Summary

Condicional transsynaptic genética Seguimiento en el cerebro de embriones de ratón

Published: December 22, 2014
doi:

Summary

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

Abstract

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Introduction

Rastreo de ruta anatómica es una de las herramientas más comúnmente utilizadas para descifrar la relación entre el cerebro y el comportamiento 1. El avance en las tecnologías de circuitos neuronales rastreo ha otorgado neurocientíficos con la capacidad de rastrear los circuitos neuronales de poblaciones de neuronas identificadas genéticamente en ratones 2. A pesar de estos avances técnicos que sigue siendo un reto para desentrañar la formación de circuitos neuronales especialmente durante la maduración embrionaria. Esto es porque la mayoría de los métodos de rastreo desarrolladas hasta la fecha se basan en la inyección estereotáxica de trazadores transsynaptic o virus neurotróficos modificados genéticamente (Figura 1) 2,3. Si bien estas técnicas de lograr la resolución espacial y temporal de la conectividad, varias limitaciones inherentes, tales como inyecciones de trazadores técnicamente desafiantes en el cerebro en desarrollo, la reproducibilidad de la sitio de la inyección, inflamación potencial en el sitio de la inyección y lo más importante citotoxicidad causada por los virus neurotróficos limitar su uso 4.

Un método alternativo consiste en expresar los trazadores transsynaptic como transgenes en ratones genéticamente alterados. Recientemente hemos modificado esta técnica y ha desarrollado un sistema de rastreo transsynaptic genética binaria para mapear los circuitos neurales de una población neuronal identificado genéticamente 5. Nuestra estrategia experimental se basa en dos nuevas cepas de ratón knock-in, que expresan ya sea la lectina de cebada trazador bidireccional (BL) 6 o el trazador retrógrado fragmento de la toxina tetánica C fusionado a GFP (GTT) 7 desde el locus ROSA 26 después mediada por Cre recombinación. Aquí hemos utilizado estas cepas de ratón para expresar selectivamente BL y GTT en las neuronas que producen kisspectina, un neuropéptido que está implicada en la regulación de la maduración del eje reproductivo 8,9. Se demuestra que esta técnica es adecuado para visualizar el desarrollo y maduración del besocircuitos neuronales peptina durante el desarrollo embrionario del cerebro del ratón hembra 5.

Estrategia de cría

El R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) y los R26-GFP-TTC (GTT) líneas trazadoras son ronda en cepas 5 que llevan alelos ROSA26 recombinantes. El R26-BIZ y los alelos R26-GTT son transcripcionalmente silencioso debido a la presencia de una fuerte señal de parada transcripcional, que está flanqueado por dos sitios loxP 5. Expresión del transgén BIZ GTT y se activa por la eliminación mediada por Cre de la señal de parada transcripcional. Los alelos R26 y R26-BIZ-GTT se pueden utilizar independientemente con sólo cruzar con una línea piloto Cre. Para los animales de análisis de heterocigotos para los alelos respectivos Cre y R26 pueden ser utilizados. Littermates que llevan uno Cre o un alelo R26, respectivamente, deben ser utilizados como controles. Alternativamente, también es posible generar tRiple ronda en animales portadores de los alelos Cre, R26 y R26-BIZ-GTT, sin embargo esto requerirá una cruz adicional.

Protocol

NOTA: Declaración de Ética: Los procedimientos que implican sujetos animales fueron aprobados por el Comité de Bienestar Animal de la Universidad de Hamburgo y la Universidad de Saarland. 1. Preparación y fijación de tejido embrionario Organizar todos los equipos necesarios para diseccionar los embriones y preparar soluciones para la posterior fijación de los tejidos antes de sacrificar a los animales. NOTA: Siempre preparar una solución fresca 4% de paraformaldehíd…

Representative Results

Esta sección muestra los resultados representativos que se pueden obtener a trabajar con el R26-BIZ (B L I RES-τlac Z) y la R26-GTT (G FP-TT C) alelos. Aquí se utiliza el R26-BIZ y los alelos R26-GTT para analizar la maduración de los circuitos neuronales que regulan el eje reproductivo. La reproducción en los vertebrados está controlado por un pequeño grupo de neuronas en el hipotálamo, que secretan la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH). Kisspepti…

Discussion

Expresando trazadores transsynaptic como transgenes para rastrear los circuitos neurales de poblaciones neuronales definidas genéticamente tiene varias ventajas en comparación con la inyección estereotáxica de trazadores o virus neurotopic. En primer lugar, el trazador se produce como una proteína endógena y por lo tanto no provoca ninguna respuesta inmune y una vía neural selectiva puede ser analizada en diferentes animales con alta reproducibilidad. En segundo lugar, porque este es un método no invasivo que se…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Michael Candlish for critical comments on the manuscript. This project was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft grants BO1743/6 and SFB/TRR 152 P11 and Z02 to Ulrich Boehm.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye) Sigma 14530-100MG
Ethanol Sigma 32205-1L
Cryo mold (Peel-a-way) Polyscience Inc. 18646A-1 22mm x 22mm x 20mm
DMSO Sigma D8418-100ML
Dimethyl Formamide (DMF) VWR Chemicals 23470,293
EGTA ROTH 3054.3
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01
Glutaraldehyde Sigma G5882-50ML
Hydrogen peroxide Sigma 34988-7
Isopentane (Methyl 2-butane) Sigma M32631-2.5L
Kaiser's Glycine gelatin Merck 1092420100
Methanol Sigma 494437-1L
MgCl2 Sigma M2670-100G
NaCl ROTH HN00.2
NBT Sigma 298-83-9
Nonidet P40 substitute Fluka 743.85
OCT Leica 14020108926
PAP pen Dako S2002
Parafarmaldehyde Sigma P6148-1KG
Sodium deoxycholate Sigma D6750-25G
Sucrose Sigma S7903-1KG
Superfrost slides Thermo Scientific FT4981GLPLUS
TSA kit PerkinElmer  NEL700
TSA plus kit PerkinElmer  NEL749A001KT
Tris ROTH AE15.2
Triton-X 100 ROTH 3051.2
Tween 20 ROTH 9127.1
X-gal ROTH 2315.1
Cryostat Leica na
Light microscope equipped with DIC imaging  Zeiss Axioskop2 equipped with Axio Vision software
Fluroscence microscope Zeiss Axioskop2 equipped with Axio Vision software
Photoshop Adobe PS6
Goat anti-WGA (recognizes BL) Vector Laboatories AS-2024
Biotinylayted horse anti-goat IgG Vector Laboatories BA-9500 
Biotinylated goat anti-rabbit IgG Vector Laboatories BA-1000 
Rabbit anti-GFP (recognizes GTT) Invitrogen A11122
Rabbit anti-GnRH Affinity Bio Reagent PA1-121
Dylight488-donkey anti-rabbit IgG Thermo Scientific SA5-10038
SA-Alexa Fluor 546 Life Technologies S-11225
Primers
BL Fwd (for BIZ genotyping) Eurofins MWG Operon  ATGAAGATGATGAGCACCAG
GGC 
BL Rev  (for BIZ genotyping) Eurofins MWG Operon  AGCCCTCGCCGCAGAACTC 
Cre Fwd  (for Cre genotyping) Eurofins MWG Operon GTCGATGCAACGAGTGATGAG
GTTCG
Cre Rev  (for Cre genotyping) Eurofins MWG Operon CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTAC
ACCTGC
TTC Fwd  (for GTT genotyping) Eurofins MWG Operon AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT
TTC Rev  (for GTT genotyping) Eurofins MWG Operon GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCT
TGAA
XY Fwd (for gender genotyping) Eurofins MWG Operon TGAAGCTTTTGGCTTTGA
XY Rev  (for gender genotyping) Eurofins MWG Operon CCGCTGCCAAATTCTTTG
ROSA26 Fwd Eurofins MWG Operon CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC
ROSA26 Rev Eurofins MWG Operon GCAGATGGAGCGGGAGAAAT
SA Rev Eurofins MWG Operon CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC

References

  1. Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).
  2. Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu. Rev. Neurosci. 36, 183-215 (2013).
  3. Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
  4. DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291, 2608-2613 (2001).
  5. Kumar, D., et al. Murine arcuate nucleus kisspeptin neurons communicate with GnRH neurons in utero. J. Neurosci. 34, 3756-3766 (2014).
  6. Horowitz, L. F., Montmayeur, J. P., Echelard, Y., Buck, L. B. A genetic approach to trace neural circuits. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3194-3199 (1999).
  7. Maskos, U., Kissa, K., ST Cloment, C., Brulet, P. Retrograde trans-synaptic transfer of green fluorescent protein allows the genetic mapping of neuronal circuits in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 10120-10125 (2002).
  8. De Roux, N., et al. Hypogonadotropic hypogonadism due to loss of function of the KiSS1-derived peptide receptor GPR54. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10972-10976 (2003).
  9. Seminara, S. B., et al. The GPR54 gene as a regulator of puberty. N. Engl. J. Med. 349, 1614-1627 (2003).
  10. Mayer, C., et al. Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor alpha-signaling in kisspeptin neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 22693-22698 (2010).
  11. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat. Genet. 21, 70-71 (1999).
  12. Seibler, J., et al. Single copy shRNA configuration for ubiquitous gene knockdown in mice. Nucleic Acids Res. 33, e67 (2005).
  13. Semaan, S. J., Kauffman, A. S. Emerging concepts on the epigenetic and transcriptional regulation of the Kiss1 gene. Int. J. Dev. Neurosci. 31, 452-462 (2013).
  14. Feil, R., et al. Ligand-activated site-specific recombination in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10887-10890 (1996).

Play Video

Cite This Article
Kumar, D., Boehm, U. Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain. J. Vis. Exp. (94), e52487, doi:10.3791/52487 (2014).

View Video