C.
REMARQUE: si aucune lavages sont nécessaires après le traitement de la laminine, en lavant les poly-L-ornithine moins de trois fois entraîne la mort des cellules 24 h après la mise en culture. - Essuyez les conseils de pipettes en verre plus de gaz naturel ou torche fboiteux.
NOTE: Après cette étape, le diamètre de la pointe devrait être d'environ la moitié de sa taille normale. - Couper les bouchons de 1,5 ml microtubes, en utilisant un autoclave ciseaux et autoclave.
2. Dissection du mésencéphale embryonnaire ventral
- Narcotiser chronométré enceintes (E12.5) barrages par inhalation de CO 2 puis euthanasier par dislocation cervicale.
- Pulvériser l'abdomen avec 70% d'éthanol et de faire une incision abdominale jusqu'à ce que les sacs de l'utérus sont tous exposés. Aide d'une pince coupe l'attachement vaginale et supprimer utérus. Placez l'utérus glacée HBSS, dans une boîte de Pétri de 100 mm.
- Retirer embryons de l'utérus et le sac amniotique, en utilisant une pince (figure 1C). La place embryons dans HBSS glacée fraîche.
NOTE: Le rectangle dans la figure 1D indique l'emplacement du mésencéphale ventral embryonnaire. - Placez les embryons sous un microscope de dissection (10x de grossissement) et disséquer le mésencéphalearc en coupant le cerveau à l'isthme et la région frontière mésencéphalique-diencéphalique, en utilisant la bioscissor et pince (figure 1E, se il vous plaît se référer à la figure 1A pour les lignes de l'incision).
- Après avoir sorti l'ensemble du mésencéphale, faire une coupe dans le mésencéphale médiodorsal (figure 1F).
- Retirer méninges, en utilisant deux pinces (figure 1H).
REMARQUE: ÉTAPE CRITIQUE: Cette étape est essentielle pour un rendement optimal et la survie neuronale. Étant donné que les conditions de culture sont optimales pour les cellules du cerveau, la plupart des cellules du tissu environnant meurent après l'étalement et le signal apoptotique à partir de ce tissu peut endommager l'intégrité des cultures. - Aplatir le tissu mésencéphale sur la boîte de Pétri pour observer la forme de papillon et couper environ la moitié de chaque aile, à l'aide d'une lame de rasoir stérilisé (Figure 1 H, I).
REMARQUE: la figure 1J représente le mésencéphale ventral isolé. - Transférer lemorceau de mésencéphale ventral dans glacée HBSS dans un tube conique de 15 ml et procéder à la prochaine embryon.
REMARQUE: les étapes 2.1 à 2.8 ne devrait pas prendre plus d'une heure. Garder les embryons au-delà de ce laps de temps sur la glace diminue de manière significative la viabilité des cellules.
3. La dissociation des cellules ventrale Mésencéphale
- Transférer les morceaux de mésencéphale ventral sous une hotte à flux laminaire. Retirez le HBSS et ajouter 1 ml préchauffé (37 ºC) 0,05% de trypsine-EDTA dans le tube conique (volumes assez pour jusqu'à 12 morceaux de mésencéphale ventral). Incuber le tissu à 37 ° C pendant 5 à 10 min.
- Retirer la trypsine-EDTA sous le capot et ajouter du milieu de désactivation de 1 ml (le sérum désactivera la trypsine) pour le tissu.
- Éliminer le milieu de désactivation et laver le tissu dans 1 ml de milieu complet deux fois.
REMARQUE: Evitez de retirer tout le milieu du tube et pipetage le tissu, pour éviter de jeter les cellules dissociées. - Ajouter 1 ml de milieu complet et triturate le tissu avec une pipette en verre poli-le-feu. Eviter la formation de bulles et de continuer jusqu'à ce trituration suspension cellulaire unique est atteint.
Note: Habituellement, 8-10 traverse la pointe restreint sont obligatoires pour la dissociation complète. - Centrifuger les cellules à 400 g pendant 5 min à température ambiante et retirez le support.
- Remettre en suspension le culot dans 1 ml de milieu complet en pipettant doucement de haut en bas jusqu'à quatre fois.
4. Les cellules Placage ventrale Mésencéphale
- Mélanger 10 ul de la suspension cellulaire avec une solution de bleu Trypan 90 pi et de compter le nombre de cellules avec un hémocytomètre.
NOTE: La viabilité des cellules peut également être vérifiée à ce stade. - Placez stérilisés bouchon d'un tube à centrifuger de 100 mm boîtes de Pétri et de transférer les poly-L-ornithine / laminine lamelles, en utilisant une pince, un à la fois au-dessus des bouchons.
REMARQUE: Ne pas laver les lamelles et éviter le séchage de la laminine, car cela pourrait provoquer uneven cultures et diminution de la capacité de survie des cellules. - Ajuster le volume à 1 500 cellules par ul de 1 par addition de milieu complet et ajouter 100 ul (total de 150 000 cellules) de la suspension de cellules au-dessus de chaque lamelle (le volume est optimale pour couvrir la surface de la lamelle couvre-objet sans déversement). Fermez les boîtes de Pétri et incuber pendant 1 h dans un incubateur de culture de tissu humidifié (37 ° C, 5% de CO 2).
REMARQUE: étape critique: Cette étape est nécessaire pour améliorer la fixation et la viabilité des cellules et pour augmenter le nombre de lamelles par embryon. Alternativement, les cellules peuvent être transférés directement dans les puits (contenant lamelles couvre), mais le nombre de cellules devrait être porté à 350 000 par puits (au lieu de 150 000). En d'autres termes, en utilisant cette méthode, 8-10 lamelles peuvent être acquis, tandis que le transfert direct donne environ 3-4 lamelles en raison des cellules, qui se fixent sur les plaques (à côté ou au-dessous des lamelles). La moyenne viabilité des cultures, en utilisant cette méthode était d'environ 90%.
5. Culture croissance et l'entretien
- Après 1 h d'incubation, transférer soigneusement les lamelles y compris le milieu dans des plaques à 24 puits contenant 400 ul préchauffé (à 37 ° C) du milieu complet (volume total: 500 ul). Incuber les cellules O / N à 37 ºC.
- De 24 h après l'incubation des puits, ajouter doucement 500 pi de milieu complet dans chaque puits.
REMARQUE: Les premières heures est l'étape la plus critique pour la survie des neurones dopaminergiques et le nombre de cellules survivantes ne change pas de façon significative au-delà de ce point. - Ne ajoutez pas supplémentaire pour les cultures pour les deux premières semaines ou jusqu'à ce que le milieu devient jaune. Si la culture depuis plus de deux semaines ou des changements de couleur moyennes au jaune, l'échange de la moitié des médias (500 pi) avec frais milieux complets préchauffées (généralement toutes les deux semaines).
NOTE: les neurones dopaminergiques au sein de lacultures seraient survivre pendant plus de six semaines dans ces conditions.
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Representative Results
Immunohistochimie contre la tyrosine hydroxylase (Th) montre que, entre 0,5 à 1% des cellules en culture sont dopaminergique. Projections neuronales apparaissent dans deux heures après placage et par le premier jour, les axones et les dendrites se distinguent (Figure 2), en utilisant la tyrosine hydroxylase (TH) et la protéine 2 (carte2) anticorps associée aux microtubules (Figure 3). Les neurones de survivre pendant plus de six semaines, et montrent une vaste excroissance. Le ratio neurone-glie dans les cultures est directement liée à la concentration de sérum dans le milieu, comme indiqué précédemment. Tout en éliminant FBS des cultures peut produire des cultures de neurones relativement purs, nous et d'autres avons trouvé que l'addition de sérum augmente la survie des neurones dopaminergiques dans la culture 9.
Figure 1. Procédure pour l'isolement demésencéphale embryonnaire ventral. La vue schématique de cerveau E12.5 de souris, les limites du mésencéphale (lignes en pointillés), et la position approximative de la région d'intérêt, le mésencéphale ventral, dans le rectangle rouge (A) et les outils de dissection du mésencéphale ventral , un bioscissor, foreceps, et un porte-lame (B) sont présentés. Les embryons sont retirés du sac amniotique par rupture de ce (C). La région d'intérêt, le mésencéphale ventral, est représenté par le rectangle (D). Mésencéphale est isolé en coupant l'isthme (à gauche de la pièce coupée) et la limite de mésencéphale-cerveau antérieur (à droite; E). La partie médiodorsal du mésencéphale est coupée (F) et il est aplati, à ressembler à une forme de papillon (G, H). Ensuite, les méninges sont dissociées à partir de cerveau (H) et le mésencéphale ventral (rectangle) est isolé à partir de la partie dorsale en coupant la moitié des ailes, à l'aide d'une lame de rasage
Figure 2. images fond clair représentatifs de cultures mésencéphale ventral. Les images ont été prises sur DIV1 (à gauche), DIV2 (au centre), et DIV15 (à droite). Barre d'échelle:. 50 pm Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. La survie à long terme, excroissance du processus et la synaptogenèse dans deux semaines old ventrales cultures de mésencéphale. neurones dopaminergiques Mésencéphale, identifiés par l'anticorps de la tyrosine hydroxylase poussent vastes axones et des dendrites, identifiés par l'anticorps carte2, dans les cultures du mésencéphale ventral deux semaines après la dissociation des embryons E12.5. Les dendrites peuvent être distingués par le chevauchement des processus et Th carte2-positives, où seulement des fibres TH positifs représentent des axones. Les anticorps ont été utilisés à une dilution de 1: 200. Barre d'échelle:. 20 pm Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les neurones dopaminergiques dans le mésencéphale sont la principale source de la dopamine dans le système nerveux central. Ils sont divisés en trois groupes, substantia nigra pars compacta (SNPC), Surface tegmentale ventrale (VTA) et sur le terrain retrorubral (RRF) 10, 11. Les neurones dans SNPC et VTA donnent lieu à des grandes voies dopaminergiques, mésocorticales, mésolimbiques et nigro-striée, impliquées dans les fonctions telles que le contrôle de l'émotion, la motivation et le comportement moteur. Disparition des neurones dans SNpc et la perturbation fonctionnelle du système nigro-strié est la principale caractéristique pathologique du deuxième trouble neurodégénératif le plus important, la maladie de Parkinson (PD) 12,13. Approches thérapeutiques actuelles traitent les symptômes de la maladie et ne pas stopper ou de ralentir la dégénérescence et les causes de la perte lente, progressive de cellules sont encore inconnues 14-16. Par conséquent, le développement in vivo et dans des techniques in vitro pour l'étude de la developmental, biochimiques et physiologiques caractéristiques de cette population neuronale est impératif de comprendre l'étiologie de la maladie de Parkinson et au développement de nouvelles approches thérapeutiques.
Nous décrivons ici un procédé optimisé pour la dissection, la dissociation et la culture des neurones primaires de souris embryonnaire et le rat mésencéphale ventral, ce qui conduit à long terme de la survie in vitro des neurones dopaminergiques de cette région, ce qui permet l'étude des processus tels que la différenciation, axonale excroissance et la formation des synapses. Plusieurs avantages de ce protocole comprennent l'augmentation du nombre de lamelles par embryon, l'indépendance de facteurs de croissance et la durée de la survie in vitro, en maximisant le développement des neurones 4. Cette méthode peut compléter les études in vivo en permettant à la compréhension des mécanismes sous-jacents des fonctions physiologiques normales des neurones dopaminergiques du mésencéphale, ainsi que la dégénérescence progressive de ce neuronePopulation al cytotoxiques dans les modèles génétiques et de la maladie de Parkinson.
L'un des principaux inconvénients de ce protocole est l'absence de distinction entre les neurones dopaminergiques SNPC et VTA. Ce problème existe parce que au moment de la culture (E12.5 chez la souris ou chez les rats E14.5) différenciation terminale des neurones et leur régionalisation ne est pas complète et tandis que l'utilisation d'embryons âgés est possible, il réduit considérablement la survie de la axotomie des neurones due à. Distinguer les deux populations serait possible par immunocytochimie, en utilisant des anticorps contre des marqueurs spécifiques pour chaque population, telles que Girk2 (pour identifier les neurones SNPC) et Calbindin (pour identifier les neurones VTA) 17.
Le placage optimisé décrit dans la section 4 diminue la quantité d'embryons par expérience de plus de 50% et donc contribue à réduire l'utilisation des animaux dans la recherche. Les étapes les plus critiques pour la survie de la secte-mesures sont le temps entre l'euthanasie des barrages et dissection complète des midbrains embryonnaires (étape 2.1 à 2.8), ainsi que l'élimination complète des méninges (étape 2.6, figure 1H).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12 | Invitrogen | 11330 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 24020-117 | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS) | Invitrogen | 16140 | |
| N2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water | Sigma | G8769 | |
| Bovine serum albumin BSA | Sigma | A9430 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Trypsin (0.05% (wt/vol) | Invitrogen | 25300 | |
| Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested | Sigma | A9418 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody | Pel-Freez Biologicals | P60101-0 | |
| Poly-L-ornithine, 0.01% solution | Sigma | P4957 | |
| Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody | Millipore | MAB3418 | |
| Anti-Synapsin-1 antibody | Millipore | AB1543P | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21206 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11016 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A-21203 | |
| Trypan blue solution (0.4% (wt/vol)) | Biowhittaker | 17-942E | |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Inverted phase contrast microscope | Carl Zeiss | Axiovert 40 C | |
| Dumont Forceps | Fine Scientific Tools | May-45 | |
| Cover Slip Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11251-33 | |
| Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11245-30 | |
| Blade Holder/Breaker Flat Grip - 11cm | Fine Scientific Tools | 10052-11 | |
| Student Iris Scissors - Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | |
| Fiber optic halogen illuminator | Nikon | MKII | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20C | |
| Hemocytometer | Proscitech | SVZ2NIOU | |
| 0.2 µm sterile filter units | Nalgene | NL-CE-156-4020 | |
| 100x20 mm Petri dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12 mm | Bellco Glass | 1943-10012 |
References
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