Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.
The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.
Det har vært over et halvt århundre siden den første rapporten av naturlig forekommende DNA modifikasjoner i form av cytosin metylering en. Cytosin metylering er en modifisert cytosin nukleotid-base hvor den 5. karbon på basisringen har en metylgruppe (5-MC), som oftest forekommer i CpG-dinukleotid motiv i pattedyr genomer. Den funksjonelle nærvær av 5-mC i genet promotorer er vanligvis forbundet med transkripsjonen undertrykking, mens fraværet er forbundet med transkripsjonen aktivitet 2.
Store fremskritt er gjort i vår forståelse av rollen av DNA metylering i utvikling 3, transgeneration forplantning av epigenetiske profiler 4, kreft patogeneserelaterte 5,6, og en rekke andre forskningsområder. Mange av disse fremskrittene har kommet i de siste årene som nye metoder har blitt utviklet for å profilere DNA metylering 7. Med advent ogpopularisering av neste generasjons sekvensering (NGS) teknikker er det nå en rekke metoder for å profilere DNA metylering over en hel genom eller store regioner av et genom 8. Disse tilnærmingene åpner muligheten for oppdagelse studier som kvantifiserer DNA-metylering mønstre og forskjeller i DNA metylering. I tillegg til disse hypotese generer tilnærminger, er det et betydelig behov for målrettet / hypotesetesting DNA-metylering kvantiteringsstandarder metoder.
Pyrosekvensering, metylering spesifikk PCR, og direkte Sanger-sekvensering av bisulfit konverterte DNA har vært de mest brukte metoder for analyse av målrettede regioner (dvs. en promoter-regionen i et enkelt gen eller en CpG island) 9-12. Alle disse metodene er avhengige av bisulfite konvertering, en kjemisk deaminering reaksjon hvor unmethylated cytosin-er omgjort til uracil-tallet, mens denaturert cytosin er fortsatt intakt 13,14. PCR-amplifisering av bisulfittkatalysertkonverterte DNA resulterer i erstatning av uracil er med tymin 15 slik at differensial metylering for å lese ut som en base forskjell. Mens svært nyttig, er begrensningene til disse metodene omfatter lav kvantitativ nøyaktighet, kort lese lengde, og lav prøvekapasitet. For å møte disse begrensningene vi utviklet en metode vi har kalt Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS) 16. Målet med denne fremgangsmåte er å være i stand til å analysere target genomiske regioner av interesse i et stort antall prøver med kvantitativ nøyaktighet.
BSAS bruker elementer av eksisterende metoder (bisulfite konvertering og regionspesifikk PCR forsterkning) og kombinerer dem med enkle neste generasjons bibliotek konstruksjon (transposome-mediert) 17 og stasjonære maskiner NGS 18 (figur 1). Denne tilnærmingen gir for en mer kvantitativ og høyere gjennomstrømning metode for å undersøke cytosin metylering i en region av interesse. Her presenterer vimetode i detalj og beskrive framgangsmåter for feilsøking og kvalitet sjekke BSAS prosessen.
BSAS åpner for fokusert, nøyaktig DNA metylering kvantifisering med høy gjennomstrømning evner i både antall prøver og antall mål. I tillegg gir denne bibliotek generering med transposome-mediert tagmentation krever mindre inngangs DNA, er raskere og inneholder færre trinn enn tradisjonelle skjær og påfølgende adapterligeringsteknikker. Disse forbedringer over eksisterende metoder tillater presis bass-nivå DNA metylering analyse av noen mål av interesse. Dessuten gir BSAS en ny metode for bekreftelse av regioner av interesse (differensielt metylering regioner (DMRs), CpG øyer, regulatoriske regioner) som har blitt identifisert ved hjelp av hele genomet bisulfitt 22 eller fange 23 tilnærminger. Ved hjelp av ortogonale bekreftelse tilnærminger og mer kvantitativt presise metoder forbedrer analytisk rigor av epigenomic studier. Den høye lese dybde oppnås med BSAS åpner for nøyaktig kvantifisering i en smal konfidensintervall, reværender i presis kvantifisering 16. I tillegg kan evnen til å kjøre mange prøver i et enkelt eksperiment øke utvalgsstørrelsen for bekreftelser av hele genomet metoder, som vil øke den statistiske styrken; en svakhet ved mange av dagens epigenetiske studier. Viktigere, gir BSAS en base spesifikke CpG metylering kvantifisering, som gir mulighet for generering av testbare hypoteser for epigenetisk forskning. Hypoteser som økt metylering ved en bestemt responselement vil resultere i minsket binding av et spesifikt transkripsjonsfaktor. BSAS, kombinert med sammenkoblede mRNA-ekspresjon data, tilveiebringer en fremgangsmåte for å oppnå både epigenetisk regulering og mRNA-ekspresjon i et enkelt stykke vev eller cellepopulasjon. Sammenkoblede målinger av regulering og uttrykk også øke den vitenskapelige rigor og virkningen av funnene.
Kritiske trinn innenfor BSAS protokollen inkluderer primer design, amplicon optimalisering, og bibliotek generasjon /QC. PCR skjevhet introduseres hvis primere ikke er utformet på riktig måte og forsterke på ulike effektivitet 8. Bruken av metylering standarder, for eksempel enzymatisk generert 100% og 0% cytosin denaturert standarder, kan anvendes for å bestemme grad, om noen, av metylering kvantifisering forspenning, og det er en skikkelig metodekontroll ved kvantifisering av 16 metylering. Likeledes bør man være forsiktig når optimalisere PCR reaksjoner for å generere en enkelt høy kvalitet amplicon. Hvis ingen amplicon er til stede ved bruk av de foreslåtte retningslinjene beskrevet i protokollen, optimalisering skritt inkluderer økende PCR syklus tall eller bsDNA innspill beløp. Hvis det er flere PCR-produkter, inkludert primer-dimerer, optimaliseringstrinn omfatter avtagende bsDNA inngangs beløp, redusere den PCR-primer molare inngangs konsentrasjoner, øker varmebehandlingstemperaturer, eller redusere PCR-syklusnummer. En eller en kombinasjon av disse optimaliseringsprosedyrer gir tilstrekkelige resultater for å generere en enkelt high-kvalitet amplicon. Alternativt omstrukturere primere er en god tilnærming for primersettene som ikke gir en eneste amplicon. For de regionene der redesign er ikke egnet eller mulig, utarte primersettene inkludert både cytosin og tymin er på CpG områder i termin primere og adenin-tallet og guanin er på CpG steder i revers primere kan fungere. Men disse primersettene trenger ytterligere optimalisering for å sikre at ikke noe PCR skjevhet oppstår, en prosess utenfor omfanget av denne protokoll. Kvalitet biblioteker er svært viktig for å lykkes. Sikre at QC tiltak gjennomføres for å bestemme størrelse, kvalitet og kvantitet av biblioteker før sekvensering. Sekvenseringsreaksjoner er utsatt for svikt med input av lav kvalitet-biblioteker. Skjevhet i metylering kvantifisering kan reduseres ved å sikre at metylering frekvenser er til stede i både forover og bakover sekvense leser. I tillegg bør kvalitetspoeng av baser samkjøre til CpG områder være ≥Q30 for høy confidence i kvantifisering. Mens andre har vist tidligere lite til ingen skjevhet i tagmentation reaksjoner av bisulfite konverterte DNA 19, som sikrer de beregninger som er beskrevet ovenfor åpner for bekreftelse av lav skjevhet metylering kvantifisering.
BSAS måler tiden metylering på CpG områder vil imidlertid fremtidige utvidelser av denne metoden tillater målinger av parede CpG 5-HMC med tillegg av eksperimentelle fremgangsmåten for å skjelne mellom fem-mC og 5-HMC for eksempel innføring av kalium-perrutenat før bisulfitt omdannelse 24. Dette vil øke effekten av BSAS verktøyet ved å tillate for paret metylering, både 5-MC og 5-HMC, og uttrykk data for å bestemme genuttrykk regulatoriske roller DNA metylering. Transposome-mediert bibliotek fremstilling av PCR-amplikoner resulterer i redusert sekvense dybde ved endene av amplifiserte områder. Derfor bør regioner av høy interesse være utformet for å ligge i midten av amplikoner. Hvordangang, fordi BSAS genererer sekvense les dybder på> 1000 X, kvantitativ nøyaktighet på 5-mC målinger i nærheten av endene av amplifiserte områder forblir høy.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Colleen Van Kirk for mouse retina and cerebellum samples, and Peter Gregory for figure generation. The authors also thank Dr. Allison Gillaspy and the Laboratory for Molecular Biology and Cytometry Research core for access to the MiSeq. This work was supported by NIH grants DA029405, EY021716, and AG026607 and the Donald W. Reynolds Foundation.
Name | Company | Cat # | Comments |
Agilent 2100 Bioanlyzer | Agilent | G29393AA | |
Agilent RNA 6000 Nano kit | Agilent | 5067-1511 | |
Agilent High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Typhoon 9200 | Amersham/GE Healthcare Life Sciences | ||
Agencourt AMPure XP – PCR Purification | Beckman Coulter | A63880 | 5 mL |
PowerPac Basic Power Supply | Bio Rad | 164-5050 | |
twin.tech PCR plate 96 | Eppendorf | 951020362 | semi-skirted |
Heatsealing Film | Eppendorf | 0030127838 | |
Heatsealing Foil | Eppendorf | 0030127854 | |
Heat Sealer | Eppendorf | 5390000.024 | |
0.1-10ul Tips | Eppendorf | 0030073.002 | |
2-200ul Tips | Eppendorf | 0030073.045 | |
50-1000ul Tips | Eppendorf | 0030073.100 | |
MixMate | Eppendorf | 5353000.014 | |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 0030121.023 | |
Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424000.010 | |
2.0 mL Microcentrifuge Tube | Eppendorf | 022363352 | |
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | 24 rxn |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | 24 indexes |
MiSeq Desktop Sequencer | Illumina | ||
MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2002 | 300cycle |
KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4824 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | |
Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit | Life Technologies | R11490 | |
ProFlex 96-well PCR system | Life Technologies | 4484075 | |
Novex 6% TBE DNA gel | Life Technologies | EC6261BOX | 10-well |
Novex TBE Running Buffer | Life Technologies | LC6675 | 5X (1 L) |
Novex Hi-Density TBE Sample Buffer | Life Technologies | LC6678 | 5X (10 mL) |
1 Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787-018 | |
Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | |
UltraPure 10mg/mL Ethidium Bromide | Life Technologies | 15585-011 | |
7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 | 384well block |
DynaMag-96 Side Skirted | Life Technologies | 12027 | |
SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices/VWR | 89429-532 | |
AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
Stainless Steel Beads | Qiagen | 69989 | 5 mm |
CLC Genomics Workbench | Qiagen | Software for methylation pipeline | |
QIAQuick PCR Purification kit | Qiagen | 28104 | 50 rxn |
TissueLyser II | Retsch/Qiagen | 85300 | |
Nuclease-Free Water | Sigma | W4502 | |
TRIS hydrochloride | Sigma | PHG0002-100G | |
Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
384-well Full-Skirted Plate, Standard | Thermo Scientific | AB-1384 | |
Absolute qPCR Seal | Thermo Scientific | AB-1170 | |
EZ DNA Methylation-Lightning kit | Zymo Research | D5030 | 50 rxn |
ZymoTaq DNA Polymerase | Zymo Research | E2001 | 50 rxn |