Summary

Condizionale genetica Transsynaptic Tracing nel cervello embrionali di topo

Published: December 22, 2014
doi:

Summary

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

Abstract

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Introduction

Anatomico percorso tracciato è uno degli strumenti più comunemente utilizzati per decifrare il rapporto tra cervello e comportamento 1. Avanzamento in tecnologie dei circuiti neurali tracciatura ha concesso neuroscienziati con la possibilità di ricostruire i circuiti neurali da popolazioni di neuroni geneticamente identificati nei topi 2. Nonostante questi progressi tecnici rimane difficile da svelare la formazione dei circuiti neurali soprattutto durante la maturazione embrionale. Questo perché la maggior parte dei metodi di tracciamento sviluppati fino ad oggi sono basate su iniezione stereotassica di rivelatori transsynaptic o virus neurotropici geneticamente modificati (Figura 1) 2,3. Mentre queste tecniche raggiungono risoluzione spaziale e temporale della connettività, alcuni limiti intrinseci, come tecnicamente impegnativi iniezioni traccianti nel cervello in via di sviluppo, la riproducibilità del sito di iniezione, potenziale infiammazione al sito di iniezione e più importanza citotossicità causata da virus neurotropici limitare il loro utilizzo 4.

Un metodo alternativo è quello di esprimere i traccianti transsynaptic come transgeni in topi geneticamente modificati. Abbiamo recentemente modificato questa tecnica e sviluppato un sistema binario transsynaptic genetico analisi per mappare i circuiti neurali di qualsiasi popolazione neuronale geneticamente identificato 5. La nostra strategia sperimentale si basa su due nuovi ceppi di topi knock-in, che esprimono sia la lectina bidirezionale tracciante orzo (BL) 6 o il tracciante retrogrado tossina tetanica frammento C fusa a GFP (GTT) 7 dalla ROSA 26 locus dopo Cre-mediata ricombinazione. Qui abbiamo usato questi ceppi di topi per esprimere selettivamente BL e GTT in neuroni che producono kisspeptin, un neuropeptide che è implicato nella regolazione della maturazione dell'asse riproduttivo 8,9. Dimostriamo che questa tecnica è adatta per visualizzare lo sviluppo e la maturazione del baciopeptin circuiti neurali durante lo sviluppo embrionale del topo cervello femminile 5.

Strategia di allevamento

La R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) e R26-GFP-TTC (GTT) linee traccianti sono knock-in ceppi 5 che portano alleli ROSA26 ricombinanti. La R26-BIZ e gli alleli R26-GTT sono trascrizionalmente silente a causa della presenza di un forte segnale di arresto della trascrizione, che è affiancato da due siti loxP 5. Espressione del transgene BIZ e GTT è attivato dalla rimozione Cre-mediata del segnale di arresto trascrizionale. Gli alleli R26-BIZ e R26-GTT possono essere utilizzati indipendentemente attraversando semplicemente con una linea pilota Cre. Per gli animali di analisi eterozigoti per i rispettivi alleli Cre e R26 può essere utilizzato. Nidiata che trasportano una Cre o un allele R26, rispettivamente, dovrebbero essere utilizzati come controlli. In alternativa, è anche possibile generare tRiple knock-in animali portatori degli alleli Cre, R26-BIZ e R26-GTT, tuttavia ciò richiederà una croce supplementare.

Protocol

NOTA: Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal comitato il benessere degli animali dell'Università di Amburgo e l'Università di Saarland. 1. Preparazione e fissaggio del tessuto embrionale Disporre tutte le attrezzature necessarie per sezionare gli embrioni e preparare soluzioni per il successivo fissaggio del tessuto prima di sacrificare gli animali. NOTA: preparare sempre una soluzione fresca 4% paraformaldeide (PF…

Representative Results

Questa sezione mostra i risultati rappresentativi che possono essere ottenuti lavorando con la R26-BIZ (B L- I RES-τlac Z) e la R26-GTT (G FP TT C) alleli. Qui usiamo la R26-BIZ e gli alleli R26-GTT per analizzare la maturazione dei circuiti neurali che regolano l'asse riproduttivo. La riproduzione in vertebrati è controllata centralmente da un piccolo sottogruppo di neuroni dell'ipotalamo, che secernono l'ormone di rilascio delle gonadotropin…

Discussion

Esprimendo traccianti transsynaptic come transgeni per rintracciare i circuiti neurali di popolazioni di neuroni geneticamente definiti ha diversi vantaggi rispetto alla iniezione stereotassica di traccianti o virus neurotopic. Innanzitutto, il tracciante viene prodotta come proteina endogena e pertanto non suscitare una risposta immunitaria e un percorso neurale selettiva può essere analizzato in diversi animali con elevata riproducibilità. In secondo luogo, perché questo è un metodo non invasivo può essere utiliz…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Michael Candlish for critical comments on the manuscript. This project was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft grants BO1743/6 and SFB/TRR 152 P11 and Z02 to Ulrich Boehm.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye) Sigma 14530-100MG
Ethanol Sigma 32205-1L
Cryo mold (Peel-a-way) Polyscience Inc. 18646A-1 22mm x 22mm x 20mm
DMSO Sigma D8418-100ML
Dimethyl Formamide (DMF) VWR Chemicals 23470,293
EGTA ROTH 3054.3
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01
Glutaraldehyde Sigma G5882-50ML
Hydrogen peroxide Sigma 34988-7
Isopentane (Methyl 2-butane) Sigma M32631-2.5L
Kaiser's Glycine gelatin Merck 1092420100
Methanol Sigma 494437-1L
MgCl2 Sigma M2670-100G
NaCl ROTH HN00.2
NBT Sigma 298-83-9
Nonidet P40 substitute Fluka 743.85
OCT Leica 14020108926
PAP pen Dako S2002
Parafarmaldehyde Sigma P6148-1KG
Sodium deoxycholate Sigma D6750-25G
Sucrose Sigma S7903-1KG
Superfrost slides Thermo Scientific FT4981GLPLUS
TSA kit PerkinElmer  NEL700
TSA plus kit PerkinElmer  NEL749A001KT
Tris ROTH AE15.2
Triton-X 100 ROTH 3051.2
Tween 20 ROTH 9127.1
X-gal ROTH 2315.1
Cryostat Leica na
Light microscope equipped with DIC imaging  Zeiss Axioskop2 equipped with Axio Vision software
Fluroscence microscope Zeiss Axioskop2 equipped with Axio Vision software
Photoshop Adobe PS6
Goat anti-WGA (recognizes BL) Vector Laboatories AS-2024
Biotinylayted horse anti-goat IgG Vector Laboatories BA-9500 
Biotinylated goat anti-rabbit IgG Vector Laboatories BA-1000 
Rabbit anti-GFP (recognizes GTT) Invitrogen A11122
Rabbit anti-GnRH Affinity Bio Reagent PA1-121
Dylight488-donkey anti-rabbit IgG Thermo Scientific SA5-10038
SA-Alexa Fluor 546 Life Technologies S-11225
Primers
BL Fwd (for BIZ genotyping) Eurofins MWG Operon  ATGAAGATGATGAGCACCAG
GGC 
BL Rev  (for BIZ genotyping) Eurofins MWG Operon  AGCCCTCGCCGCAGAACTC 
Cre Fwd  (for Cre genotyping) Eurofins MWG Operon GTCGATGCAACGAGTGATGAG
GTTCG
Cre Rev  (for Cre genotyping) Eurofins MWG Operon CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTAC
ACCTGC
TTC Fwd  (for GTT genotyping) Eurofins MWG Operon AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT
TTC Rev  (for GTT genotyping) Eurofins MWG Operon GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCT
TGAA
XY Fwd (for gender genotyping) Eurofins MWG Operon TGAAGCTTTTGGCTTTGA
XY Rev  (for gender genotyping) Eurofins MWG Operon CCGCTGCCAAATTCTTTG
ROSA26 Fwd Eurofins MWG Operon CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC
ROSA26 Rev Eurofins MWG Operon GCAGATGGAGCGGGAGAAAT
SA Rev Eurofins MWG Operon CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC

References

  1. Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).
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Cite This Article
Kumar, D., Boehm, U. Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain. J. Vis. Exp. (94), e52487, doi:10.3791/52487 (2014).

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