Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.
The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.
Es hat über ein halbes Jahrhundert seit dem ersten Bericht von natürlich vorkommenden DNA-Modifikationen in Form von Cytosin-Methylierung 1 gewesen. Cytosin-Methylierung ist ein modifiziertes Cytosin Nukleotidbase wo die 5. Kohlenstoff auf dem Basisring hat eine Methylgruppe (5-MC), die am häufigsten in dem CpG-Dinukleotid-Motiv in Säugergenomen auftritt. Die funktionale Anwesenheit von 5-mC in Gen-Promotoren in der Regel mit Transkriptionsrepression verbunden, während der Abwesenheit ist mit Transkriptionsaktivität 2 verbunden.
Enorme Fortschritte in unserem Verständnis von der Rolle der DNA-Methylierung in der Entwicklung 3. Transgeneration Ausbreitung von epigenetische Profile 4, Krebs Pathogenese 5,6, und eine Reihe von anderen Forschungsbereichen vorgenommen. Viele dieser Fortschritte haben in den letzten Jahren kommen, wie neue Methoden entwickelt, um die DNA-Methylierung 7 Profil. Mit dem Aufkommen undPopularisierung der Next-Generation-Sequencing (NGS) Techniken gibt es nun eine Reihe von Methoden zur DNA-Methylierung für einen ganzen Genoms oder große Bereiche eines Genoms 8 Profil. Diese Ansätze die Möglichkeit offen, Entdeckung Studien, die DNA-Methylierungsmuster und Unterschiede in der DNA-Methylierung zu quantifizieren. Zusätzlich zu diesen Hypothesen-Erzeugungs Ansätze besteht ein erheblicher Bedarf für eine gezielte / Hypothesentests DNA Methylierung Quantifizierungsverfahren.
Pyrosequenzierung methylierungsspezifischen PCR und direkte Sanger-Sequenzierung von Bisulfit umgewandelte DNA waren die am häufigsten verwendete Verfahren zur Analyse von Zielregionen (das heißt, eine Promotorregion von einem Gen oder einer CpG-Insel), 9-12. Alle diese Verfahren beruhen auf Bisulfitumwandlung, eine chemische Reaktion, bei der Deaminierung unmethylierte Cytosin sind in Uracil umgewandelt, während methylierte Cytosin bleiben intakt 13,14. PCR-Amplifikation von bisulfite-konvertierter DNA ergibt Ersatz von Uracil mit Thymin 15 so dass der Differenz Methylierung als Basis Differenz ausgelesen. Während sehr nützlich, die Grenzen zu diesen Verfahren sind geringe quantitative Genauigkeit, kurze Leselänge und geringen Probendurchsatz. Um diese Einschränkungen zu adressieren wir eine Methode haben wir Bisulfit-Sequenzierung Amplicon (BSAS) 16 bezeichnet wird entwickelt. Das Ziel dieser Methode ist es, in der Lage, Ziel genomischen Regionen von Interesse in einer Vielzahl von Proben mit einer hohen quantitativen Genauigkeit zu analysieren.
BSAS nutzt Elemente der bestehenden Methoden (Bisulfitumwandlung und regionsspezifische PCR-Amplifikation) und kombiniert sie mit einfachen nächsten Generation Bibliothekskonstruktion (transposome vermittelte) 17 und Tisch NGS 18 (Abbildung 1). Dieser Ansatz sorgt für eine quantitative und eine höhere Durchsatzverfahren, um die Cytosin-Methylierung in einer beliebigen Region von Interesse zu untersuchen. Hier präsentieren wir dieVerfahren im Detail und beschreibt Methoden für die Fehlersuche und die Qualität der Überprüfung der BSAS-Prozess.
BSAS ermöglicht konzentriert, präzise Quantifizierung der DNA-Methylierung bei hohen Durchsatzkapazitäten sowohl in Anzahl der Proben und die Anzahl der Ziele. Darüber hinaus bietet diese Bibliothek unter Anwendung transposome vermittelte tagmentation benötigt weniger Input-DNA ist schneller und enthält weniger Schritte als bei herkömmlichen Scheren und nachfolgende Adapter Ligationstechniken. Diese Verbesserungen gegenüber bestehenden Verfahren erlauben eine präzise Basis-Level-DNA-Methylierungsanalyse von jedem Ziel von Interesse. Darüber hinaus bietet BSAS eine neue Methode zur Bestätigung der interessierenden Bereiche (differentiell Methylierung Regionen (DMRs), CpG-Inseln, regulatorische Regionen) mit Hilfe des gesamten Genoms Bisulfit 22 oder 23 zu erfassen Ansätze, die identifiziert wurden. Mit orthogonalen Bestätigung Ansätze und mehr quantitativ präzise Methoden verbessert die analytische Strenge epigenomischen Studien. Die hohe Lesetiefe mit BSAS erreicht ermöglicht eine präzise Quantifizierung in einem engen Vertrauensintervall, erneutBeratung in präzise Quantifizierung 16. Darüber hinaus kann die Fähigkeit, viele Proben in einem einzigen Experiment führen Sie den Stichprobenumfang für Bestätigungen gesamten Genoms Methoden, die die statistische Aussagekraft erhöhen zu erhöhen; eine Schwäche vieler aktueller epigenetische Studien. Wichtig ist, bietet BSAS eine basenspezifische CpG Methylierung die Quantifizierung, die für die Erzeugung von testbaren Hypothesen für die epigenetische Forschung ermöglicht. Hypothesen wie erhöhte Methylierung an einer bestimmten Antwortelement führen zu einer verringerten Bindung eines spezifischen Transkriptionsfaktors führen. BSAS, kombiniert mit gekoppelten mRNA-Expressionsdaten, stellt ein Verfahren zur Gewinnung sowohl epigenetischen Regulation und mRNA-Expression in einem einzigen Stück Gewebe oder Zellpopulation. Doppelbestimmungen der Regulation und Expression erhöhen auch die wissenschaftliche Strenge und Auswirkungen der Ergebnisse.
Kritische Schritte in der BSAS-Protokoll umfassen Primer-Design, Amplikon Optimierung und Bibliothek Generation /QC. PCR Vorspannung eingeführt werden, wenn Primer sind nicht richtig ausgelegt und verstärken auf verschiedenen Wirkungsgraden 8. Die Verwendung von Methylierungsstandards wie enzymatisch erzeugten 100% und 0% Cytosin methylierte Standards kann verwendet werden, um den Grad zu bestimmen, falls vorhanden, der Methylierung Quantifizierung bias, und ist eine geeignete Methodensteuerung bei der Quantifizierung Methylierungs 16. Ebenso sollte Sorgfalt bei der Optimierung der PCR-Reaktionen zur Erzeugung eines einzelnen hochwertigen Amplikon genommen werden. Wenn kein Amplikon vorhanden ist mit den vorgeschlagenen Leitlinien im Protokoll aufgeführt, sind Optimierungsschritte erhöhen PCR-Zyklus-Nummern oder bsDNA Eingangsmenge. Wenn es mehrere PCR-Produkte, einschließlich Primer-Dimere umfassen Optimierungsschritte abnimmt bsDNA Eingangsgrße, die Verringerung der PCR Primer molaren Eingangskonzentrationen zunehmende Glühtemperaturen oder Verringern PCR Zykluszahl. Eines oder eine Kombination dieser Optimierungsverfahren ergibt zufriedenstellende Ergebnisse, um eine einzige hig erzeugenh-Qualität Amplikon. Alternativ Neugestaltung Primer ist ein guter Ansatz für die Primer-Sets, die eine einzelne Amplicon nicht nachgeben müssen. Für Regionen, in denen Redesign ist nicht geeignet oder möglich ist, degenerieren Primer-Sets einschließlich Cytosin und Thymin ist an CpG-Stellen in Vorwärtsprimer und Adenin und Guanin ist an CpG-Stellen in umgekehrter Primer können zu arbeiten. Allerdings müssen diese Primersätze weitere Optimierung keine PCR Vorspannung auftritt, ein Verfahren außerhalb des Umfangs dieses Protokolls. Qualität Bibliotheken sind für den Erfolg von großer Bedeutung. Stellen Sie sicher, dass QC Maßnahmen durchgeführt, um Größe, Qualität und Quantität der Bibliotheken, bevor Sequenzierung zu bestimmen. Sequenzierungsreaktionen sind anfällig für Fehler bei Eingabe von niedriger Qualität Bibliotheken. Bias in Methylierung Quantifizierung kann, indem sichergestellt wird, dass die Methylierung Frequenzen sowohl in Vorwärts- als vorhanden sind und Reverse-Sequenzierung liest gemildert werden. Darüber hinaus sollte die Qualität Partituren von Basen Angleichung an CpG ≥Q30 für Hoch Zusammenarbeit seinnfidence in Quantifizierung. Während andere bisher wenig bis keine Verzerrungen bei tagmentation Reaktionen von Bisulfit-konvertierter DNA 19 gezeigt, wodurch die oben beschriebenen Metriken können zur Bestätigung der niedrigen Bias-Methylierung Quantifizierung.
BSAS misst derzeit Methylierung an CpG-Stellen wird jedoch zukünftige Erweiterungen dieses Verfahrens Doppelbestimmungen von CpG 5-HMC unter Zusatz von experimentellen Schritte Unterscheiden zwischen 5-mC und 5-hmC wie die Einführung von Kalium perruthenat vor Bisulfit-Umwandlung von 24 zu ermöglichen. Dies wird die Auswirkungen der BSAS-Dienstprogramm, indem für gepaarte Methylierung um Genexpression regulatorische Rolle von DNA-Methylierung bestimmen zu erhöhen, sowohl 5-mC und 5-hmC und Expressionsdaten. Transposome vermittelte Bibliothek Herstellung von PCR-Amplicons nicht verringerten Sequenzierung Tiefe an den Enden der amplifizierten Bereiche führen. Daher sollten die Regionen von hohem Interesse konstruiert werden, um in der Mitte des Amplikons befinden. Wieimmer, weil BSAS erzeugt Sequenzierung ausgelesen Tiefen> 1000 X, die quantitative Genauigkeit von 5-mC Messungen in der Nähe der Enden der amplifizierten Bereiche hoch bleibt.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Colleen Van Kirk for mouse retina and cerebellum samples, and Peter Gregory for figure generation. The authors also thank Dr. Allison Gillaspy and the Laboratory for Molecular Biology and Cytometry Research core for access to the MiSeq. This work was supported by NIH grants DA029405, EY021716, and AG026607 and the Donald W. Reynolds Foundation.
Name | Company | Cat # | Comments |
Agilent 2100 Bioanlyzer | Agilent | G29393AA | |
Agilent RNA 6000 Nano kit | Agilent | 5067-1511 | |
Agilent High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Typhoon 9200 | Amersham/GE Healthcare Life Sciences | ||
Agencourt AMPure XP – PCR Purification | Beckman Coulter | A63880 | 5 mL |
PowerPac Basic Power Supply | Bio Rad | 164-5050 | |
twin.tech PCR plate 96 | Eppendorf | 951020362 | semi-skirted |
Heatsealing Film | Eppendorf | 0030127838 | |
Heatsealing Foil | Eppendorf | 0030127854 | |
Heat Sealer | Eppendorf | 5390000.024 | |
0.1-10ul Tips | Eppendorf | 0030073.002 | |
2-200ul Tips | Eppendorf | 0030073.045 | |
50-1000ul Tips | Eppendorf | 0030073.100 | |
MixMate | Eppendorf | 5353000.014 | |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 0030121.023 | |
Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424000.010 | |
2.0 mL Microcentrifuge Tube | Eppendorf | 022363352 | |
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | 24 rxn |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | 24 indexes |
MiSeq Desktop Sequencer | Illumina | ||
MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2002 | 300cycle |
KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4824 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | |
Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit | Life Technologies | R11490 | |
ProFlex 96-well PCR system | Life Technologies | 4484075 | |
Novex 6% TBE DNA gel | Life Technologies | EC6261BOX | 10-well |
Novex TBE Running Buffer | Life Technologies | LC6675 | 5X (1 L) |
Novex Hi-Density TBE Sample Buffer | Life Technologies | LC6678 | 5X (10 mL) |
1 Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787-018 | |
Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | |
UltraPure 10mg/mL Ethidium Bromide | Life Technologies | 15585-011 | |
7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 | 384well block |
DynaMag-96 Side Skirted | Life Technologies | 12027 | |
SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices/VWR | 89429-532 | |
AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
Stainless Steel Beads | Qiagen | 69989 | 5 mm |
CLC Genomics Workbench | Qiagen | Software for methylation pipeline | |
QIAQuick PCR Purification kit | Qiagen | 28104 | 50 rxn |
TissueLyser II | Retsch/Qiagen | 85300 | |
Nuclease-Free Water | Sigma | W4502 | |
TRIS hydrochloride | Sigma | PHG0002-100G | |
Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
384-well Full-Skirted Plate, Standard | Thermo Scientific | AB-1384 | |
Absolute qPCR Seal | Thermo Scientific | AB-1170 | |
EZ DNA Methylation-Lightning kit | Zymo Research | D5030 | 50 rxn |
ZymoTaq DNA Polymerase | Zymo Research | E2001 | 50 rxn |