Introduction
Förlust av dopaminerga neuroner från substantia nigra pars compacta leder till kardinal motoriska symtomen vid Parkinsons sjukdom (PD), den näst vanligaste neurodegenerativa sjukdomen. Den underliggande orsaken till nedläggningen av denna mesencefal neuronala befolkningen är inte känt. För att studera de biokemiska vägar som ansvarar för utvecklingen och modulera neurofysiologiska egenskaper och överlevnad mesDA neuroner, flera cellodling och djurmodellsystem har använts. Odödliggjorda cellinjer, inklusive råtta dopaminerga cellinjen 1RB 3 AN 27 (N27), den humana dopaminerga neuroblastom-cellinjen SH-SY5Y, mus dopaminerga hybridcellinje MN9D och humant mesencefal LUHMES celler har använts för biokemiska och begränsade mekanistiska studier 1 -5. För studien av den specifika förlusten av mesDA neuroner, flera neurotoxin baserade och genetiska modeller har utvecklats 6-8. Primära ventrala mitthjärnan kulturer, Ger ett oumbärligt verktyg för att studera de neuronala och synaptiska egenskaper hos dopaminerga nervceller och de vägar som är involverade i patogenesen av denna gemensamma sjukdom.
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för isolering av mesencefala dopaminerga neuroner, som innehåller ändringar som följer i högre över och ökat utbyte av täck per embryo. Användning av pre-mogna E12.5 mus mesencephalon (E14.5 i råtta) förbättrar överlevnadsförmåga. Vid denna ålder nervceller har inte utvecklat axoner ännu, som lämnar cellerna intakta under dissekering och minimerar stressen vilket avsevärt ökar lönsamheten. Dessutom noggrann dissektion av den ventrala mitthjärnan, som beskrivs i avsnitt 2 i detta protokoll, förbättrar ytterligare överlevnadsförmåga. För att öka antalet täck per embryo, är ett alternativt plätering metod som presenteras i avsnitt 4 i detta protokoll. Detta leder till en direktavkastning på upp till 10 täck per embryo jämfört med fyra täck enligtstandard Pläteringsförhållandena sålunda minska mängden djur per försök.
Nervceller i kultur uppvisar utväxt av axoner och dentrites, bildar synapsförbindelser och avslöja förekomsten av neuronala och synaptiska markörer gör dessa kulturer lämplig för levande cell imaging, immuncytokemiska och elektrofysiologiska studier. Vidare användning av neuronala kulturer underlättar genetisk och farmakologisk manipulation. Utväxt av neuriter från dag 2 in vitro möjliggör utvecklingsstudier. Vidare, den långsiktiga överlevnaden av kulturer (upp till sex veckor) gör dem lämpliga för studier av den långsamma, progressiv degeneration av dessa neuroner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Djuren underhålls och hanteras i enlighet med de institutionella riktlinjer och alla djurförsök godkändes av Imperial College Animal Welfare och etiska granskningsorganet (AWERB) och Home Office och Harvard University Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC), i enlighet med federala och statliga regleringar.
1. Reagens och utrustning Setup
- Tina, alikvot och förvara 1 mg / ml laminin lösning vid -80 ºC. Lös 2 ul i 1 ml DMEM / F12, vilket resulterar i en beläggningskoncentration av 1-2 ng / cm 2.
OBS: Tina laminin långsamt på is och lös i kallt DMEM / F12 och omedelbart lägga till de plattor / täck. - Späd 75 ml av 0,01% Poly-L-ornitin i 425 ml PBS och förvara vid 4 ºC.
OBS: Den hållbarhetstid av arbetslösningen är upp till en månad. - Lös 25% (vikt / volym) BSA i PBS, pH 7,4, och förvara vid 4 ° C i upp till en niar.
- Bered 50% FBS (i HBSS) deaktivering media.
- Förbered komplett medium genom att tillsätta 50 U / ml penicillin och streptomycin, 1x N2 komplettera, 5% (volym / volym) FBS, 0,36% D - (+) - Glukos (vikt / vol), 0,25% BSA (vikt / vol) till DMEM / F12 och förvara vid 4 ºC.
OBS: Hållbarhetstiden är upp till 10 dagar. - Placera täckglas i kokande 70% (vol / vol) etanol i minst 30 minuter för att avlägsna alla spår av fett och autoklav.
- Placera täckglas i 24-hålsplattor och lägga 500 l Poly-L-ornitin lösning till varje brunn. Inkubera 1 h under vävnadsodling huven vid RT och sedan, tvätta tre gånger med 500 | il vatten. Tillsätt 500 l laminin lösning på varje platta och inkubera O / N i fuktad vävnadsodling inkubator vid 37 ºC.
OBS: Även om inga tvättar är nödvändig efter laminin behandling, tvätta poly-L-ornitin mindre än tre gånger leder till döden av cellerna 24 h efter odling. - Polera tips av glaspipetter över naturgas eller ficklampa flamt.
OBS: Efter detta steg diameter spetsen bör vara ungefär hälften av dess normala storlek. - Skär locken av 1,5 ml mikrorör, med hjälp av en autoklaveras sax och autoklav.
2. Dissekering av embryonala på magen mitthjärnan
- NARKOTISERA timed-gravida (E12.5) dammar av CO2 inandning och sedan avliva genom cervikal dislokation.
- Spraya buken med 70% etanol och göra ett buksnitt tills livmoderns säckarna är alla utsatta. Använd pincett klippa vaginal fastsättning och ta bort livmodern. Placera livmodern i iskall HBSS, i en 100 mm petriskål.
- Ta embryon från livmodern och fostersäcken, med hjälp av pincett (Figur 1C). Placera embryon i färsk iskall HBSS.
OBS: Rektangeln i Figur 1D visar var embryonala ventrala mitthjärnan. - Placera embryon enligt en dissektion mikroskop (10x förstoring) och dissekera mesencefalbåge genom att skära hjärnan vid näset och mesencefal-diencephalic gränsregion, med hjälp av bioscissor och pincett (Figur 1E, se Figur 1A för rader av snitt).
- Efter att ha tagit ut hela mitthjärnan, gör ett snitt i mediodorsal mitthjärnan (Figur 1F).
- Ta bort hjärnhinnor, med hjälp av två pincett (Figur 1H).
OBS: kritiskt steg: Detta steg är viktigt för optimal neuronal avkastning och överlevnad. Eftersom odlingsbetingelserna är optimala för hjärnceller, de flesta av cellerna från den omgivande vävnaden dör efter plätering och den apoptotiska signalen från denna vävnad kan skada integriteten av kulturerna. - Platta mellanhjärnan vävnad på petriskålen att observera fjäril form och skär ungefär hälften av varje vinge, med hjälp av en steriliserad rakning blad (Figur 1H, I).
OBS: Bild 1J visar isolerade ventrala mitthjärnan. - Överförbit ventrala mitthjärnan i iskallt HBSS i en 15 ml koniska rör och fortsätt med nästa embryot.
OBS: Steg 2,1-2,8 bör inte ta mer än 1 timme. Att hålla embryon bortom denna tidsram på is minskar cellviabiliteten avsevärt.
3. Dissociation av magen mitthjärnan celler
- Överför bitar av ventrala mitthjärnan under ett laminärt flöde huva. Ta bort HBSS och tillsätt 1 ml förvärmda (37 ºC) 0,05% trypsin-EDTA i den koniska röret (volymer nog för upp till 12 stycken av ventrala mitthjärnan). Inkubera vävnaden vid 37 ° C under 5-10 min.
- Avlägsna trypsin-EDTA under huven och tillsätt 1 ml de-aktiveringsmedium (serumet kommer inaktivera trypsin) till vävnaden.
- Avlägsna avaktivering mediet och tvätta vävnaden i 1 ml komplett medel två gånger.
OBS: Undvik att ta bort all mediet från röret och pipettera vävnaden, för att förhindra att kasta bort de dissocierade celler. - Tillsätt 1 ml komplett medium och triturate vävnaden med en brand-polerat glas pipett. Undvik bildning av bubblor och fortsätta finfördelning tills encellssuspension uppnås.
OBS: Vanligtvis 8-10 passerar genom den begränsade spetsen krävs för fullständig dissociation. - Centrifugera cellerna vid 400 xg under 5 min vid RT och avlägsna mediet.
- Återsuspendera pelleten i 1 ml komplett medium genom att långsamt pipettera upp och ner för upp till fyra gånger.
4. Plätering magen mitthjärnan Celler
- Blanda 10 pl av cellsuspensionen med 90 | il lösning av trypanblått och räkna antalet celler med en hemocytometer.
OBS: kan också kontrolleras viabilitet av cellerna i det här skedet. - Placera steriliserade mikrocentrifugrör mössor i 100 mm petriskålar och överföra Poly-L-ornitin / laminin belagda täck, med hjälp av pincett, en i taget ovanpå locken.
OBS: Tvätta inte täck och undvika torkning av laminin, eftersom detta kan orsaka uneven kulturer och minskning i överlevnads av cellerna. - Justera volymen till 1500 celler per 1 | il genom tillsats av komplett medium och tillsätt 100 | il (totalt 150000 celler) av cellsuspensionen på toppen av varje täckglas (volymen är optimalt för att täcka ytan av täckglas utan spill). Stäng petriskålarna och inkubera dem under en timme i en fuktad vävnadskulturinkubator (37 ° C, 5% CO2).
OBS: kritiskt steg: Detta steg krävs för att öka fastsättning och livskraft cellerna och för att öka antalet täck per embryo. Alternativt kan cellerna överföras direkt i brunnarna (innehållande Täckglas) men antalet celler bör ökas till 350000 per brunn (i stället för 150000). Med andra ord, med den här metoden, kan 8-10 täck förvärvas, medan direkt överföring ger ca 3-4 täck grund av de celler, som fäster plattorna (bredvid eller under täck). Den genomsnittliga viability av kulturerna, med denna metod var ca 90%.
5. Kultur Tillväxt och underhåll
- Efter 1 h av inkubation noggrant överföra täckglasen inklusive mediet i 24-brunnars plattor, innehållande 400 | il förvärmda (till 37 ° C) fullständigt medium (total volym: 500 jil). Inkubera cellerna O / N vid 37 ºC.
- Inom 24 timmar efter inkubation av brunnarna, försiktigt lägga 500 l komplett medium i varje brunn.
OBS: De första timmarna är det mest kritiska skedet för överlevnad dopaminerga neuroner och antalet överlevande celler förändras inte signifikant bortom denna punkt. - Lägg inte till ytterligare media till kulturerna för de första två veckorna eller tills mediet blir gult. Om odling i mer än två veckor eller medelfärgförändringar till gul, utbyte hälften av media (500 l) med färska kompletta förvärmda media (typiskt varannan vecka).
OBS: Dopaminerga neuroner inomkulturer skulle överleva i mer än 6 veckor under dessa förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Immunohistokemi mot tyrosinhydroxylas (TH) visar att mellan 0,5-1% av cellerna i odling är dopaminerga. Neuronala prognoser verkar inom 2 timmar efter bordläggning och av den första dagen, axoner och dendriter kan särskiljas (Figur 2), med hjälp av tyrosinhydroxylas (TH) och mikrotubuli-associerat protein 2 (MAP2) antikroppar (Figur 3). De nervceller överlever mer än sex veckor och visar omfattande utväxt. Neuronen-Glia förhållandet i odlingarna är direkt relaterad till koncentrationen av serum i mediet, såsom visas tidigare. Samtidigt som man eliminerar FBS från kulturerna kan ge relativt rena neuronala kulturer, har vi och andra funnit att tillsats av serum ökar överlevnads av dopaminerga neuroner i kultur 9.
Figur 1. Förfarande för isolering avembryonala ventrala mitthjärnan. Den schematiska syn på E12.5 musen hjärnan, mitthjärnan gränser (streckade linjer), och det ungefärliga läget för regionen av intresse, ventrala mitthjärnan, inom den röda rektangeln (A) och verktygen för dissektion av den ventrala mitthjärnan , en bioscissor, foreceps och en bladhållare (B) visas. Embryona tas ut från fostersäcken genom brista den (C). Regionen av intresse, ventrala mitthjärnan, visas av rektangeln (D). Hjärnan isoleras genom att skära på näset (till vänster om snittet stycket) och mitthjärnan-hjärnan gränsen (höger; E). Den mediodorsal delen av mitthjärnan skärs (F) och den är tillplattad, för att likna en fjäril form (G, H). Därefter meninger skiljas från hjärnan (H) och ventrala mitthjärnan (rektangel) är isolerat från ryggstycket genom att skära av hälften av vingarna, med hjälp av en rakning blad
Figur 2. Representativa ljusfält bilder av ventrala mitthjärnan kulturer. Bilder togs på DIV1 (till vänster), DIV2 (mitten), och DIV15 (höger). Skala bar:. 50 pm klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Långsiktig överlevnad, utväxt av processer och synaptogenesis i två veckor old ventrala mitthjärnan kulturer. mitthjärnan dopaminerga neuroner, som identifierats av tyrosin hydroxylas antikropp växa omfattande axoner och dendriter, som identifierats av MAP2 antikropp, i de ventrala mitthjärnan kulturerna två veckor efter dissociation från E12.5 embryon. Dendriter kan särskiljas genom överlappning av Th och MAP2-positiva processer, där endast Th-positiva fibrer representerar axoner. Antikroppar användes med en utspädning på 1: 200. Skala bar:. 20 pm klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dopaminerga neuron i mitthjärnan är den viktigaste källan till dopamin i det centrala nervsystemet. De är uppdelade i tre grupper, substantia nigra pars compacta (SNPC), ventrala tegmentala arean (VTA) och retrorubral fält (RRF) 10, 11. De nervceller i SNPC och VTA ge upphov till stora dopaminerga vägar, mesocortical, mesolimbiska och nigro-striatala, deltar i funktioner såsom kontroll av känslor, motivation och motorik. Nedläggningen av nervceller i SNPC och funktionella störningar i det nigrostriatala systemet är det huvudsakliga patologiska kännetecken av den andra mest framstående neurodegenerativ störning, Parkinsons sjukdom (PD) 12,13. Aktuella terapeutiska metoder behandla symtom på sjukdomen och inte stoppa eller bromsa degeneration och orsakerna till den långsamma, progressiv cellförlust är fortfarande okänd 14-16. Därför utveckling av in vivo och in vitro tekniker för studium av developmental, biokemiska och fysiologiska egenskaperna hos denna neuronala befolkningen är absolut nödvändigt att förstå etiologin av PD och utveckling av nya behandlingsmetoder.
Här beskriver vi en optimerad metod för dissekering, dissociering och odling av primära neuroner från embryonal mus och råtta ventrala mitthjärnan, vilket resulterar i långsiktig in vitro överlevnaden av dopaminerga neuroner från denna region, vilket möjliggör studier av processer såsom differentiering, axonal utväxt och synaps bildning. Flera fördelar med detta protokoll omfattar det ökade antalet täck per embryo, oberoende av tillväxtfaktorer och längden på in vitro överlevnad, maximera utvecklingen av nervceller 4. Denna metod kan komplettera studierna in vivo i att låta för att förstå mekanismerna bakom normala fysiologiska funktioner mellanhjärnan dopaminerga nervceller samt progressiv degeneration av denna neuronal befolkningen i cytotoxiska och genetiska modeller av Parkinsons sjukdom.
En av de största nackdelarna med detta protokoll är bristen på distinktion mellan SNPC och VTA dopaminerga neuroner. Detta problem existerar på grund vid tidpunkten för odling (E12.5 hos möss eller E14.5 hos råttor) terminal differentiering av nervceller och deras regionalisering är inte komplett och medan användningen av äldre embryon är möjligt, det minskar avsevärt överlevnad neuroner på grund av axotomi. Särskilja de två populationerna skulle vara möjligt genom immuncytokemi, med hjälp av antikroppar mot specifika markörer för varje population som Girk2 (identifiera SNPC neuroner) och Calbindin (identifiera VTA neuroner) 17.
Den optimerade plätering beskrivs i avsnitt 4 minskar mängden embryon per försök med mer än 50%, och därmed bidrar till att minska användningen av djur i forskning. De mest kritiska stegen för överlevnadsförmågan för kultender är tiden mellan euthanization av dammarna och fullständig dissekering av de embryonala midbrains (steg 2,1-2,8), liksom den fullständiga avlägsnandet av mening (steg 2.6, Figur 1H).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12 | Invitrogen | 11330 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 24020-117 | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS) | Invitrogen | 16140 | |
| N2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water | Sigma | G8769 | |
| Bovine serum albumin BSA | Sigma | A9430 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Trypsin (0.05% (wt/vol) | Invitrogen | 25300 | |
| Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested | Sigma | A9418 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody | Pel-Freez Biologicals | P60101-0 | |
| Poly-L-ornithine, 0.01% solution | Sigma | P4957 | |
| Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody | Millipore | MAB3418 | |
| Anti-Synapsin-1 antibody | Millipore | AB1543P | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21206 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11016 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A-21203 | |
| Trypan blue solution (0.4% (wt/vol)) | Biowhittaker | 17-942E | |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Inverted phase contrast microscope | Carl Zeiss | Axiovert 40 C | |
| Dumont Forceps | Fine Scientific Tools | May-45 | |
| Cover Slip Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11251-33 | |
| Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11245-30 | |
| Blade Holder/Breaker Flat Grip - 11cm | Fine Scientific Tools | 10052-11 | |
| Student Iris Scissors - Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | |
| Fiber optic halogen illuminator | Nikon | MKII | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20C | |
| Hemocytometer | Proscitech | SVZ2NIOU | |
| 0.2 µm sterile filter units | Nalgene | NL-CE-156-4020 | |
| 100x20 mm Petri dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12 mm | Bellco Glass | 1943-10012 |
References
- Prasad, K. N., et al. Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).
- Fall, C. P., Bennett, J. P. Characterization and time course of MPP+ -induced apoptosis in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. J Neurosci Res. 55, 620-628 (1999).
- Choi, H. K., Won, L., Roback, J. D., Wainer, B. H., Heller, A. Specific modulation of dopamine expression in neuronal hybrid cells by primary cells from different brain regions. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 8943-8947 (1992).
- Alavian, K. N., Sgado, P., Alberi, L., Subramaniam, S., Simon, H. H. Elevated P75NTR expression causes death of engrailed-deficient midbrain dopaminergic neurons by Erk1/2 suppression. Neural Dev. 4, 11 (2009).
- Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain. 133, 2022-2031 (2010).
- Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Animal models of Parkinson's disease. Bioessays. 24, 308-318 (2002).
- Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson's disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Res. 318, 215-224 (2004).
- Chesselet, M. F., Richter, F. Modelling of Parkinson's disease in mice. Lancet neurology. 10, 1108-1118 (2011).
- Takeshima, T., Johnston, J. M., Commissiong, J. W. Mesencephalic type 1 astrocytes rescue dopaminergic neurons from death induced by serum deprivation. J Neurosci. 14, 4769-4779 (1994).
- Sgado, P., et al. Slow progressive degeneration of nigral dopaminergic neurons in postnatal Engrailed mutant mice. PNAS. 103, 15242-15247 (2006).
- Alavian, K. N., et al. The lifelong maintenance of mesencephalic dopaminergic neurons by Nurr1 and engrailed. J Biomed Sci. 21, 27 (2014).
- Simon, H. H., Bhatt, L., Gherbassi, D., Sgado, P., Alberi, L. Midbrain dopaminergic neurons: determination of their developmental fate by transcription factors. Ann N Y Acad Sci. 991, 36-47 (2003).
- Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
- Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radic Biol Med. 62, 132-144 (2013).
- Schapira, A. H. Aetiopathogenesis of Parkinson's disease. J Neurology. 258, S307-S310 (2011).
- Chung, C. Y., et al. Cell type-specific gene expression of midbrain dopaminergic neurons reveals molecules involved in their vulnerability and protection. Hum Mol Gen. 14, 1709-1725 (2005).
