Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.
The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.
यह स्वाभाविक रूप से साइटोसिन मेथिलिकरण एक के रूप में डीएनए संशोधनों से होने वाली की पहली रिपोर्ट के बाद आधी शताब्दी से अधिक कर दिया गया है। Cytosine मेथिलिकरण आधार अंगूठी पर 5 वें कार्बन एक मिथाइल समूह (5-एमसी), सबसे अधिक बार स्तनधारी जीनोम में CPG डाईन्यूक्लियोटाइड आकृति में होने वाली है, जहां एक संशोधित साइटोसिन न्यूक्लियोटाइड आधार है। अनुपस्थिति ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि 2 के साथ जुड़ा हुआ है, जबकि जीन प्रमोटरों में 5 एम सी के कार्यात्मक उपस्थिति आम तौर पर, ट्रांसक्रिप्शनल दमन के साथ जुड़ा हुआ है।
जबरदस्त प्रगति विकास 3 में डीएनए मेथिलिकरण, epigenetic प्रोफाइल के 4, कैंसर रोगजनन 5,6, और अन्य अनुसंधान क्षेत्रों की संख्या के transgeneration प्रचार की भूमिका के बारे में हमारी समझ में किया गया है। नए तरीके में डीएनए मेथिलिकरण 7 प्रोफ़ाइल करने के लिए विकसित किया गया है के रूप में इन अग्रिमों के कई पिछले कुछ वर्षों में आ गए हैं। आगमन के साथ औरअगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) तकनीक को लोकप्रिय अब एक पूरे जीनोम या एक जीनोम 8 के बड़े क्षेत्रों में डीएनए मेथिलिकरण प्रोफ़ाइल करने के तरीकों में से एक नंबर रहे हैं। इन तरीकों डीएनए मेथिलिकरण पैटर्न और डीएनए मेथिलिकरण में मतभेद यों खोज की है कि पढ़ाई की संभावना खुला। इन परिकल्पना पैदा दृष्टिकोण के अलावा, लक्षित / परिकल्पना परीक्षण डीएनए मेथिलिकरण quantitation के तरीकों के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है।
Pyrosequencing, मेथिलिकरण विशिष्ट पीसीआर, और bisulfite परिवर्तित डीएनए के प्रत्यक्ष सेंगर अनुक्रमण लक्षित क्षेत्रों के विश्लेषण के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया तरीकों के लिए किया गया है (यानी, एक जीन के प्रमोटर क्षेत्र या एक CPG द्वीप) 9-12। Methylated साइटोसिन के बरकरार 13,14 रहते हैं, जबकि इन तरीकों के सभी, bisulfite रूपांतरण, unmethylated साइटोसिन के uracil के रूप में परिवर्तित कर रहे हैं, जहां एक रासायनिक deamination प्रतिक्रिया पर निर्भर हैं। Bisulfite- की पीसीआर प्रवर्धनअंतर मेथिलिकरण एक आधार अंतर के रूप में बाहर पढ़ने के लिए अनुमति देता है थाइमिन 15 के साथ uracil के प्रतिस्थापन में परिवर्तित डीएनए का परिणाम है। अत्यधिक उपयोगी है, इन तरीकों के लिए सीमाओं को कम मात्रात्मक सटीकता, लघु पढ़ें लंबाई, और कम throughput नमूना शामिल है। इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए हम हम (BSAS) 16 Bisulfite Amplicon अनुक्रमण करार दिया है एक विधि विकसित की है। इस पद्धति का लक्ष्य उच्च मात्रात्मक सटीकता के साथ नमूनों की एक बड़ी संख्या में ब्याज का लक्ष्य जीनोमिक क्षेत्रों का विश्लेषण करने में सक्षम होना है।
BSAS मौजूदा तरीकों के तत्वों (bisulfite रूपांतरण और क्षेत्र विशेष पीसीआर प्रवर्धन) का उपयोग करता है और सरल अगली पीढ़ी के पुस्तकालय निर्माण (transposome की मध्यस्थता) 17 और benchtop NGS 18 (चित्रा 1) के साथ उन्हें जोड़ती है। इस दृष्टिकोण के हित के किसी भी क्षेत्र में साइटोसिन मेथिलिकरण जांच करने के लिए एक और मात्रात्मक और उच्च throughput विधि के लिए प्रदान करता है। यहाँ हम पेशविस्तार से विधि और समस्या निवारण और गुणवत्ता BSAS प्रक्रिया की जाँच के लिए दृष्टिकोण का वर्णन है।
BSAS नमूने और लक्ष्य की संख्या के दोनों संख्या में उच्च throughput क्षमताओं के साथ ध्यान केंद्रित किया, सही डीएनए मेथिलिकरण quantitation के लिए अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, transposome की मध्यस्थता tagmentation का उपयोग करते हुए इस पुस्तकालय पीढ़ी तेज, कम इनपुट डीएनए की आवश्यकता है और पारंपरिक बाल काटना और बाद एडाप्टर बंधाव तकनीक की तुलना में कम चरणों में हैं। मौजूदा तरीकों पर इन सुधारों हित के किसी भी लक्ष्य का सटीक आधार स्तर के डीएनए मेथिलिकरण विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं। इसके अलावा, BSAS पूरे जीनोम bisulfite 22 या कब्जा 23 तरीकों का उपयोग पहचान की गई है कि ब्याज के क्षेत्रों (विभिन्न मेथिलिकरण क्षेत्रों (DMRs), CPG द्वीप समूह, विनियामक क्षेत्रों) की पुष्टि के लिए एक नया तरीका प्रदान करता है। ओर्थोगोनल पुष्टि दृष्टिकोण और अधिक मात्रात्मक सटीक विधियों का प्रयोग epigenomic अध्ययन के विश्लेषणात्मक कठोरता में सुधार। BSAS के साथ हासिल की उच्च पढ़ें गहराई रहे हैं, एक संकीर्ण विश्वास अंतराल में सटीक quantitation के लिए अनुमति देता हैसटीक quantitation के 16 में sulting। साथ ही, एक ही प्रयोग में कई नमूने चलाने की क्षमता सांख्यिकीय शक्ति में वृद्धि होगी जो पूरे जीनोम के तरीकों की पुष्टि के लिए नमूने का आकार बढ़ाने के लिए कर सकते हैं; कई मौजूदा epigenetic अध्ययन की एक कमजोरी। महत्वपूर्ण बात है, BSAS epigenetic अनुसंधान के लिए परीक्षण योग्य परिकल्पना की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है जो एक आधार विशिष्ट CPG मेथिलिकरण quantitation, प्रदान करता है। इस तरह के एक विशेष प्रतिक्रिया तत्व में वृद्धि हुई मिथाइलेशन के रूप में परिकल्पना की कमी हुई एक विशिष्ट प्रतिलेखन कारक के बंधन में परिणाम होगा। बनती mRNA अभिव्यक्ति डेटा के साथ संयुक्त BSAS, ऊतक या सेल की आबादी का एक टुकड़ा भीतर epigenetic विनियमन और mRNA अभिव्यक्ति दोनों प्राप्त करने के लिए एक तरीका प्रदान करता है। विनियमन और अभिव्यक्ति की बनती माप भी वैज्ञानिक कठोरता और निष्कर्षों के प्रभाव को बढ़ा सकते हैं।
BSAS प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम प्राइमर डिजाइन, amplicon के अनुकूलन, और पुस्तकालय पीढ़ी / शामिलक्यूसी। प्राइमरों अच्छी तरह से डिजाइन और अलग अलग क्षमता 8 बजे बढ़ाना नहीं कर रहे हैं अगर पीसीआर पूर्वाग्रह शुरू की है। ऐसे enzymatically उत्पन्न 100% और 0% साइटोसिन methylated मानकों के रूप में मेथिलिकरण मानकों का उपयोग करते हैं, यदि कोई हो मेथिलिकरण quantitation के पूर्वाग्रह के, डिग्री का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और मेथिलिकरण 16 बढ़ाता है जब एक उचित पद्धति नियंत्रण किया जा सकता है। एक भी उच्च गुणवत्ता वाले amplicon पैदा करने के लिए पीसीआर प्रतिक्रियाओं के अनुकूलन इसी प्रकार, जब ध्यान रखा जाना चाहिए। कोई amplicon के प्रोटोकॉल में विस्तृत सुझाव दिया दिशानिर्देशों का उपयोग मौजूद है, तो अनुकूलन के चरणों में वृद्धि पीसीआर चक्र नंबर या bsDNA इनपुट राशि शामिल है। प्राइमर-dimers सहित कई पीसीआर उत्पादों, कर रहे हैं, अनुकूलन कदम, bsDNA इनपुट मात्रा कम पीसीआर प्राइमर दाढ़ इनपुट सांद्रता कम है, annealing के तापमान में वृद्धि, या पीसीआर चक्र संख्या घटते शामिल हैं। इन अनुकूलन प्रक्रियाओं में से एक या एक संयोजन एक एकल hig के उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त परिणाम पैदावारएच गुणवत्ता amplicon। वैकल्पिक रूप से, प्राइमरों redesigning एक भी amplicon उपज नहीं है कि प्राइमर सेट के लिए एक अच्छा तरीका है। नया स्वरूप उपयुक्त है या संभव नहीं है, जहां उन क्षेत्रों के लिए, दोनों रिवर्स प्राइमरों में CPG स्थलों पर CPG आगे प्राइमरों में साइटों और एडिनाइन की और गुआनिन है पर साइटोसिन की और थाइमिन का काम कर सकते हैं सहित प्राइमर सेट पतित। हालांकि, इन प्राइमर सेट पूर्वाग्रह उत्पन्न हो रही है कोई पीसीआर, इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर एक प्रक्रिया सुनिश्चित करने के लिए आगे अनुकूलन की जरूरत है। गुणवत्ता पुस्तकालयों की सफलता के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण हैं। QC उपायों अनुक्रमण पहले पुस्तकालयों के आकार, गुणवत्ता और मात्रा निर्धारित करने के लिए बाहर किया जाता है सुनिश्चित करें। अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं कम गुणवत्ता पुस्तकालयों के निवेश के साथ असफलता की संभावना है। मेथिलिकरण quantitation में पूर्वाग्रह मेथिलिकरण आवृत्तियों आगे दोनों में मौजूद हैं और अनुक्रमण पढ़ता रिवर्स कि सुनिश्चित करने के द्वारा कम किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, CPG साइटों के लिए aligning अड्डों की गुणवत्ता स्कोर उच्च सह के लिए ≥Q30 होना चाहिएquantitation में nfidence। दूसरों के ऊपर वर्णित मेट्रिक्स, यह सुनिश्चित करने bisulfite परिवर्तित डीएनए 19 की tagmentation प्रतिक्रियाओं में कोई पक्षपात करने के लिए पहले से थोड़ा दिखाया है जबकि कम पूर्वाग्रह मेथिलिकरण quantitation की पुष्टि के लिए अनुमति देता है।
BSAS वर्तमान में हालांकि, इस पद्धति के भविष्य के विस्तार में इस तरह के bisulfite रूपांतरण 24 से पहले पोटेशियम perruthenate शुरू करने के रूप में 5-एम सी और 5 HMC के बीच भेद प्रायोगिक कदमों के अलावा के साथ CPG 5-HMC की बनती माप की अनुमति देगा, CPG स्थलों पर मिथाइलेशन के उपाय। यह डीएनए मेथिलिकरण के जीन की अभिव्यक्ति नियामक भूमिकाओं का निर्धारण करने के क्रम में, बनती मिथाइलेशन के लिए अनुमति देकर 5-एम सी और 5 HMC, और अभिव्यक्ति डेटा दोनों BSAS उपयोगिता के प्रभाव में वृद्धि होगी। पीसीआर amplicons के Transposome की मध्यस्थता पुस्तकालय तैयारी परिलक्षित क्षेत्रों के सिरों पर कमी आई अनुक्रमण गहराई में परिणाम होता है। इसलिए, उच्च ब्याज के क्षेत्रों amplicons के बीच में निवास करने के लिए तैयार किया जाना चाहिए। केसीBSAS उत्पन्न करता है क्योंकि कभी, अनुक्रमण> 1000 एक्स, परिलक्षित क्षेत्रों के सिरों के पास माप उच्च बनी हुई है 5-एम सी के मात्रात्मक सटीकता की गहराई से पढ़ा है।
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Colleen Van Kirk for mouse retina and cerebellum samples, and Peter Gregory for figure generation. The authors also thank Dr. Allison Gillaspy and the Laboratory for Molecular Biology and Cytometry Research core for access to the MiSeq. This work was supported by NIH grants DA029405, EY021716, and AG026607 and the Donald W. Reynolds Foundation.
Name | Company | Cat # | Comments |
Agilent 2100 Bioanlyzer | Agilent | G29393AA | |
Agilent RNA 6000 Nano kit | Agilent | 5067-1511 | |
Agilent High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Typhoon 9200 | Amersham/GE Healthcare Life Sciences | ||
Agencourt AMPure XP – PCR Purification | Beckman Coulter | A63880 | 5 mL |
PowerPac Basic Power Supply | Bio Rad | 164-5050 | |
twin.tech PCR plate 96 | Eppendorf | 951020362 | semi-skirted |
Heatsealing Film | Eppendorf | 0030127838 | |
Heatsealing Foil | Eppendorf | 0030127854 | |
Heat Sealer | Eppendorf | 5390000.024 | |
0.1-10ul Tips | Eppendorf | 0030073.002 | |
2-200ul Tips | Eppendorf | 0030073.045 | |
50-1000ul Tips | Eppendorf | 0030073.100 | |
MixMate | Eppendorf | 5353000.014 | |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 0030121.023 | |
Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424000.010 | |
2.0 mL Microcentrifuge Tube | Eppendorf | 022363352 | |
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | 24 rxn |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | 24 indexes |
MiSeq Desktop Sequencer | Illumina | ||
MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2002 | 300cycle |
KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4824 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | |
Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit | Life Technologies | R11490 | |
ProFlex 96-well PCR system | Life Technologies | 4484075 | |
Novex 6% TBE DNA gel | Life Technologies | EC6261BOX | 10-well |
Novex TBE Running Buffer | Life Technologies | LC6675 | 5X (1 L) |
Novex Hi-Density TBE Sample Buffer | Life Technologies | LC6678 | 5X (10 mL) |
1 Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787-018 | |
Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | |
UltraPure 10mg/mL Ethidium Bromide | Life Technologies | 15585-011 | |
7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 | 384well block |
DynaMag-96 Side Skirted | Life Technologies | 12027 | |
SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices/VWR | 89429-532 | |
AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
Stainless Steel Beads | Qiagen | 69989 | 5 mm |
CLC Genomics Workbench | Qiagen | Software for methylation pipeline | |
QIAQuick PCR Purification kit | Qiagen | 28104 | 50 rxn |
TissueLyser II | Retsch/Qiagen | 85300 | |
Nuclease-Free Water | Sigma | W4502 | |
TRIS hydrochloride | Sigma | PHG0002-100G | |
Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
384-well Full-Skirted Plate, Standard | Thermo Scientific | AB-1384 | |
Absolute qPCR Seal | Thermo Scientific | AB-1170 | |
EZ DNA Methylation-Lightning kit | Zymo Research | D5030 | 50 rxn |
ZymoTaq DNA Polymerase | Zymo Research | E2001 | 50 rxn |