Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.
The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.
بعد مضي أكثر من نصف قرن منذ التقرير الأول للتحدث بشكل طبيعي التعديلات DNA على شكل السيتوزين مثيلة 1. السيتوزين مثيلة هو قاعدة السيتوزين النوكليوتيدات المعدلة حيث الكربون 5 عشر على عصابة القاعدة لديه مجموعة الميثيل (5-MC)، تحدث في اغلب الاحيان في ثنائي النوكليوتيد عزر الدليل السياسي الشامل في جينومات الثدييات. وجود وظيفي من 5-MC في المروجين الجين يرتبط عموما القمع النسخي، في حين يرتبط غياب النشاط مع النسخي 2.
وقد تم إحراز تقدم هائل في فهمنا لدور الحامض النووي في التنمية 3، نشر transgeneration لمحات جينية 4، والسرطان المرضية 5،6، وعدد من المجالات البحثية الأخرى. وصلنا العديد من هذه الإنجازات في السنوات القليلة الماضية حيث تم تطوير منهجيات جديدة للصفحة الشخصية DNA مثيلة 7. مع ظهور وتعميم من الجيل المقبل من التسلسل (NGS) تقنيات وهناك الآن عدد من الطرق للصفحة الشخصية الحامض النووي عبر الجينوم بأكمله أو مناطق واسعة من الجينوم 8. هذه النهج تفتح إمكانية اكتشاف الدراسات التي تقيس كمية DNA أنماط مثيلة والاختلاف في الحامض النووي. وبالإضافة إلى هذه الأساليب المولدة للفرضية، هناك حاجة كبيرة لاستهداف / فرضية DNA اختبار طرق مثيلة الكميات.
وكانت سلسلة البايرو، مثيلة PCR معين، وتسلسل سانجر المباشر للDNA تحويل بيسلفيت الطرق الأكثر استخداما لتحليل المناطق المستهدفة (أي منطقة المروج من جين واحد أو جزيرة الدليل السياسي الشامل) 9-12. كل من هذه الطرق تعتمد على تحويل بيسلفيت، وهو رد فعل نزع الأمين الكيميائي حيث يتم تحويلها لالسيتوزين unmethylated إلى اليوراسيل، في حين لا تزال في السيتوزين ميثليته سليمة 13،14. PCR التضخيم من bisulfite-نتائج فحص الحمض النووي المحولة في استبدال واليوراسيل مع الثايمين 15 السماح للمثيلة التفاضلية لقراءة بها باعتبارها الفرق القاعدة. بينما مفيدة للغاية، والقيود المفروضة على هذه الطرق تشمل منخفضة الدقة الكمية، طول قراءة القصير، وانخفاض الإنتاجية عينة. لمعالجة هذه القيود قمنا بتطوير طريقة لدينا وصف بيسلفيت Amplicon تسلسل (المقايضة) 16. والهدف من هذه الطريقة هو أن تكون قادرة على تحليل المناطق الجينومية الهدف من الفائدة في عدد كبير من العينات بدقة كمية عالية.
يستخدم المقايضة عناصر من الأساليب القائمة (تحويل بيسلفيت والخاصة بكل منطقة التضخيم PCR) ويجمعها مع الجيل المقبل بسيط البناء مكتبة (بوساطة transposome) 17 والفوق NGS 18 (الشكل 1). ويوفر هذا النهج لطريقة الإنتاجية أكثر الكمي والتعليم العالي لدراسة مثيلة السيتوزين في أي منطقة من الفائدة. هنا نقدمطريقة بالتفصيل ووصف النهج لاستكشاف وفحص الجودة في عملية المقايضة.
المقايضة يسمح للركزت ودقيقة الكميات مثيلة الحمض النووي مع قدرات إنتاجية عالية في كل من عدد من العينات وعدد من الأهداف. بالإضافة إلى ذلك، هذا الجيل المكتبة باستخدام بوساطة transposome tagmentation يتطلب أقل DNA المدخلات، وأسرع وعلى خطوات أقل من القص التقليدي والتقنيات محول ربط لاحقة. هذه التحسينات على أساليب القائمة تسمح الدقيق على مستوى قاعدة تحليل الحامض النووي من أي هدف من الفائدة. وعلاوة على ذلك، المقايضة يوفر طريقة جديدة للحصول على تأكيد من المناطق ذات الاهتمام (المناطق مثيلة تفاضلي (DMRS)، والجزر الدليل السياسي الشامل، والمناطق التنظيمية) التي تم تحديدها باستخدام الجينوم كله بيسلفيت 22 أو 23 التقاط النهج. باستخدام نهج تأكيدا المتعامدة وأكثر الأساليب الكمية دقيقة يحسن الدقة التحليلية الدراسات epigenomic. عمق قراءة عالية تحقق مع المقايضة يسمح الكميات دقيقة في فاصل الثقة الضيق، وإعادةsulting في الكميات الدقيقة 16. بالإضافة إلى ذلك، والقدرة على تشغيل العديد من العينات في تجربة واحدة يمكن أن تزيد من حجم العينة لتأكيدات وسائل الجينوم كاملة، الأمر الذي سيزيد من قوة الإحصائية؛ نقطة ضعف العديد من الدراسات جينية الحالية. الأهم من ذلك، يوفر المقايضة على الدليل السياسي الشامل مثيلة الكميات قاعدة محددة، والذي يسمح لتوليد فرضيات قابلة للاختبار للأبحاث جينية. سوف فرضيات مثل زيادة مثيلة في عنصر استجابة محددة يؤدي إلى انخفاض ملزمة للعامل النسخ محددة. المقايضة، جنبا إلى جنب مع بيانات التعبير مرنا مقترن، يوفر طريقة للحصول على كل من التنظيم جينية ومرنا التعبير في قطعة واحدة من نسيج أو خلية السكان. قياسات يقترن التنظيم والتعبير أيضا أن يزيد من الدقة العلمية وتأثير النتائج.
وتشمل الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكول المقايضة التصميم التمهيدي، amplicon الأمثل، وتوليد مكتبة /QC. هو عرض PCR التحيز إذا لم يتم تصميمها بشكل صحيح الاشعال وتضخيم في الكفاءات المختلفة 8. استخدام المعايير مثيلة، مثل لدت إنزيمي 100٪ و 0٪ السيتوزين ميثليته المعايير، ويمكن استخدامها لتحديد درجة، إن وجدت، من التحيز مثيلة الكميات، وهو السيطرة المنهجية المناسبة عند قياس مثيلة 16. وبالمثل، ينبغي توخي الحذر عند تحسين ردود الفعل PCR لتوليد واحد amplicon ذات جودة عالية. إذا لم يكن هناك amplicon هو الحاضر باستخدام المبادئ التوجيهية المقترحة مفصل في البروتوكول، وتشمل الخطوات الأمثل أعداد متزايدة دورة PCR أو bsDNA كمية المدخلات. إذا كانت هناك منتجات PCR متعددة، بما في ذلك التمهيدي-dimers، وتشمل الخطوات الأمثل خفض كمية المدخلات bsDNA، وخفض PCR التمهيدي تركيزات المدخلات المولي، وزيادة درجات الحرارة الصلب، أو خفض عدد PCR دورة. واحد أو مزيج من هذه الإجراءات تحسين غلة النتائج كافية لتوليد المهزومة واحدح-نوعية amplicon. بدلا من ذلك، إعادة تصميم الاشعال هو نهج جيد لمجموعات التمهيدي التي لا تسفر عن amplicon واحد. لتلك المناطق حيث إعادة تصميم غير مناسب أو ممكن، تتحول مجموعات التمهيدي بما في ذلك قد تعمل السيتوزين والثايمين لفي مواقع الدليل السياسي الشامل في الاشعال إلى الأمام والأدينين والجوانين لفي مواقع الدليل السياسي الشامل في الاشعال العكسية. ومع ذلك، هذه المجموعات التمهيدي تحتاج إلى مزيد من التحسين لضمان عدم التحيز PCR يحدث، وهي عملية خارج نطاق هذا البروتوكول. المكتبات الجودة هي في غاية الأهمية للنجاح. ضمان أن تكون التدابير QC تتم لتحديد حجم ونوعية وكمية من المكتبات قبل التسلسل. ردود الفعل التسلسل عرضة للفشل مع مدخلات من المكتبات ذات جودة منخفضة. التحيز في مثيلة الكميات يمكن تخفيفها عن طريق ضمان أن الترددات مثيلة موجودة في كل من الأمام وعكس يقرأ التسلسل. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن عشرات نوعية قواعد التوفيق إلى مواقع الدليل السياسي الشامل يكون ≥Q30 لارتفاع شاركnfidence في الكميات. في حين أن آخرين قد أظهرت قليلا في وقت سابق الى أي تحيز في التفاعلات tagmentation من الحمض النووي تحويل بيسلفيت 19، وضمان المقاييس المذكورة أعلاه يسمح للتأكيد منخفضة التحيز مثيلة الكميات.
يقيس المقايضة حاليا مثيلة في مواقع الدليل السياسي الشامل، ومع ذلك، فإن التوسعات المستقبلية لهذه الطريقة تسمح القياسات الموثوقة من الدليل السياسي الشامل 5-مؤسسة حمد الطبية مع إضافة من الخطوات التجريبية التمييز بين 5-مولودية و5-مؤسسة حمد الطبية مثل إدخال perruthenate البوتاسيوم قبل التحويل بيسلفيت 24. سيؤدي هذا إلى زيادة تأثير المقايضة فائدة من خلال السماح للمثيلة مقترن، على حد سواء 5-مولودية و5-مؤسسة حمد الطبية، والبيانات التعبير من أجل تحديد الأدوار التنظيمية التعبير الجيني من الحامض النووي. إعداد مكتبة Transposome بوساطة من amplicons PCR لا يؤدي إلى انخفاض عمق التسلسل في نهايات المناطق تضخيمها. ولذلك، ينبغي أن تصمم مناطق فائدة مرتفعة للإقامة في وسط amplicons. كيفمن أي وقت مضى، لأن المقايضة يولد قراءة التسلسل أعماق> 1،000 X، دقة كمية من 5-MC القياسات بالقرب من أقاصي المناطق تضخيم لا تزال مرتفعة.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Colleen Van Kirk for mouse retina and cerebellum samples, and Peter Gregory for figure generation. The authors also thank Dr. Allison Gillaspy and the Laboratory for Molecular Biology and Cytometry Research core for access to the MiSeq. This work was supported by NIH grants DA029405, EY021716, and AG026607 and the Donald W. Reynolds Foundation.
Name | Company | Cat # | Comments |
Agilent 2100 Bioanlyzer | Agilent | G29393AA | |
Agilent RNA 6000 Nano kit | Agilent | 5067-1511 | |
Agilent High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Typhoon 9200 | Amersham/GE Healthcare Life Sciences | ||
Agencourt AMPure XP – PCR Purification | Beckman Coulter | A63880 | 5 mL |
PowerPac Basic Power Supply | Bio Rad | 164-5050 | |
twin.tech PCR plate 96 | Eppendorf | 951020362 | semi-skirted |
Heatsealing Film | Eppendorf | 0030127838 | |
Heatsealing Foil | Eppendorf | 0030127854 | |
Heat Sealer | Eppendorf | 5390000.024 | |
0.1-10ul Tips | Eppendorf | 0030073.002 | |
2-200ul Tips | Eppendorf | 0030073.045 | |
50-1000ul Tips | Eppendorf | 0030073.100 | |
MixMate | Eppendorf | 5353000.014 | |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 0030121.023 | |
Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424000.010 | |
2.0 mL Microcentrifuge Tube | Eppendorf | 022363352 | |
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | 24 rxn |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | 24 indexes |
MiSeq Desktop Sequencer | Illumina | ||
MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2002 | 300cycle |
KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4824 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | |
Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit | Life Technologies | R11490 | |
ProFlex 96-well PCR system | Life Technologies | 4484075 | |
Novex 6% TBE DNA gel | Life Technologies | EC6261BOX | 10-well |
Novex TBE Running Buffer | Life Technologies | LC6675 | 5X (1 L) |
Novex Hi-Density TBE Sample Buffer | Life Technologies | LC6678 | 5X (10 mL) |
1 Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787-018 | |
Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | |
UltraPure 10mg/mL Ethidium Bromide | Life Technologies | 15585-011 | |
7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 | 384well block |
DynaMag-96 Side Skirted | Life Technologies | 12027 | |
SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices/VWR | 89429-532 | |
AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
Stainless Steel Beads | Qiagen | 69989 | 5 mm |
CLC Genomics Workbench | Qiagen | Software for methylation pipeline | |
QIAQuick PCR Purification kit | Qiagen | 28104 | 50 rxn |
TissueLyser II | Retsch/Qiagen | 85300 | |
Nuclease-Free Water | Sigma | W4502 | |
TRIS hydrochloride | Sigma | PHG0002-100G | |
Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
384-well Full-Skirted Plate, Standard | Thermo Scientific | AB-1384 | |
Absolute qPCR Seal | Thermo Scientific | AB-1170 | |
EZ DNA Methylation-Lightning kit | Zymo Research | D5030 | 50 rxn |
ZymoTaq DNA Polymerase | Zymo Research | E2001 | 50 rxn |