Introduction
흑질에서 도파민 신경 세포의 손실 compacta는 파킨슨 병 (PD), 두 번째 가장 흔한 신경 퇴행성 질환의 추기경 모터 증상에 이르게 갈 거예요. 이 중뇌 신경 인구의 서거의 근본적인 원인은 알려져 있지 않다. 사용 된 개발 및 신경 생리 학적 특성과 mesDA 신경 세포, 여러 세포 배양 및 동물 모델 시스템의 생존을 변조에 대한 책임을 생화학 적 경로를 연구합니다. 쥐의 도파민 세포주 1RB 3 27 (N27), 인간 도파민 신경 아세포종 세포주 SH-SY5Y, MN9D 인간 중뇌 세포를 LUHMES 마우스 도파민 하이브리드 세포주 포함 불멸화 세포주는, 생화학 및 제한된 역학적 연구 한 사용되어왔다 -5. mesDA 뉴런 특이 손실 연구를 위해 몇몇 신경 독소 계 유전 모델 6-8 개발되었다. 차 복부 중뇌 문화, 도파민 성 신경 세포의 신경 세포와 시냅스 특성이 일반적인 장애의 발병 기전에 관여하는 경로를 연구하기위한 필수 불가결 한 도구를 제공합니다.
여기에서 우리는 더 높은 생존 성 및 배아 당 된 커버의 수율 증가의 결과로 수정을 포함 중뇌 도파민 신경 세포의 분리에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. 사전 성숙한 E12.5 마우스 중뇌 (쥐에 E14.5)의 사용은 생존을 향상시킵니다. 이 나이에 신경 해부 동안 그대로 세포 잎, 이는 아직 축삭을 개발하여 현저하게 수명을 연장해 스트레스를 최소화하지 않았습니다. 또한,이 프로토콜의 2 절에 설명 된대로 복부 중뇌의주의 해부, 더 생존 성을 향상시킨다. 커버 슬립 당 배아의 개수를 증가시키기 위해 대안적인 도금법이 프로토콜 부 (4)에 제시되어있다. 이 아래 4 된 커버에 비해 배아 당 최대 10 된 커버의 수율로 연결표준 도금 조건 따라서 당 실험 동물의 양을 감소시킨다.
축삭과 dentrites의 문화 전시 가지 뉴런은 시냅스 연결을 형성 라이브 세포 이미징, 면역 세포 화학 및 전기 생리학 연구에 대한 이러한 문화가 적합 신경 세포와 시냅스 마커의 존재를 알 수있다. 또한, 신경 세포 배양의 사용은 유전 적 및 약리학 적 조작을 용이하게한다. 체외에서 2 일에서 신경 돌기의 가지 발달 연구 수 있습니다. 또한, 문화의 장기 생존율 (최대 6 주) 뉴런의 느린, 진보적 인 변성의 연구에 적합합니다.
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Protocol
참고 : 동물이 유지되고 승인 된 기관의 가이드 라인과 모든 동물의 절차를 준수하여 처리 제국 대학의 동물 복지로 하였다 윤리적 검토 기관 (AWERB) 및 홈 오피스와 하버드 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 연방 및 주 정부 규정에.
1. 시약 및 장비 설치
- 해동, 나누어지는 -80 ºC에서 저장 한 ㎎ / ㎖ 라미닌 솔루션입니다. 1-2 ㎍ / ㎠의 코팅 농도 결과 1ml를 DMEM / F12에서 2 μl를 녹인다.
참고 : 천천히 얼음과 판 / 커버 슬립에 추가 즉시 차가운 DMEM / F12에 용해 및 해동 라미닌. - 4 ºC에서 75 ml의 0.01 % 425 ml의 PBS에서 폴리 오르니 틴 L-및 저장의 희석.
참고 : 작업 솔루션의 유효 기간은 1 개월까지이다. - 너희 최대 4 ºC에서 25 % (중량 / 부피) PBS에서 BSA, pH가 7.4, 저장을 녹여아칸소.
- (HBSS)에 50 % FBS 비활성화 미디어를 준비합니다.
- (+) - - 포도당 (중량 / 부피), 0.25 %의 BSA (중량 / 부피) 50 U / ml의 페니실린과 스트렙토 마이신, 1 배 N2 보충, 5 % (부피 / 부피) FBS, 0.36 %의 D를 추가하여 완전한 매체 준비 DMEM / F12 및 저장 4 ºC에서.
참고 : 유효 기간 10 일입니다. - 적어도 30 분 동안 70 % (부피 / 부피) 에탄올을 끓는 배치 된 커버는 그리스와 오토 클레이브의 모든 흔적을 제거합니다.
- 장소 24 웰 플레이트에 된 커버와 각 웰에 500 ㎕의 폴리 -L- 오르니 틴 솔루션을 추가합니다. RT의 조직 문화 후드에서 1 시간을 품어하고, 500 μL 물로 3 회 세척한다. 각 플레이트에 500 μL의 라미닌 솔루션을 추가하고 37 ºC에서 가습 된 조직 문화 인큐베이터에서 O / N을 품어.
참고 : 더 세척이 24 시간 배양 한 후 세포의 죽음에 폴리 -L- 오르니 틴 세 번보다 적지 결과를 세척, 라미닌 처리 후 필요 없지만. - 천연 가스 토치 f를 통해 유리 피펫의 팁을 폴란드어절름발이.
참고 :이 단계 후에 팁의 직경이 정상 크기의 절반해야한다. - 멸균 된 가위와 오토 클레이브를 사용하여, 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브의 캡을 잘라.
배아 복부 중뇌 2. 해부
- 마취시키다가 시간이 초과 임신 (E12.5) CO 2 흡입 댐 후 자궁 전위에 의해 안락사.
- 70 % 에탄올로 복부를 스프레이 자궁 주머니가 모두 노출 될 때까지 복부 절개를합니다. 사용 집게 질 첨부 파일을 절단하고 자궁을 제거합니다. 100mm 페트리 접시에 얼음처럼 차가운 HBSS의 자궁을 놓습니다.
- 집게 (그림 1C)를 사용하여 자궁과 양막에서 배아를 제거합니다. 신선한 얼음처럼 차가운 HBSS에있는 장소 배아.
주 : 그림 1D의 사각형은 배아 복부 중뇌의 위치를 나타냅니다. - 해부 현미경 (10 배 확대)에서 배아를 놓고 중간 뇌를 해부, 지협과 중뇌 - diencephalic 경계 영역에서 뇌를 절단 bioscissor와 집게 사용하여 아치 (그림 1E를 절개 라인도 1a를 참조하십시오).
- 전체 중뇌을 복용 한 후, mediodorsal 중뇌 (그림 1 층)에 상처를합니다.
- 두 포셉 (그림 1H)를 사용하여, 수막을 제거합니다.
참고 : 중요한 단계 :이 단계는 최적의 신경 세포 수율과 생존을 위해 필수적이다. 배양 조건은 뇌 세포의 최적이기 때문에, 주위 조직에서 세포의 대부분은 도금 후 다이이 조직으로부터 세포 사멸 신호 문화 무결성이 손상된다. - 멸균 면도날 (도 1H, I)을 사용하여 나비 형상을 관찰하고, 각 날개의 약 절반을 절단하는 페트리 접시에 중뇌 조직을 병합.
주 : 그림 1J는 격리 된 복부 중뇌를 보여줍니다. - 이동15 ML 원뿔 관에 얼음처럼 차가운 HBSS로 복부 중뇌의 조각 다음 배아를 진행합니다.
참고 : 2.1-2.8 이상 1 시간을 안 단계. 얼음이 기간을 넘어 배아를 유지하는 것은 상당히 세포 생존 능력을 감소시킨다.
복부 중간 뇌 세포의 3 해리
- 층류 후드 하에서 복부 중뇌 조각을 전송. HBSS를 제거하고 (복부 중뇌의 최대 12 조각에 충분한 볼륨을) 원뿔 튜브로 예열 한 ㎖ (37 ° C) 0.05 % 트립신 EDTA를 추가합니다. 5 ~ 10 분 동안 37 ºC에서 조직을 품어.
- 후드 트립신 EDTA를 제거하고 조직을 1 ml의 탈 활성화 매체 (혈청 트립신을 비활성화합니다)를 추가합니다.
- 비활성화 매체를 제거하고 두 번 완전 배지 1 ㎖의의 조직을 씻는다.
주 : 해리 된 세포를 폐기하는 것을 방지하기 위해, 튜브의 모든 매체를 제거하고 조직을 피펫 피한다. - 1ml의 완전한 매체와 trit 추가화재 연마 유리 피펫으로 조직을 요산. 거품의 형성을 방지하고 단일 세포 현탁액이 달성 될 때까지 분쇄하여 계속합니다.
참고 : 일반적으로 8-10 완전한 분리에 필요한 제한된 팁을 통과한다. - RT에서 5 분 400 XG에서 세포를 원심 분리기와 매체를 제거합니다.
- 다시 일시 중지 천천히 피펫 팅에 의해 완전 배지 1 ㎖의의 펠렛을 위 아래로 4 배합니다.
4. 도금 복부 중간 뇌 세포
- 90 ㎕의 트리 판 블루 용액으로 세포 현탁액 10 μL와 혼합하여 혈구 세포의 수를 계산.
참고 : 세포의 생존도이 단계에서 확인할 수 있습니다. - 캡의 상단에 한 번에 집게, 하나를 사용하여, 100mm 페트리 접시에 멸균 microcentrifuge 관 뚜껑을 놓고 폴리-L-오르니 틴 / 라미닌 코팅 된 커버를 전송할 수 있습니다.
참고 : 된 커버를 세척하지 말고이 uneve의 원인이되므로, 라미닌 건조 방지n 개의 문화와 세포의 생존 감소. - (볼륨 유출없이 커버 슬립의 표면을 덮도록 최적) 완전 배지를 첨가하여 1 μL 당 1500 세포로 볼륨을 조절하고, 각 커버 슬립 위에 세포 현탁액 100 ㎕ (150,000 세포의 합계)를 추가한다. 가습 조직 문화 인큐베이터에서 배양 접시를 닫고 1 시간 동안 그들을 품어 (37 ° C, 5 % CO 2).
주 : CRITICAL 단계 :이 단계는 세포의 부착과 생존을 증강 용 커버 슬립 당 배아의 개수를 증가시키기 위해 필요하다. 대안 적으로, 세포를 직접 웰 (함유 된 커버)하지만 세포의 수 (대신 150,000) 웰 당 350,000 증가되어야로 전달 될 수있다. 직접 전송 때문에 (옆 또는 커버 슬립 아래) 판에 부착 세포의 약 3-4 된 커버를 산출하는 동안 즉,이 방법을 사용하여, 8-10, 커버 슬립, 취득 할 수있다. 평균 viabili이 방법을 사용하여 배양 TY는 약 90 %였다.
5. 문화 성장 및 유지 관리
- 배양 1 시간 후에, 조심스럽게 400 ㎕의 예열 (37 ºC까지) 완전 배지 함유하는 24 웰 플레이트에 배지를 포함하여 전송 된 커버 (총 부피 : 500 μl를). 37 ºC에서 세포 O / N을 품어.
- 우물의 배양 후 24 시간 이내에, 부드럽게 각 웰에 500 ㎕의 완전 배지를 추가합니다.
주 : 처음 몇 시간은 도파민 뉴런의 생존과이 지점을 넘어 크게 변하지 않는다 생존 세포의 수에 대한 가장 중요한 단계이다. - 처음 2 주 동안이나 매체가 노란색이 될 때까지 문화에 추가 용지를 추가하지 마십시오. 2 주 이상 또는 신선한 완전한 예열 미디어 (일반적으로 매 2 주) 노란색, 미디어의 교환 절반 (500 μL) 중간 색상 변경을 배양합니다.
참고 : 내 도파민 뉴런문화는 이러한 조건에서 6 개 이상의 주 동안 살아남을 것입니다.
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Representative Results
티로신 수산화 효소 (목)에 대한 면역 조직 문화에 세포의 0.5 % 사이가 도파민 것을 보여준다. 티로신 하이드 록 (TH)와 미세 소관 관련 단백질 2 (Map2에) 항체 (그림 3)를 사용하여, 신경 돌기 도금 후 2 시간 이내에 나타나며 첫 날에 의해, 축삭과 수상 돌기는 구별 (그림 2)입니다. 뉴런은 6 주 이상 생존과 광범위한 가지를 보여줍니다. 이전에 나타낸 바와 같이 문화 뉴런 신경교 비 직접 혈청 배지에서의 농도와 관련된다. 비교적 순수한 연결을 문화를 얻을 수있는 문화에서 FBS를 제거하는 동안, 우리와 다른 혈청 또한 문화 9 도파민 신경 세포의 생존을 증가 시킨다는 것을 발견했다.
의 분리를 위해 1. 절차 그림복부 중뇌의 해부에 대한 빨간색 사각형 (A) 및 도구 내에서 배아 복부 중뇌. E12.5 마우스 뇌의 개략도, 중뇌 경계 (점선) 및 관심 영역의 대략적인 위치, 복부 중뇌, , bioscissor, foreceps 및 블레이드 홀더 (B)가 표시됩니다. 배아는 (C)를 파열에 의해 양막으로부터옵니다. 관심 복부 중뇌 영역은 구형 (D)으로 나타낸다. 중뇌는 (절단 된 부분의 왼쪽) 지협과 (; E 오른쪽) 중뇌 - 전뇌 경계에서 절단하여 격리됩니다. 중뇌 mediodorsal 부분 나비 모양 (G, H)을 닮은, (F) 절단하고 평탄화한다. 그런 다음, 수막은 뇌 (H) 및 복부 중뇌 (사각형) 면도날을 사용하여 날개의 절반을 절단하여 등쪽 부분에서 격리에서 해리
그림 복부 중뇌 문화 2. 대표 시야 이미지. 이미지가 DIV1 (왼쪽)에 찍은, DIV2 (가운데) 및 DIV15 (오른쪽). 스케일 바 :. 50 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 장기 생존, 2 주 오에 프로세스의 파생물 및 synaptogenesis에LD 복부 중뇌 문화. 중간 뇌 도파민 신경 세포, 티로신 수산화 항체에 의해 식별 2 주 E12.5 배아에서 분리 한 후 복부 중뇌 문화에서, Map2에 항체에 의해 식별 광범위한 축삭과 수상 돌기를 성장. 수상 돌기는 Th이 양성 섬유는 축삭을 나타내는 목 및 Map2에 양성 과정의 중첩에 의해 구별 될 수있다. 200 : 1 항체의 희석 비로 사용 하였다. 스케일 바 :. 20 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
중뇌 도파민 성 신경 세포는 중추 신경계에서 도파민의 주요 원인이다. 그들은 세 그룹으로 나누어, 흑질의 유리체 compacta (SNpc), 복부 피개 영역 (VTA)과 retrorubral 필드 (RRF) 10, 11. SNpc과 VTA의 뉴런은 감정, 동기 부여 및 모터 동작의 제어 등의 기능에 관여, mesocortical 변연계 및 nigro - 선조체 주요 도파민 경로, 상승을 제공합니다. SNpc 흑질 선조 및 시스템의 기능적 파괴에서 뉴런의 죽음은 제 가장 두드러진 신경 변성 질환, 파킨슨 병 (PD) (12, 13)의 주요 병리학 적 특성이다. 현재 치료 방법은 질병의 증상을 해결하고 중지 또는 퇴화 속도를 느리게하고 천천히, 점진적 세포 손실의 원인은 여전히 14 ~ 16 알 수 없습니다. 따라서, 생체 내에서와 developme에의 연구를위한 체외 기법의 개발ntal, 생화학,이 신경 인구의 생리 학적 특성은 PD의 새로운 치료 방법의 개발에 대한 원인을 이해하는 데 필수적입니다.
여기에서 우리는 이러한 분화, 축삭과 프로세스의 연구를 허용, 해부, 해리와이 지역에서 도파민 신경 세포의 체외 생존에 장기 결과 배아 마우스 및 쥐의 복부 중뇌에서 차 신경 세포의 배양에 최적화 된 방법을 서술 가지와 버렸네 형성. 이 프로토콜의 몇 가지 장점 뉴런 (4)의 현상을 극대화 배아 당 증가 된 커버의 수, 독립 성장 인자로부터의 시험 관내 생존의 길이를 포함한다. 이 방법은,이 신경 세포의 진행성 퇴행뿐만 아니라 중뇌 도파민 성 신경 세포의 정상적인 생리 학적 기능의 기초가되는 메커니즘을 이해하는데에 허용 생체 연구를 보완 할 수있다파킨슨 병의 세포 독성 및 유전 적 모델에서 알 인구.
이 프로토콜의 주요 단점 중 하나는 SNpc 및 VTA 도파민 뉴런 간의 구별의 부족이다. 이 문제는 배양 (E12.5 마우스 또는 E14.5 쥐) 뉴런의 말단 분화시에 존재하고 자신의 지역화이 불완전 이상 배아의 사용이 가능하지만, 대폭의 생존율을 감소 axotomy에 의한 신경 세포. 두 집단을 구별하는 등 Girk2 각 인구에 대한 특정 마커에 대한 항체를 사용하여 면역 세포에 의해 가능한 것 (SNpc 신경 세포를 식별) 및 Calbindin 17 (VTA 신경 세포를 식별하기 위해).
4 절에 설명 된 최적화 도금 50 % 이상 실험 당 배아의 양을 감소시키고, 따라서 연구에서 동물의 사용을 감소 시키는데 기여한다. 숭배의 생존을위한 가장 중요한 단계뿐만 아니라, 수막의 완전한 제거 (단계 2.6,도 1H) -을 실시해는 댐과 euthanization midbrains 배아 (2.8 단계 2.1)을 완전히 박리 사이의 시간이다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12 | Invitrogen | 11330 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 24020-117 | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS) | Invitrogen | 16140 | |
| N2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water | Sigma | G8769 | |
| Bovine serum albumin BSA | Sigma | A9430 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Trypsin (0.05% (wt/vol) | Invitrogen | 25300 | |
| Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested | Sigma | A9418 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody | Pel-Freez Biologicals | P60101-0 | |
| Poly-L-ornithine, 0.01% solution | Sigma | P4957 | |
| Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody | Millipore | MAB3418 | |
| Anti-Synapsin-1 antibody | Millipore | AB1543P | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21206 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11016 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A-21203 | |
| Trypan blue solution (0.4% (wt/vol)) | Biowhittaker | 17-942E | |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Inverted phase contrast microscope | Carl Zeiss | Axiovert 40 C | |
| Dumont Forceps | Fine Scientific Tools | May-45 | |
| Cover Slip Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11251-33 | |
| Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11245-30 | |
| Blade Holder/Breaker Flat Grip - 11cm | Fine Scientific Tools | 10052-11 | |
| Student Iris Scissors - Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | |
| Fiber optic halogen illuminator | Nikon | MKII | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20C | |
| Hemocytometer | Proscitech | SVZ2NIOU | |
| 0.2 µm sterile filter units | Nalgene | NL-CE-156-4020 | |
| 100x20 mm Petri dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12 mm | Bellco Glass | 1943-10012 |
References
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