Introduction
सब्सटेंशिया निग्रा से डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की हानि कॉम्पेक्टा पार्किंसंस रोग (पीडी), दूसरा सबसे प्रचलित neurodegenerative विकार के कार्डिनल मोटर लक्षण की ओर जाता है pars। इस mesencephalic न्यूरोनल आबादी के निधन के पीछे कारण ज्ञात नहीं है। इस्तेमाल किया गया है विकास और neurophysiological गुण और mesDA न्यूरॉन्स, कई सेल संस्कृति और पशु मॉडल प्रणाली के अस्तित्व के नियमन के लिए जिम्मेदार जैव रासायनिक रास्ते का अध्ययन करने के लिए। चूहे डोपामिनर्जिक सेल लाइन 1RB 3 एक 27 (N27), मानव डोपामिनर्जिक neuroblastoma सेल लाइन एसएच SY5Y, MN9D और मानव mesencephalic कोशिकाओं LUHMES माउस डोपामिनर्जिक संकर सेल लाइन सहित अमर सेल लाइनों, जैव रासायनिक और सीमित यंत्रवत अध्ययनों एक के लिए इस्तेमाल किया गया है -5। MesDA न्यूरॉन्स के विशिष्ट नुकसान के अध्ययन के लिए, कई न्यूरोटॉक्सिन आधारित और आनुवंशिक मॉडल 6-8 विकसित किया गया है। प्राथमिक उदर मध्यमस्तिष्क संस्कृतियों, डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की न्यूरोनल और synaptic गुण और इस आम बीमारी के रोगजनन में शामिल रास्ते के अध्ययन के लिए एक अनिवार्य उपकरण प्रदान करते हैं।
यहाँ हम उच्च survivability और भ्रूण प्रति coverslips की वृद्धि की उपज में जिसके परिणामस्वरूप संशोधनों में शामिल है जो mesencephalic डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के अलगाव, के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे। पूर्व परिपक्व E12.5 माउस mesencephalon (चूहे में E14.5) का प्रयोग जीवित रहने को बढ़ाता है। इस उम्र में न्यूरॉन्स विच्छेदन के दौरान बरकरार कोशिकाओं को छोड़ देता है, जो अभी तक एक्सोन विकसित की है और जिससे काफी व्यवहार्यता तनाव को बढ़ाने के कम से कम नहीं है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल की धारा 2 में वर्णित के रूप में उदर मध्यमस्तिष्क से सावधान विच्छेदन, आगे जीवित रहने को बढ़ाता है। भ्रूण प्रति coverslips की संख्या बढ़ाने के लिए, एक वैकल्पिक चढ़ाना विधि इस प्रोटोकॉल की धारा 4 में प्रस्तुत किया है। इस के तहत चार coverslips की तुलना में भ्रूण प्रति अप करने के लिए 10 coverslips की उपज के लिए ले जाता हैमानक चढ़ाना शर्तों इस प्रकार प्रयोग प्रति जानवरों की राशि को कम करने।
Axons और dentrites की संस्कृति प्रदर्शनी परिणाम में न्यूरॉन्स, synaptic कनेक्शन फार्म और लाइव सेल इमेजिंग, immunocytochemical और electrophysiological अध्ययन के लिए इन संस्कृतियों उपयुक्त बनाने न्यूरोनल और synaptic मार्कर की उपस्थिति का पता चलता है। इसके अलावा, neuronal संस्कृतियों का उपयोग आनुवंशिक और pharmacologic हेरफेर की सुविधा। इन विट्रो में 2 दिन से neurites की परिणाम विकासात्मक अध्ययन के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, संस्कृतियों के दीर्घकालिक अस्तित्व (अप करने के लिए छह सप्ताह) इन न्यूरॉन्स की धीमी गति, प्रगतिशील अध: पतन के अध्ययन के लिए उन्हें उपयुक्त बनाता है।
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Protocol
नोट: जानवरों बनाए रखा है और अनुमोदित किया गया संस्थागत दिशा निर्देशों और सभी पशु प्रक्रियाओं के अनुपालन में संभाला इंपीरियल कॉलेज के पशु कल्याण द्वारा किए गए थे और नैतिक समीक्षा शरीर (AWERB) और गृह मंत्रालय और हार्वर्ड विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC), संघीय और राज्य के नियमों के अनुपालन में।
1. अभिकर्मक और उपकरण सेटअप
- पिघलना, विभाज्य और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर 1 मिलीग्राम / एमएल laminin समाधान। 1-2 माइक्रोग्राम प्रति / 2 सेमी की एक परत एकाग्रता में जिसके परिणामस्वरूप, 1 मिलीलीटर DMEM / F12 में 2 μl भंग।
नोट: धीरे-धीरे बर्फ पर और प्लेट्स / coverslips के लिए इसे जोड़ने के तुरंत ठंडा DMEM / F12 में भंग और पिघलना Laminin। - 4 डिग्री सेल्सियस पर 75 एमएल 0.01% 425 मिलीलीटर पीबीएस में पाली ओर्निथिन एल और दुकान का पतला।
नोट: कार्य समाधान की शेल्फ जीवन एक महीने के लिए है। - एक तु अप करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 25% (WT / खंड) पीबीएस में बीएसए, पीएच 7.4, और दुकान भंगगिरफ्तारी।
- (HBSS में) 50% FBS के क्रियाशीलता छोड़ना मीडिया तैयार करें।
- (+) - - ग्लूकोज (WT / खंड), 0.25% बीएसए (WT / खंड) के लिए 50 यू / एमएल पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1x एन 2 पूरक, 5% (खंड / खंड) FBS के, 0.36% डी जोड़कर पूरा मध्यम तैयार DMEM / F12 और दुकान 4 डिग्री सेल्सियस पर।
नोट: शेल्फ जीवन 10 दिनों के लिए है। - कम से कम 30 मिनट के लिए 70% (खंड / खंड) इथेनॉल उबलते में रखें coverslips के तेल और आटोक्लेव के किसी भी अंश को हटाने के लिए।
- जगह 24 अच्छी तरह से प्लेट में coverslips और प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 500 μl पाली एल ओर्निथिन समाधान जोड़ें। आरटी पर टिशू कल्चर हुड के तहत 1 घंटा सेते हैं और फिर, 500 μl पानी के साथ 3 बार धोएं। प्रत्येक थाली करने के लिए 500 μl laminin समाधान जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर humidified टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में हे / एन सेते हैं।
नोट: कोई washes के 24 घंटे के संवर्धन के बाद कोशिकाओं की मौत में पाली एल ओर्निथिन कम से कम तीन बार परिणाम धोने, laminin के उपचार के बाद आवश्यक हैं। - प्राकृतिक गैस या मशाल च अधिक कांच pipettes के सुझावों पॉलिशलंगड़ा।
नोट: इस कदम के बाद टिप के व्यास अपने सामान्य आकार के आधे के बारे में होना चाहिए। - एक autoclaved कैंची और आटोक्लेव का उपयोग करते हुए, 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब की टोपी काटें।
भ्रूण वेंट्रल मध्यमस्तिष्क 2. विच्छेदन
- सुलाना समय गर्भवती (E12.5) सीओ 2 साँस लेना द्वारा बांधों और फिर गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से euthanize।
- 70% इथेनॉल के साथ पेट स्प्रे और गर्भाशय की थैलियों सब उजागर कर रहे हैं जब तक एक पेट चीरा बनाते हैं। का प्रयोग संदंश योनि लगाव कटौती और गर्भाशय को हटा दें। एक 100 मिमी पेट्री डिश में, बहुत ठंडा HBSS में गर्भाशय रखें।
- संदंश (चित्रा 1C) का उपयोग कर, गर्भाशय और एमनियोटिक थैली से भ्रूण निकालें। ताजा बर्फ ठंड HBSS में जगह भ्रूण।
नोट: चित्रा -1 में आयत भ्रूण उदर मध्यमस्तिष्क के स्थान को इंगित करता है। - एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप (10x बढ़ाई) के तहत भ्रूण प्लेस और mesencephalic काटना, स्थलडमरूमध्य और mesencephalic-diencephalic सीमा क्षेत्र में मस्तिष्क काटने bioscissor और संदंश का उपयोग करके चाप (चित्रा 1E, चीरा की लाइनों के लिए 1 ए चित्र देखें)।
- पूरे मध्यमस्तिष्क बाहर लेने के बाद, mediodorsal मध्यमस्तिष्क (चित्रा 1F) में कटौती कर सकते हैं।
- दो संदंश (चित्रा 1H) का उपयोग कर, तानिका निकालें।
नोट: महत्वपूर्ण कदम: यह कदम इष्टतम न्यूरोनल उपज और अस्तित्व के लिए आवश्यक है। संस्कृति की स्थिति मस्तिष्क की कोशिकाओं के लिए इष्टतम हैं, आसपास के ऊतकों से कोशिकाओं के सबसे चढ़ाना के बाद मर जाते हैं और इस ऊतक से apoptotic संकेत संस्कृतियों की अखंडता को नुकसान हो सकता है। - एक निष्फल शेविंग ब्लेड (चित्रा 1H, मैं) का उपयोग कर, तितली के आकार का निरीक्षण और प्रत्येक शाखा के लगभग आधे में कटौती के लिए पेट्री डिश पर मध्यमस्तिष्क ऊतक समतल।
नोट: चित्रा 1J पृथक उदर मध्यमस्तिष्क दर्शाया गया है। - स्थानांतरणएक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में बर्फ ठंड HBSS में उदर मध्यमस्तिष्क का टुकड़ा और अगले भ्रूण के साथ आगे बढ़ना।
नोट: 2.1-2.8 से अधिक 1 घंटा नहीं लेना चाहिए कदम। बर्फ पर इस समय सीमा के परे भ्रूण ध्यान में रखते हुए काफी सेल व्यवहार्यता कम हो जाती है।
वेंट्रल मध्यमस्तिष्क प्रकोष्ठों के 3. हदबंदी
- एक लामिना का प्रवाह हुड के तहत उदर मध्यमस्तिष्क के टुकड़े स्थानांतरण। HBSS निकालें और (उदर मध्यमस्तिष्क के ऊपर से 12 टुकड़े के लिए पर्याप्त मात्रा) शंक्वाकार ट्यूब में पूर्व गर्म 1 मिलीलीटर (37 डिग्री सेल्सियस) 0.05% trypsin-EDTA जोड़ें। 5-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक सेते हैं।
- हुड के तहत ट्रिप्सिन-EDTA के निकालें और ऊतकों को 1 मिलीलीटर डे-सक्रियण मध्यम (सीरम ट्रिप्सिन निष्क्रिय होगा) जोड़ें।
- क्रियाशीलता छोड़ना मध्यम निकालें और दो बार पूरा मध्यम 1 मिलीलीटर में ऊतक धो लें।
नोट: अलग कोशिकाओं discarding को रोकने के लिए, ट्यूब से सभी मध्यम हटाने और ऊतक pipetting से बचें। - 1ml पूरा मध्यम और trit जोड़ेंएक आग पॉलिश कांच विंदुक के साथ ऊतक यूरेट। बुलबुले के गठन से बचने और एकल कक्ष निलंबन हासिल की है, जब तक triturating जारी है।
नोट: आमतौर पर, 8-10 पूरा हदबंदी के लिए आवश्यक हैं प्रतिबंधित टिप के माध्यम से गुजरता है। - आरटी पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और मध्यम हटा दें।
- पुनः निलंबित धीरे से ऊपर pipetting द्वारा पूरा मध्यम 1 मिलीलीटर में गोली और नीचे करने के लिए चार बार के लिए।
4. चढ़ाना वेंट्रल मध्यमस्तिष्क प्रकोष्ठों
- 90 μl Trypan नीले समाधान के साथ सेल निलंबन के 10 μl मिक्स और एक hemocytometer के साथ कोशिकाओं की संख्या गिनती।
नोट: कोशिकाओं की व्यवहार्यता भी इस स्तर पर जाँच की जा सकती है। - टोपी के शीर्ष पर एक समय में संदंश, एक का उपयोग कर, 100 मिमी पेट्री डिश में निष्फल microcentrifuge ट्यूब टोपी प्लेस और पाली एल ओर्निथिन / laminin लेपित coverslips हस्तांतरण।
नोट: coverslips धोने नहीं है और यह uneve का कारण हो सकता है, क्योंकि laminin के सूखने से बचनेएन संस्कृतियों और कोशिकाओं के जीवित रहने में कमी। - (मात्रा spillage के बिना coverslip की सतह को कवर करने के लिए इष्टतम है) पूरा मध्यम जोड़कर एक μl प्रति 1500 कोशिकाओं के लिए मात्रा समायोजित करें और प्रत्येक coverslip के शीर्ष पर सेल निलंबन के 100 μl (150,000 कोशिकाओं की कुल जोड़)। एक humidified टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में पेट्री डिश को बंद करें और एक घंटे के लिए उन्हें सेते (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2)।
नोट: महत्वपूर्ण कदम: यह कदम कोशिकाओं के लगाव और व्यवहार्यता को बढ़ाने के लिए और भ्रूण प्रति coverslips की संख्या बढ़ाने के लिए आवश्यक है। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं सीधे कुओं (युक्त coverslips), लेकिन कोशिकाओं की संख्या (बजाय 150000) के प्रति अच्छी तरह से 350,000 करने के लिए वृद्धि की जानी चाहिए में स्थानांतरित किया जा सकता है। प्रत्यक्ष हस्तांतरण क्योंकि (बगल में या coverslips के नीचे) प्लेटों को देते हैं जो कोशिकाओं, के बारे में 3-4 coverslips के पैदावार जबकि दूसरे शब्दों में, इस पद्धति का उपयोग में, 8-10 coverslips, हासिल किया जा सकता है। औसत viabiliइस पद्धति का उपयोग संस्कृतियों के Ty, 90% के आसपास था।
5. संस्कृति के विकास और रखरखाव
- ऊष्मायन के 1 घंटे के बाद, ध्यान से 400 μl पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस तक) पूरा मध्यम युक्त, 24 अच्छी तरह प्लेटों में मध्यम सहित coverslips के हस्तांतरण (कुल मात्रा: 500 μl)। 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं हे / एन सेते हैं।
- कुओं की ऊष्मायन के बाद 24 घंटे के भीतर, धीरे प्रत्येक कुएं में 500 μl पूरा मध्यम जोड़ें।
नोट: पहले कुछ घंटों डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के अस्तित्व और इस बिंदु से आगे काफी परिवर्तन नहीं करता जीवित कोशिकाओं की संख्या के लिए सबसे महत्वपूर्ण चरण है। - पहले दो हफ्तों के लिए या मध्यम पीला हो जाता है जब तक संस्कृतियों के लिए अतिरिक्त मीडिया न जोड़ें। दो सप्ताह से अधिक या ताजा पूरा पूर्व गर्म मीडिया (आम तौर पर हर दो सप्ताह) के साथ पीले, मीडिया का आदान-प्रदान आधा (500 μl) के लिए मध्यम रंग में परिवर्तन के लिए संवर्धन हैं।
नोट: भीतर डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्ससंस्कृतियों इन शर्तों के तहत अधिक से अधिक 6 सप्ताह के लिए बच जाएगा।
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Representative Results
Tyrosine hydroxylase (ध) के खिलाफ immunohistochemistry संस्कृति में कोशिकाओं की 0.5-1% के बीच डोपामिनर्जिक हैं कि पता चलता है। Tyrosine hydroxylase (ध) और microtubule जुड़े प्रोटीन 2 (MAP2) एंटीबॉडी (चित्रा 3) का उपयोग कर, neuronal अनुमानों चढ़ाना के बाद 2 घंटे के भीतर दिखाई देते हैं और पहले दिन से, axons और dendrites अलग पहचाना (चित्रा 2) हैं। न्यूरॉन्स अधिक से अधिक छह सप्ताह के लिए और जीवित रहने के व्यापक परिणाम दिखाते हैं। पहले से दिखाया के रूप में संस्कृतियों में न्यूरॉन glia अनुपात सीधे, मध्यम में सीरम की एकाग्रता से संबंधित है। अपेक्षाकृत शुद्ध neuronal संस्कृतियों उपज हो सकती संस्कृतियों से FBS के समय नष्ट करने, और हम दूसरों सीरम के अलावा संस्कृति 9 में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के survivability बढ़ जाती है कि मिल गया है।
के अलगाव के लिए 1. प्रक्रिया चित्राउदर मध्यमस्तिष्क के विच्छेदन के लिए लाल आयत (ए) और उपकरणों के भीतर भ्रूण उदर मध्यमस्तिष्क। E12.5 माउस मस्तिष्क के योजनाबद्ध दृश्य, मध्यमस्तिष्क सीमाओं (धराशायी लाइनों), और ब्याज के क्षेत्र की अनुमानित स्थिति, उदर मध्यमस्तिष्क, एक bioscissor, foreceps, और एक ब्लेड धारक (बी) दिखाए जाते हैं। भ्रूण यह (सी) rupturing से एमनियोटिक थैली से बाहर ले जाया जाता है। ब्याज, उदर मध्यमस्तिष्क के क्षेत्र, आयत (डी) द्वारा दिखाया गया है। मध्यमस्तिष्क (कट टुकड़ा के बाएं) स्थलडमरूमध्य और (; ई दाएं) मध्यमस्तिष्क-अग्रमस्तिष्क सीमा पर काटने से अलग है। मध्यमस्तिष्क के mediodorsal हिस्सा एक तितली के आकार (जी, एच) सदृश करने के लिए, (एफ) में कटौती कर रहा है और यह चपटा है। फिर, तानिका मस्तिष्क (एच) और उदर मध्यमस्तिष्क (आयत) एक शेविंग ब्लेड का उपयोग कर, पंखों का आधा काट द्वारा पृष्ठीय भाग से अलग है से अलग कर रहे हैं
चित्रा उदर मध्यमस्तिष्क संस्कृतियों के 2. प्रतिनिधि brightfield छवियों। छवियां DIV1 (बाएं) पर ले जाया गया, DIV2 (बीच में), और DIV15 (दाएं)। स्केल बार:। 50 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. लंबे समय तक जीवित रहने, दो सप्ताह ओ में प्रक्रियाओं के परिणाम और synaptogenesisएलडी उदर मध्यमस्तिष्क संस्कृतियों। मध्यमस्तिष्क डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स, tyrosine hydroxylase एंटीबॉडी द्वारा की पहचान की दो सप्ताह E12.5 भ्रूण से हदबंदी के बाद उदर मध्यमस्तिष्क संस्कृतियों में, MAP2 एंटीबॉडी द्वारा की पहचान की व्यापक axons और dendrites, बढ़ता है। Dendrites वें ही पॉजिटिव फाइबर एक्सोन का प्रतिनिधित्व करते हैं जहां वें और MAP2 पॉजिटिव प्रक्रियाओं, के ओवरलैप से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। 200: एंटीबॉडी एक के कमजोर पड़ने पर इस्तेमाल किया गया। स्केल बार:। 20 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
मध्यमस्तिष्क में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में डोपामाइन का मुख्य स्रोत हैं। वे तीन समूहों में बांटा जाता है, सब्सटेंशिया निग्रा पार्स कॉम्पेक्टा (SNpc), उदर tegmental क्षेत्र (वीटीए) और retrorubral क्षेत्र (आर आर ऍफ़) 10, 11। SNpc और वीटीए में न्यूरॉन्स ऐसी भावना, प्रेरणा और मोटर व्यवहार के नियंत्रण के रूप में कार्य में शामिल है, mesocortical mesolimbic और NIGRO-striatal प्रमुख डोपामिनर्जिक रास्ते, को जन्म दे। SNpc और nigrostriatal प्रणाली के कार्यात्मक विघटन में न्यूरॉन्स के निधन के दूसरे सबसे प्रमुख neurodegenerative विकार, पार्किंसंस रोग (पीडी) 12,13 के मुख्य रोग विशेषता है। वर्तमान चिकित्सकीय दृष्टिकोण रोग के लक्षणों को संबोधित करने और रोकने या अध: पतन धीमा और धीमी गति से, प्रगतिशील सेल नुकसान के कारणों का अभी भी 14-16 अज्ञात हैं नहीं है। इसलिए, विवो में और विकास के अध्ययन के लिए इन विट्रो तकनीक में की विकासntal, जैव रासायनिक, और इस न्यूरोनल आबादी की शारीरिक विशेषताओं पीडी के लिए और नए चिकित्सकीय दृष्टिकोण के विकास के लिए एटियलजि को समझने के लिए जरूरी है।
यहाँ हम इस तरह के भेदभाव, axonal के रूप में प्रक्रियाओं के अध्ययन की अनुमति, विच्छेदन, हदबंदी और इस क्षेत्र से डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की इन विट्रो अस्तित्व में लंबी अवधि में जो परिणाम भ्रूण माउस और चूहे उदर मध्यमस्तिष्क, से प्राथमिक न्यूरॉन्स के संवर्धन के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन परिणाम और synapse गठन। इस प्रोटोकॉल के कई फायदे न्यूरॉन्स 4 के विकास को अधिकतम वृद्धि हुई भ्रूण प्रति coverslips की संख्या, स्वतंत्रता वृद्धि कारकों से और इन विट्रो अस्तित्व की लंबाई, शामिल हैं। इस विधि इस न्यूरॉन के प्रगतिशील अध: पतन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मध्यमस्तिष्क डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की सामान्य शारीरिक कार्यों अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए अनुमति देने में vivo में पढ़ाई के पूरक हो सकता हैपार्किंसंस रोग के साइटोटोक्सिक और आनुवंशिक मॉडल में अल आबादी।
इस प्रोटोकॉल के मुख्य नुकसान में से एक SNpc और वीटीए डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के बीच भेद की कमी है। इस समस्या के कारण संवर्धन (E12.5 चूहों में या E14.5 चूहों में) न्यूरॉन्स के टर्मिनल भेदभाव के समय में मौजूद है और उनके regionalization पूरा नहीं हुआ है और पुराने भ्रूण का उपयोग संभव है, यह काफी के अस्तित्व कम कर देता है axotomy की वजह से न्यूरॉन्स। दो आबादी भेद ऐसे Girk2 के रूप में प्रत्येक आबादी के लिए विशिष्ट मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग, immunocytochemistry के द्वारा ही संभव होगा (SNpc न्यूरॉन्स की पहचान करने के लिए) और Calbindin 17 (वीटीए न्यूरॉन्स की पहचान करने के लिए)।
धारा 4 में वर्णित अनुकूलित चढ़ाना 50% से अधिक से प्रयोग प्रति भ्रूण की मात्रा घट जाती है और इसलिए अनुसंधान के क्षेत्र में पशुओं के उपयोग को कम करने के लिए योगदान देता है। पंथ के survivability के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदमहै, साथ ही तानिका के पूरी तरह हटाने (कदम 2.6, चित्रा 1H) - ures बांधों के euthanization और भ्रूण midbrains (2.8 2.1 कदम) का पूरा विच्छेदन के बीच के समय कर रहे हैं।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12 | Invitrogen | 11330 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 24020-117 | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS) | Invitrogen | 16140 | |
| N2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water | Sigma | G8769 | |
| Bovine serum albumin BSA | Sigma | A9430 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Trypsin (0.05% (wt/vol) | Invitrogen | 25300 | |
| Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested | Sigma | A9418 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody | Pel-Freez Biologicals | P60101-0 | |
| Poly-L-ornithine, 0.01% solution | Sigma | P4957 | |
| Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody | Millipore | MAB3418 | |
| Anti-Synapsin-1 antibody | Millipore | AB1543P | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21206 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11016 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A-21203 | |
| Trypan blue solution (0.4% (wt/vol)) | Biowhittaker | 17-942E | |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Inverted phase contrast microscope | Carl Zeiss | Axiovert 40 C | |
| Dumont Forceps | Fine Scientific Tools | May-45 | |
| Cover Slip Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11251-33 | |
| Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11245-30 | |
| Blade Holder/Breaker Flat Grip - 11cm | Fine Scientific Tools | 10052-11 | |
| Student Iris Scissors - Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | |
| Fiber optic halogen illuminator | Nikon | MKII | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20C | |
| Hemocytometer | Proscitech | SVZ2NIOU | |
| 0.2 µm sterile filter units | Nalgene | NL-CE-156-4020 | |
| 100x20 mm Petri dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12 mm | Bellco Glass | 1943-10012 |
References
- Prasad, K. N., et al. Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).
- Fall, C. P., Bennett, J. P. Characterization and time course of MPP+ -induced apoptosis in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. J Neurosci Res. 55, 620-628 (1999).
- Choi, H. K., Won, L., Roback, J. D., Wainer, B. H., Heller, A. Specific modulation of dopamine expression in neuronal hybrid cells by primary cells from different brain regions. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 8943-8947 (1992).
- Alavian, K. N., Sgado, P., Alberi, L., Subramaniam, S., Simon, H. H. Elevated P75NTR expression causes death of engrailed-deficient midbrain dopaminergic neurons by Erk1/2 suppression. Neural Dev. 4, 11 (2009).
- Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain. 133, 2022-2031 (2010).
- Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Animal models of Parkinson's disease. Bioessays. 24, 308-318 (2002).
- Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson's disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Res. 318, 215-224 (2004).
- Chesselet, M. F., Richter, F. Modelling of Parkinson's disease in mice. Lancet neurology. 10, 1108-1118 (2011).
- Takeshima, T., Johnston, J. M., Commissiong, J. W. Mesencephalic type 1 astrocytes rescue dopaminergic neurons from death induced by serum deprivation. J Neurosci. 14, 4769-4779 (1994).
- Sgado, P., et al. Slow progressive degeneration of nigral dopaminergic neurons in postnatal Engrailed mutant mice. PNAS. 103, 15242-15247 (2006).
- Alavian, K. N., et al. The lifelong maintenance of mesencephalic dopaminergic neurons by Nurr1 and engrailed. J Biomed Sci. 21, 27 (2014).
- Simon, H. H., Bhatt, L., Gherbassi, D., Sgado, P., Alberi, L. Midbrain dopaminergic neurons: determination of their developmental fate by transcription factors. Ann N Y Acad Sci. 991, 36-47 (2003).
- Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
- Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radic Biol Med. 62, 132-144 (2013).
- Schapira, A. H. Aetiopathogenesis of Parkinson's disease. J Neurology. 258, S307-S310 (2011).
- Chung, C. Y., et al. Cell type-specific gene expression of midbrain dopaminergic neurons reveals molecules involved in their vulnerability and protection. Hum Mol Gen. 14, 1709-1725 (2005).
