Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.
The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.
זה כבר יותר ממחצית המאה מאז הדו"ח הראשון של מתרחש באופן טבעי שינויי DNA בצורה של מתילציה ציטוזין 1. מתילציה ציטוזין היא בסיס נוקלאוטיד ציטוזין שונה בי פחמן 5 th על טבעת הבסיס יש קבוצה מתיל (5-MC), שכיחה ביותר במוטיב dinucleotide CPG בגנומים של יונקים. הנוכחות הפונקציונלית של 5-MC ביזמי גן מזוהית בדרך כלל עם דיכוי תעתיק, ואילו ההעדר קשור פעילות תעתיק 2.
התקדמות עצומה נעשתה בהבנה של תפקיד המתילציה של הדנ"א בפיתוח 3, התפשטות transgeneration פרופילים אפיגנטיים 4, פתוגנזה סרטן 5,6, ומספר תחומי מחקר האחרים שלנו. רבים מפיתוחים אלו הגיעו בשנים האחרונות כמתודולוגיות חדשות פותחו לפרופיל מתילציה DNA 7. עם כניסתו ופופולריזציה של טכניקות של הדור הבא רצף (NGS) יש כיום מספר השיטות לפרופיל מתילציה DNA על פני הגנום כולו או אזורים גדולים של הגנום 8. גישות אלו פותחות את האפשרות של לימודי גילוי שלכמת דפוסי מתילציה DNA והבדלים במתילציה DNA. בנוסף לגישות השערת מניבה אלה, יש צורך משמעותי לשיטות לכמת מתילציה DNA בדיקות ממוקדות / השערה.
Pyrosequencing, PCR הספציפי מתילציה, וסנגר רצף ישיר של ה- DNA המרה bisulfite היה השיטות הנפוצות ביותר לניתוח של אזורים ממוקדים (כלומר, אזור אמרגן של גן יחיד או אי CPG) 9-12. כל השיטות האלה מסתמכים על המרת bisulfite, תגובה כימית שבי דיאמינציה ציטוזין unmethylated של מומרות לאורציל של, בעוד ציטוזין מפוגל של להישאר 13,14 ללא פגע. ההגברה PCR של bisulfite-תוצאות המרה DNA בהחלפת אורציל של עם תימין 15 מאפשרות מתילציה ההפרש לקרוא את דרכו כהבדל בסיס. אמנם שימושי מאוד, המגבלות לשיטות אלה כוללות דיוק נמוך כמותי, אורך קריאה קצר, ותפוקת מדגם נמוכה. כדי לתת מענה למגבלות אלה פיתחנו שיטה שכינינו Bisulfite Amplicon רצף (BSAS) 16. מטרתה של שיטה זו היא להיות מסוגלת לנתח אזורים הגנומי היעד של עניין במספר גדול של דגימות עם דיוק כמותית גבוה.
BSAS משתמש באלמנטים של שיטות קיימות (המרה bisulfite והגברת PCR ספציפית לאזור) ומשלב אותם עם בנייה פשוטה של הדור הבא ספרייה (בתיווך transposome) 17 וbenchtop NGS 18 (איור 1). גישה זו מספקת לשיטת תפוקה יותר גבוהה כמותי ולבחון את מתילציה ציטוזין בכל אזור של עניין. כאן אנו מציגים אתשיטה בפירוט ותיאור גישות לפתרון בעיות ובדיקת איכות תהליך BSAS.
BSAS מאפשר להתמקד quantitation, מתילציה DNA מדויק עם יכולות תפוקה גבוהות בשני מספר הדגימות ומספר המטרות. בנוסף, דור ספרייה זו באמצעות tagmentation תיווך transposome דורש DNA קלט פחות, הוא מהיר יותר ומכיל פחות שלבים מאשר גז מסורתי וטכניקות קשירת מתאם שלאחר מכן. שיפורים אלה על פני שיטות קיימות מאפשרים ניתוח מתילציה DNA מדויק ברמת בסיס של כל מטרה של עניין. יתר על כן, BSAS מספק שיטה חדשה לאישור של אזורים של עניין (אזורי מתילציה באופן דיפרנציאלי (DMRS), איי CPG, אזורי רגולטורים) שזוהו באמצעות הגנום כולו 22 או 23 ללכוד גישות bisulfite. תוך שימוש בגישות המאונכות אישור ויותר כמותית שיטות מדויקות משפרת את הקשיחות אנליטי של מחקרי epigenomic. עומק הקריאה הגבוה שהושג עם BSAS מאפשר quantitation מדויק במרווח ביטחון צר, מחדשsulting בquantitation המדויק 16. בנוסף, את היכולת להפעיל דגימות רבות בניסוי אחד יכולה להגדיל את גודל המדגם לאישורים של שיטות הגנום כולו, אשר יגדילו את הכח הסטטיסטי; חולשה של מחקרים רבים אפיגנטיים הנוכחיים. חשוב לציין, BSAS מספק quantitation מתילציה CPG בסיס ספציפי, המאפשר לדור של השערות הניתנות לבדיקה למחקר אפיגנטיים. השערות כגון מתילציה עלתה באלמנט תגובה ספציפי תוביל לירידה בכריכה של גורם שעתוק ספציפי. BSAS, בשילוב עם נתונים ביטוי mRNA לזווג, מספק שיטה להשגת שתי רגולציה אפיגנטיים וביטוי mRNA בתוך פיסת רקמה או אוכלוסיית תא בודדת. מדידות מותאמים של רגולציה וביטוי גם להגדיל את הקשיחות ואת ההשפעה של הממצאים המדעיים.
צעדים קריטיים בפרוטוקול BSAS כוללים עיצוב פריימר, amplicon אופטימיזציה, ודור ספרייה /QC. ההטיה PCR הוא הציג אם פריימרים אינם מתוכננים כראוי ולהגביר את יעילות בשונה 8. שימוש בסטנדרטים מתילציה, כגון תקני ציטוזין 100% ו 0% שנוצרו אנזימים מפוגלים, ניתן להשתמש כדי לקבוע את המידה, אם בכלל, של ההטיה quantitation מתילציה, ושליטה מתודולוגיים נכונה כאשר כימותי מתילציה 16. בדומה לכך, יש לנקוט בזהירות בעת ביצוע אופטימיזציה לתגובות PCR ליצירת amplicon באיכות גבוהה יחיד. אם לא amplicon נוכחת באמצעות ההנחיות הציעו מפורטות בפרוטוקול, צעדי אופטימיזציה כוללים מספר גדל והולך PCR מחזור או סכום קלט bsDNA. אם יש מוצרי PCR מרובים, כוללים פריימר-הדימרים, צעדי אופטימיזציה כוללים הפחתת כמות קלט bsDNA, הפחתת ריכוזי קלט הטוחנות פריימר PCR, עלייה בטמפרטורות חישול, או להקטין את מספר מחזור PCR. אחד או שילוב של נהלי אופטימיזציה אלה מניב תוצאות מספקות כדי ליצור HIG אחתamplicon h-איכות. לחלופין, עיצוב מחדש של פריימרים הוא גישה טובה לקבוצות פריימר שלא להניב amplicon יחידה. לאלו אזורים שבם העיצוב מחדש אינו מתאים או אפשרי, מנוון סטי פריימר כולל שניהם עלול של ציטוזין והטימין של באתרי CPG בפריימרים קדימה ואדנין של וגואנין של באתרי CPG בפריימרים הפוכים לעבוד. עם זאת, ערכות פריימר אלה צריכים אופטימיזציה נוספת כדי להבטיח שאין PCR הטיה מתרחשת, תהליך מחוץ להיקף של פרוטוקול זה. ספריות איכות הן חשובות ביותר להצלחה. ודא שאמצעי QC מתבצעים כדי לקבוע את הגודל, איכות וכמות של ספריות לפני הרצף. תגובות רצף נוטות לכישלון עם קלט של ספריות באיכות נמוכה. הטיה בquantitation מתילציה ניתן למתן על ידי הבטחה כי תדרי מתילציה נמצאים בשני קדימה לאחור רצף קורא. בנוסף, ציוני איכות של בסיסי יישור לאתרי CPG צריכים להיות ≥Q30 גבוה שיתוףnfidence בquantitation. בעוד שאחרים הראו מעט קודם לכן לשום הטיה בתגובות tagmentation של DNA המרה bisulfite 19, להבטיח את המדדים שתוארו לעיל מאפשר לאישור quantitation מתילציה ההטיה הנמוך.
BSAS מודד כיום מתילציה באתרי CPG, לעומת זאת, הרחבות עתידיות של שיטה זו תאפשר מדידות מזווגות של CPG 5-HMC עם התוספת של צעדים ניסיוניים הבחנה בין 5-MC ו-5- HMC כגון החדרת perruthenate אשלגן לפני המרת bisulfite 24. זה יגביר את ההשפעה של שירות BSAS כך שהוא מאפשר למתילציה לזווג, שני 5-MC ו-5- HMC, ונתונים ביטוי על מנת לקבוע תפקידי רגולציה של ביטוי גני מתילציה DNA. הכנת ספריית תיווך Transposome של amplicons PCR אין לגרום לעומק רצף ירידה בקצוות של אזורים מוגברים. לכן, אזורים של ריבית גבוהה צריכים להיות מתוכננים לישיבה באמצע amplicons. איךאי פעם, כי BSAS יוצר רצף לקרוא מעמקי> 1000 X, דיוק כמותי של 5-MC מדידות ליד הקצוות של אזורים מוגברים נותרים גבוהות.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Colleen Van Kirk for mouse retina and cerebellum samples, and Peter Gregory for figure generation. The authors also thank Dr. Allison Gillaspy and the Laboratory for Molecular Biology and Cytometry Research core for access to the MiSeq. This work was supported by NIH grants DA029405, EY021716, and AG026607 and the Donald W. Reynolds Foundation.
Name | Company | Cat # | Comments |
Agilent 2100 Bioanlyzer | Agilent | G29393AA | |
Agilent RNA 6000 Nano kit | Agilent | 5067-1511 | |
Agilent High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Typhoon 9200 | Amersham/GE Healthcare Life Sciences | ||
Agencourt AMPure XP – PCR Purification | Beckman Coulter | A63880 | 5 mL |
PowerPac Basic Power Supply | Bio Rad | 164-5050 | |
twin.tech PCR plate 96 | Eppendorf | 951020362 | semi-skirted |
Heatsealing Film | Eppendorf | 0030127838 | |
Heatsealing Foil | Eppendorf | 0030127854 | |
Heat Sealer | Eppendorf | 5390000.024 | |
0.1-10ul Tips | Eppendorf | 0030073.002 | |
2-200ul Tips | Eppendorf | 0030073.045 | |
50-1000ul Tips | Eppendorf | 0030073.100 | |
MixMate | Eppendorf | 5353000.014 | |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 0030121.023 | |
Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424000.010 | |
2.0 mL Microcentrifuge Tube | Eppendorf | 022363352 | |
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | 24 rxn |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | 24 indexes |
MiSeq Desktop Sequencer | Illumina | ||
MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2002 | 300cycle |
KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4824 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | |
Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit | Life Technologies | R11490 | |
ProFlex 96-well PCR system | Life Technologies | 4484075 | |
Novex 6% TBE DNA gel | Life Technologies | EC6261BOX | 10-well |
Novex TBE Running Buffer | Life Technologies | LC6675 | 5X (1 L) |
Novex Hi-Density TBE Sample Buffer | Life Technologies | LC6678 | 5X (10 mL) |
1 Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787-018 | |
Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | |
UltraPure 10mg/mL Ethidium Bromide | Life Technologies | 15585-011 | |
7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 | 384well block |
DynaMag-96 Side Skirted | Life Technologies | 12027 | |
SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices/VWR | 89429-532 | |
AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
Stainless Steel Beads | Qiagen | 69989 | 5 mm |
CLC Genomics Workbench | Qiagen | Software for methylation pipeline | |
QIAQuick PCR Purification kit | Qiagen | 28104 | 50 rxn |
TissueLyser II | Retsch/Qiagen | 85300 | |
Nuclease-Free Water | Sigma | W4502 | |
TRIS hydrochloride | Sigma | PHG0002-100G | |
Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
384-well Full-Skirted Plate, Standard | Thermo Scientific | AB-1384 | |
Absolute qPCR Seal | Thermo Scientific | AB-1170 | |
EZ DNA Methylation-Lightning kit | Zymo Research | D5030 | 50 rxn |
ZymoTaq DNA Polymerase | Zymo Research | E2001 | 50 rxn |