Introduction
La pérdida de neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra pars compacta conduce a los síntomas motores cardinal de la enfermedad de Parkinson (PD), el segundo trastorno neurodegenerativo más frecuente. La causa subyacente de la desaparición de esta población neuronal mesencephalic no se conoce. Para el estudio de las vías bioquímicas responsables del desarrollo y la modulación de las propiedades neurofisiológicas y la supervivencia de las neuronas Mesda, varios de cultivo de células y sistemas de modelos animales se han utilizado. Las líneas celulares inmortalizadas, incluyendo la línea celular de rata dopaminérgica 1RB 3 AN 27 (N27), el dopaminérgica línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y, la línea celular híbrida de ratón dopaminérgica MN9D y mesencefálico humana LUHMES células se han utilizado para estudios mecanísticos bioquímicos y limitadas 1 -5. Para el estudio de la pérdida específica de neuronas Mesda, varios neurotoxina y basados en modelos genéticos se han desarrollado 6-8. Culturas mesencéfalo ventral primaria, Proporcionar una herramienta indispensable para el estudio de las propiedades neuronales y sinápticas de las neuronas dopaminérgicas y las vías implicadas en la patogénesis de esta enfermedad común.
Aquí presentamos un protocolo detallado para el aislamiento de las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas, que contiene modificaciones resultantes en una mayor capacidad de supervivencia y el aumento de rendimiento de cubreobjetos por embrión. El uso del mesencéfalo E12.5 ratón prematuro (E14.5 en rata) mejora la supervivencia. A esta edad las neuronas no se han desarrollado todavía los axones, lo que deja las células intactas durante la disección y minimiza el estrés aumentando así significativamente la viabilidad. Además, la disección cuidadosa del mesencéfalo ventral, como se describe en la sección 2 de este protocolo, mejora aún más la capacidad de supervivencia. Para aumentar el número de cubreobjetos por embrión, una técnica de siembra alternativa se presenta en la sección 4 de este protocolo. Esto conduce a un rendimiento de hasta 10 cubreobjetos por embrión en comparación con 4 cubreobjetos bajocondiciones de chapado estándar reduciendo así la cantidad de animales por experimento.
Las neuronas en la cultura de exposiciones consecuencia de los axones y dendritas, forman conexiones sinápticas y revelan la presencia de marcadores neuronales y sinápticas que hacen estas culturas adecuado para imágenes de células vivas, inmunocitoquímica y estudios electrofisiológicos. Además, el uso de cultivos neuronales facilita la manipulación genética y farmacológica. Excrecencia de neuritas a partir del día 2 in vitro permite estudios de desarrollo. Por otra parte, la supervivencia a largo plazo de las culturas (hasta seis semanas) hace que sean adecuadas para el estudio de la degeneración progresiva y lenta de estas neuronas.
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Protocol
NOTA: Los animales fueron mantenidos y manejados de acuerdo con las directrices institucionales y de todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Bienestar Animal del Colegio Imperial y Órgano de Examen de Ética (AWERB) y el Ministerio del Interior y la Universidad de Harvard Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC), de conformidad con los reglamentos federales y estatales.
1. Reactivo y Configuración del equipo
- Thaw, alícuota y almacenar 1 mg / ml solución laminina a -80 ºC. Disolver 2 l en 1 ml de DMEM / F12, resultando en una concentración de recubrimiento de 1-2 g / cm 2.
NOTA: Descongelar Laminin lentamente en hielo y se disuelve en frío DMEM / F12 y de inmediato añadir a los platos / cubreobjetos. - Diluir 75 ml de 0,01% de poli-L-ornitina en 425 ml de PBS y se almacena a 4 ºC.
NOTA: La vida útil de la solución de trabajo es de hasta un mes. - Disolver 25% (p / v) de BSA en PBS, pH 7,4, y se almacena a 4 ° C durante un máximo de un year.
- Preparar 50% de FBS (en HBSS) medios de desactivación.
- Preparar medio completo mediante la adición de 50 U / ml de penicilina y estreptomicina, 1x suplemento N2, 5% (vol / vol) de FBS, 0,36% D - (+) - glucosa (peso / vol), 0,25% de BSA (peso / vol) a DMEM / F12 y almacenar a 4 ºC.
NOTA: La vida útil es de hasta 10 días. - Coloque los cubreobjetos en ebullición 70% (vol / vol) de etanol durante al menos 30 min para eliminar los restos de grasa y autoclave.
- Coloque los cubreobjetos en placas de 24 pocillos y añadir 500 l solución de poli-L-ornitina a cada pocillo. Incubar 1 hr bajo la campana de cultivo de tejido a TA y después, lavar 3 veces con 500 l de agua. Añadir solución de laminina 500 l a cada placa y se incuba O / N en la incubadora de cultivo de tejidos humidificado a 37 ºC.
NOTA: Si bien no hay lavados son necesarias después del tratamiento laminina, lavar los poli-L-ornitina menos de tres veces resulta en la muerte de las células 24 h después del cultivo. - Pulir las puntas de pipetas de vidrio más de gas natural o antorcha fcojo.
NOTA: Después de este paso, el diámetro de la punta debe ser aproximadamente la mitad de su tamaño normal. - Cortar las tapas de 1,5 ml tubos de microcentrífuga, utilizando una tijera autoclave y autoclave.
2. Disección de Embryonic ventral mesencéfalo
- Narcotizar oportuna embarazadas (E12.5) presas por inhalación de CO2 y luego practicar la eutanasia por dislocación cervical.
- Pulverizar el abdomen con etanol al 70% y hacer una incisión abdominal hasta los sacos uterinos están expuestos. Utilizando unas pinzas cortan la fijación vaginal y eliminar útero. Coloque el útero en HBSS enfriado en hielo, en un 100 mm placa de Petri.
- Retire embriones del útero y el saco amniótico, utilizando pinzas (Figura 1C). Coloque los embriones en fresco HBSS helada.
NOTA: El rectángulo en la Figura 1D indica la ubicación del mesencéfalo ventral embrionario. - Coloca los embriones bajo un microscopio de disección (10 aumentos) y diseccionar el mesencéfaloarco cortando el cerebro en el istmo y la región frontera mesencefálico-diencefálica, utilizando el bioscissor y pinzas (Figura 1E, por favor refiérase a la Figura 1A para las líneas de incisión).
- Después de sacar todo el cerebro medio, hacer un corte en el mesencéfalo mediodorsal (Figura 1F).
- Eliminar meninges, utilizando dos pinzas (Figura 1H).
NOTA: PASO CRÍTICO: Este paso es esencial para el rendimiento óptimo neuronal y la supervivencia. Dado que las condiciones de cultivo son óptimos para las células del cerebro, la mayoría de las células del tejido circundante mueren después de la siembra y la señal apoptótica partir de este tejido puede dañar la integridad de las culturas. - Acoplar el tejido del cerebro medio en la placa de Petri para observar la forma de mariposa y corte aproximadamente la mitad de cada ala, utilizando una cuchilla de afeitar esterilizada (Figura 1 H, I).
NOTA: Figura 1J representa el mesencéfalo ventral aislado. - Transferir elpieza de mesencéfalo ventral en HBSS enfriado con hielo en un tubo cónico de 15 ml y proceder con el siguiente embrión.
NOTA: Los pasos 2.1 a 2.8 no deben tomar más de 1 hora. Mantener los embriones más allá de este marco de tiempo en hielo disminuye significativamente la viabilidad celular.
3. La disociación de las células ventral mesencéfalo
- La transferencia de los trozos de cerebro medio ventral bajo una campana de flujo laminar. Retire la HBSS y añadir 1 ml precalentado (37 ºC) 0,05% de tripsina-EDTA en el tubo cónico (volúmenes suficientes para un máximo de 12 piezas de mesencéfalo ventral). Incubar el tejido a 37 ºC durante 5-10 minutos.
- Eliminar tripsina-EDTA bajo el capó y se añade medio de la activación de-1 ml (el suero se desactivará tripsina) para el tejido.
- Retire el medio de desactivación y lavar el tejido en 1 ml de medio completo dos veces.
NOTA: evitar la eliminación de todo el medio del tubo y pipetear el tejido, para evitar desechar las células disociadas. - Añadir 1 ml de medio completo y triturato el tejido con una pipeta de vidrio pulida al fuego. Evitar la formación de burbujas y seguir triturando hasta que se logre la suspensión de células individuales.
NOTA: Por lo general, 8-10 pasa por la punta restringido son necesarios para la disociación completa. - Centrifugar las células a 400 xg durante 5 min a temperatura ambiente y eliminar el medio.
- Vuelva a suspender el sedimento en 1 ml de medio completo por lentamente la pipeta hacia arriba y hacia abajo para un máximo de cuatro veces.
4. Las células Chapado ventral mesencéfalo
- Mezclar 10 l de la suspensión celular con 90 l solución de azul de tripano y contar el número de células con un hemocitómetro.
NOTA: La viabilidad de las células también se puede comprobar en esta etapa. - Coloque tapas de los tubos de microcentrífuga esterilizado en 100 mm placas de Petri y transferir los / laminina cubreobjetos recubiertos de poli-L-ornitina, utilizando fórceps, uno a la vez en la parte superior de las tapas.
NOTA: No lave los cubreobjetos y evitar el secado de la laminina, ya que esto puede causar UNEVEculturas n y disminución de la supervivencia de las células. - Ajustar el volumen a 1500 células por 1 l mediante la adición de medio completo y añadir 100 l (un total de 150.000 células) de la suspensión celular en la parte superior de cada cubreobjetos (el volumen es óptimo para cubrir la superficie del cubreobjetos sin derrames). Cierre las placas de Petri y se incuba durante 1 hr ellos en una incubadora de cultivo de tejidos humidificado (37 ° C, 5% de CO 2).
NOTA: PASO CRITICAL: Este paso es necesario para mejorar la unión y viabilidad de las células y para aumentar el número de cubreobjetos por embrión. Alternativamente, las células se pueden transferir directamente a los pozos (que contienen cubreobjetos), pero el número de células se debe aumentar a 350 mil por pozo (en lugar de 150.000). En otras palabras, utilizando este método, 8-10 cubreobjetos se pueden adquirir, mientras que la transferencia directa produce unos 3-4 cubreobjetos a causa de las células, que se unen a las placas (al lado o debajo de los cubreobjetos). El viabili promedioTy de los cultivos, utilizando este método fue de alrededor de 90%.
5. Crecimiento y Mantenimiento Cultura
- Después de 1 hora de incubación, transferir cuidadosamente el cubreobjetos incluyendo el medio en placas de 24 pocillos, que contiene 400 l de medio completo precalentado (a 37 ºC) (volumen total: 500 l). Se incuban las células O / N a 37 ºC.
- Dentro de 24 horas después de la incubación de los pocillos, añadir suavemente medio completo 500 l en cada pocillo.
NOTA: Las primeras horas es la etapa más crítica para la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas y el número de células supervivientes no cambia significativamente más allá de este punto. - No agregue soportes adicionales a las culturas de las dos primeras semanas o hasta que el medio se convierte en amarilla. Si el cultivo durante más de dos semanas o cambios de color medio a amarillo, cambio de la mitad de los medios de comunicación (500 l) con frescos completas medios pre-calentado (normalmente cada dos semanas).
NOTA: Las neuronas dopaminérgicas dentro de laculturas sobrevivirían durante más de 6 semanas bajo estas condiciones.
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Representative Results
La inmunohistoquímica contra la tirosina hidroxilasa (TH) muestra que entre 0,5-1% de las células en cultivo son dopaminérgica. Proyecciones neuronales aparecen dentro de 2 horas después de la siembra y antes del primer día, los axones y dendritas son distinguibles (Figura 2), utilizando proteína 2 (Map2) anticuerpos asociada a los microtúbulos (Figura 3) tirosina hidroxilasa (TH) y. Las neuronas a sobrevivir durante más de seis semanas y muestran una amplia extensión. La relación neurona-glía en los cultivos está directamente relacionada con la concentración de suero en el medio, como se indica anteriormente. Si bien la eliminación de FBS de las culturas puede producir cultivos neuronales relativamente puros, nosotros y otros han encontrado que la adición de suero aumenta la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas en la cultura 9.
Figura 1. Procedimiento para el aislamiento demesencéfalo ventral embrionario. La vista esquemática de cerebro de ratón E12.5, los límites del cerebro medio (líneas discontinuas), y la posición aproximada de la región de interés, el mesencéfalo ventral, dentro del rectángulo rojo (A) y las herramientas para la disección del mesencéfalo ventral , un bioscissor, foreceps, y un soporte de la cuchilla (B) se muestran. Los embriones se sacaron del saco amniótico por la ruptura que (C). La región de interés, el mesencéfalo ventral, se muestra por el rectángulo (D). Mesencéfalo está aislada por el corte en el istmo (a la izquierda de la pieza cortada) y el límite-cerebro medio cerebro anterior (a la derecha; E). La parte mediodorsal del mesencéfalo se corta (F) y se aplana, para parecerse a una forma de mariposa (G, H). Entonces, meninges se disocian a partir de cerebro (H) y el mesencéfalo ventral (rectángulo) está aislado de la parte dorsal cortando medio de las alas, usando una cuchilla de afeitar
Figura 2. Imágenes de campo claro representativos de las culturas del mesencéfalo ventral. Las imágenes fueron tomadas en DIV1 (izquierda), DIV2 (centro), y DIV15 (derecha). Barra de escala:. 50 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. La supervivencia a largo plazo, consecuencia de los procesos y la sinaptogénesis en dos semanas old ventral del cerebro medio culturas. neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo, identificados por el anticuerpo tirosina hidroxilasa crecen extensos axones y dendritas, identificados por el anticuerpo Map2, en las culturas del mesencéfalo ventral dos semanas después de la disociación de embriones E12.5. Las dendritas se pueden distinguir por superposición de Th y los procesos Map2-positivos, donde sólo Th-positivo fibras representan axones. Los anticuerpos se utilizaron a una dilución de 1: 200. Barra de escala:. 20 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las neuronas dopaminérgicas en el mesencéfalo son la principal fuente de dopamina en el sistema nervioso central. Se dividen en tres grupos, sustancia negra pars compacta (SNpc), el área ventral tegmental (VTA) y el campo retrorubral (FRR) 10, 11. Las neuronas SNpc VTA y dan lugar a importantes vías dopaminérgicas, mesocorticales, mesolímbico y nigro-estriado, que participan en funciones como el control de las emociones, la motivación y el comportamiento motor. Desaparición de las neuronas en SNpc y alteración funcional del sistema nigroestriatal es la principal característica patológica de la segunda más importante trastorno neurodegenerativo, enfermedad de Parkinson (EP) 12,13. Enfoques terapéuticos actuales abordan los síntomas de la enfermedad y no detienen o ralentizan la degeneración y las causas de la lenta y progresiva pérdida de células aún no se conocen 14-16. Por lo tanto, el desarrollo de in vivo e in técnicas in vitro para el estudio de la developmental, bioquímicos, y características fisiológicas de esta población neuronal es imprescindible para la comprensión de la etiología de la EP y al desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos.
Aquí se describe un método optimizado para la disección, disociación y el cultivo de las neuronas primarias de embriones de ratón y de rata mesencéfalo ventral, lo que resulta en a largo plazo en la supervivencia in vitro de las neuronas dopaminérgicas de esta región, lo que permite el estudio de los procesos tales como la diferenciación, axonal derivación y la formación de sinapsis. Varias ventajas de este protocolo incluyen el aumento del número de cubreobjetos por embrión, la independencia de los factores de crecimiento y la duración de la supervivencia in vitro, maximizar el desarrollo de las neuronas 4. Este método puede complementar los estudios in vivo en permitir que para la comprensión de los mecanismos subyacentes a las funciones fisiológicas normales de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo, así como la degeneración progresiva de esta neuronaAl población en modelos citotóxicos y genéticas de la enfermedad de Parkinson.
Una de las principales desventajas de este protocolo es la falta de distinción entre SNpc VTA y las neuronas dopaminérgicas. Este problema existe porque en el momento del cultivo (E12.5 E14.5 en ratones o en ratas) la diferenciación terminal de las neuronas y su regionalización no es completa y mientras que es posible el uso de embriones mayores, se reduce significativamente la supervivencia de la las neuronas debido a la axotomía. Distinguir las dos poblaciones sería posible por inmunocitoquímica, utilizando anticuerpos contra marcadores específicos para cada población tales como GIRK2 (para identificar neuronas SNpc) y Calbindin (para identificar las neuronas VTA) 17.
El chapado optimizado descrito en la sección 4 disminuye la cantidad de embriones por experimento en más de un 50% y por lo tanto contribuye a la reducción del uso de animales en investigación. Los pasos más críticos para la supervivencia del cultoUres son el tiempo entre la eutanasia de las presas y la disección completa de los midbrains embrionarias (paso 2.1 a 2.8), así como la eliminación completa de las meninges (etapa 2.6, la Figura 1H).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12 | Invitrogen | 11330 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 24020-117 | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS) | Invitrogen | 16140 | |
| N2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water | Sigma | G8769 | |
| Bovine serum albumin BSA | Sigma | A9430 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Trypsin (0.05% (wt/vol) | Invitrogen | 25300 | |
| Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested | Sigma | A9418 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody | Pel-Freez Biologicals | P60101-0 | |
| Poly-L-ornithine, 0.01% solution | Sigma | P4957 | |
| Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody | Millipore | MAB3418 | |
| Anti-Synapsin-1 antibody | Millipore | AB1543P | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21206 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11016 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A-21203 | |
| Trypan blue solution (0.4% (wt/vol)) | Biowhittaker | 17-942E | |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Inverted phase contrast microscope | Carl Zeiss | Axiovert 40 C | |
| Dumont Forceps | Fine Scientific Tools | May-45 | |
| Cover Slip Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11251-33 | |
| Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11245-30 | |
| Blade Holder/Breaker Flat Grip - 11cm | Fine Scientific Tools | 10052-11 | |
| Student Iris Scissors - Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | |
| Fiber optic halogen illuminator | Nikon | MKII | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20C | |
| Hemocytometer | Proscitech | SVZ2NIOU | |
| 0.2 µm sterile filter units | Nalgene | NL-CE-156-4020 | |
| 100x20 mm Petri dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12 mm | Bellco Glass | 1943-10012 |
References
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