Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.
The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.
Det har været over et halvt århundrede siden den første rapport af naturligt forekommende DNA ændringer i form af cytosin methylering 1. Cytosin-methylering er en modificeret cytosin nukleotidbase, hvor 5 th carbon på basen ring har en methylgruppe (5-MC), hyppigst forekommende i CpG-dinukleotidet motiv i mammale genomer. Den funktionelle nærvær af 5-MC i genpromotorer er generelt forbundet med transkriptionel repression, medens fravær er forbundet med transkriptionel aktivitet 2.
Enorme fremskridt er blevet gjort i vores forståelse af den rolle, DNA methylering i udvikling 3, transgeneration formering af epigenetiske profiler 4, kræft patogenese 5,6, og en række andre forskningsområder. Mange af disse fremskridt er kommet i de sidste par år som nye metoder er blevet udviklet til profil DNA methylering 7. Med fremkomsten ogpopularisering af næste generation sekventering (NGS) teknikker er der nu en række metoder til at profilere DNA methylering i en hel genom eller store områder af et genom 8. Disse metoder åbner mulighed for opdagelse undersøgelser, der kvantificerer DNA-methylering mønstre og forskelle i DNA-methylering. Ud over disse hypotese-genererende fremgangsmåder, der er et væsentligt behov for målrettet / hypotesetestning DNA-methylering kvantificeringsfremgangsmåder.
Pyrosequencing, methylering specifik PCR og direkte Sanger sekventering af bisulfit konverterede DNA har været de mest anvendte metoder til analyse af målrettede regioner (dvs. en promotor region af et enkelt gen eller en CpG ø) 9-12. Alle disse metoder er afhængige af omdannelse med bisulfit, en kemisk Deamineringsreaktionen hvor methylerede cytosin s omdannes til uracil s, mens methylerede cytosin s forbliver intakt 13,14. PCR-amplifikation af bisulfite-konverterede DNA resulterer i udskiftning af uracil er med thymin 15 tillader differential methylering at læse som en base forskel. Mens meget nyttig, de begrænsninger af disse metoder omfatter lav kvantitativ nøjagtighed, kort læse længde, og lav prøve gennemløb. For at løse disse begrænsninger vi udviklet en metode, vi har kaldt Bisulfite Amplicon sekventering (BSAS) 16. Målet med denne fremgangsmåde er at være i stand til at analysere target genomiske regioner af interesse i et stort antal prøver med høj kvantitativ nøjagtighed.
BSAS bruger elementer af eksisterende metoder (bisulfit konvertering og region-specifik PCR forstærkning) og kombinerer dem med enkle næste generation bibliotek konstruktion (transposome-medieret) 17 og stationære NGS 18 (figur 1). Denne fremgangsmåde giver en mere kvantitativ og højere throughput metode til at undersøge cytosin methylering i en region af interesse. Her præsenterer vi detmetode i detaljer og beskrive metoder til fejlfinding og kvalitet kontrollere BSAS processen.
BSAS muliggør fokuseret, præcis DNA methylering kvantificering med højt gennemløb kapaciteter i både antallet af prøver og antallet af mål. Derudover dette bibliotek generation hjælp transposome-medieret tagmentation kræver mindre input DNA, hurtigere og indeholder færre trin end traditionel udskæring og efterfølgende adapter ligeringsteknikker. Disse forbedringer i forhold til eksisterende metoder giver mulighed for præcis bas-niveau DNA methylering analysere ethvert mål af interesse. Desuden BSAS giver en ny metode til bekræftelse af områder af interesse (differentielt methylering regioner (DMRs), CpG øer, regulatoriske regioner), der er identificeret ved hjælp af hele genomet bisulfit 22 eller fange 23 tilgange. Brug af ortogonale bekræftelse fremgangsmåder og mere kvantitativt præcise metoder forbedrer analytiske stringens af epigenomic studier. Den høje read dybde opnås med BSAS muliggør nøjagtig kvantificering i en smal konfidensinterval, resulting i præcis kvantificering 16. Derudover kan evnen til at køre mange prøver i et enkelt forsøg forøge stikprøvestørrelsen for bekræftelser af hele genomet metoder, hvilket vil øge den statistiske effekt; en svaghed i mange nuværende epigenetiske studier. Vigtigere er det, BSAS giver en base-specifik CpG methylering kvantificering, som giver mulighed for dannelse af testbare hypoteser for epigenetisk forskning. Hypoteser såsom øget methylering på en bestemt reaktion element vil resultere i nedsat binding af en transkriptionsfaktor. BSAS kombineret med parrede mRNA-ekspression data, tilvejebringer en fremgangsmåde til opnåelse af både epigenetisk regulering og mRNA-ekspression i et enkelt stykke af væv eller cellepopulation. Forbundne målinger af regulering og udtryk også øge videnskabelig stringens og virkningen af resultaterne.
Kritiske skridt i BSAS protokollen omfatter primer design, amplikon optimering og bibliotek generation /QC. PCR bias introduceret, hvis primere ikke er udformet korrekt og forstærke på forskellige effektivitetsgevinster 8. Anvendelsen af methylering standarder, såsom enzymatisk genererede 100% og 0% cytosin methylerede standarder, kan anvendes til at bestemme graden, om nogen, af methylering kvantificering bias, og er en ordentlig metodisk kontrol ved kvantificering methylering 16. Ligeledes bør der udvises forsigtighed, når du optimerer PCR-reaktioner til frembringelse af et enkelt høj kvalitet amplikon. Hvis der ikke amplikon er til stede ved anvendelse af de foreslåede retningslinjer er beskrevet i protokollen, optimering skridt omfatter stigende PCR-cyklus numre eller bsDNA input beløb. Hvis der er flere PCR-produkter, herunder primer-dimerer, optimering trin omfatter faldende bsDNA input beløb, faldende PCR-primeren molære input koncentrationer stigende udglødningstemperaturer eller faldende PCR-cyklus nummer. En eller en kombination af disse optimeringsprocedurer giver tilstrækkelige resultater til at generere en enkelt high-kvalitet amplicon. Alternativt redesigne primere er en god tilgang til primersæt, der ikke giver et enkelt amplikon. For de regioner, hvor redesign ikke er egnet eller mulig, degenerere primersæt herunder både cytosin-og thymin er på CpG steder i forward primere og adenin-og guanin er på CpG steder i reverse primere kan arbejde. Men disse primersæt kræve yderligere optimering at sikre, at ingen PCR bias opstår, en proces uden for denne protokol. Kvalitet biblioteker er ekstremt vigtigt for succes. Sørg for, at QC foranstaltninger gennemføres for at bestemme størrelse, kvaliteten og mængden af bibliotekerne før sekventering. Sekventeringsreaktioner er tilbøjelige til svigt med input af lav kvalitet biblioteker. Bias i methylering kvantificering kan afbødes ved at sikre, methylering frekvenser er til stede i både frem og bak sekventering læser. Derudover bør kvalitet snesevis af baser der tilpasser til CpG sites være ≥Q30 for høj confidence i kvantificering. Mens andre har tidligere vist lidt at ingen bias i tagmentation reaktioner af bisulfit konverterede DNA 19, sikrer de målinger, der er beskrevet ovenfor giver mulighed for bekræftelse af lav partiskhed methylering kvantificering.
BSAS øjeblikket måler methylering på CpG sites vil imidlertid fremtidige udvidelser af denne fremgangsmåde tillader Forbundne målinger af CpG 5-HMC med tilsætning af eksperimentelle trin sondres mellem 5-MC og 5-HMC såsom indførelse af kalium perruthenat før omdannelse med bisulfit 24. Det vil øge effekten af BSAS nytte ved at tillade parret methylering, både 5-MC og 5-HMC, og udtryk data for at fastslå roller DNA methylering genekspression regulering. Transposome-medieret fremstilling af PCR amplikoner bibliotek ikke resultere i nedsat sekventering dybde ved enderne af amplificerede regioner. Derfor bør regioner med høj interesse være designet til at opholde sig i midten af amplikoner. Hvordannogensinde, fordi BSAS genererer sekventering læse dybder> 1000 X, den kvantitative nøjagtighed af 5-MC målinger nær enderne af amplificerede regioner fortsat høj.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Colleen Van Kirk for mouse retina and cerebellum samples, and Peter Gregory for figure generation. The authors also thank Dr. Allison Gillaspy and the Laboratory for Molecular Biology and Cytometry Research core for access to the MiSeq. This work was supported by NIH grants DA029405, EY021716, and AG026607 and the Donald W. Reynolds Foundation.
Name | Company | Cat # | Comments |
Agilent 2100 Bioanlyzer | Agilent | G29393AA | |
Agilent RNA 6000 Nano kit | Agilent | 5067-1511 | |
Agilent High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Typhoon 9200 | Amersham/GE Healthcare Life Sciences | ||
Agencourt AMPure XP – PCR Purification | Beckman Coulter | A63880 | 5 mL |
PowerPac Basic Power Supply | Bio Rad | 164-5050 | |
twin.tech PCR plate 96 | Eppendorf | 951020362 | semi-skirted |
Heatsealing Film | Eppendorf | 0030127838 | |
Heatsealing Foil | Eppendorf | 0030127854 | |
Heat Sealer | Eppendorf | 5390000.024 | |
0.1-10ul Tips | Eppendorf | 0030073.002 | |
2-200ul Tips | Eppendorf | 0030073.045 | |
50-1000ul Tips | Eppendorf | 0030073.100 | |
MixMate | Eppendorf | 5353000.014 | |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 0030121.023 | |
Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424000.010 | |
2.0 mL Microcentrifuge Tube | Eppendorf | 022363352 | |
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | 24 rxn |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | 24 indexes |
MiSeq Desktop Sequencer | Illumina | ||
MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2002 | 300cycle |
KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4824 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | |
Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit | Life Technologies | R11490 | |
ProFlex 96-well PCR system | Life Technologies | 4484075 | |
Novex 6% TBE DNA gel | Life Technologies | EC6261BOX | 10-well |
Novex TBE Running Buffer | Life Technologies | LC6675 | 5X (1 L) |
Novex Hi-Density TBE Sample Buffer | Life Technologies | LC6678 | 5X (10 mL) |
1 Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787-018 | |
Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | |
UltraPure 10mg/mL Ethidium Bromide | Life Technologies | 15585-011 | |
7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 | 384well block |
DynaMag-96 Side Skirted | Life Technologies | 12027 | |
SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices/VWR | 89429-532 | |
AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
Stainless Steel Beads | Qiagen | 69989 | 5 mm |
CLC Genomics Workbench | Qiagen | Software for methylation pipeline | |
QIAQuick PCR Purification kit | Qiagen | 28104 | 50 rxn |
TissueLyser II | Retsch/Qiagen | 85300 | |
Nuclease-Free Water | Sigma | W4502 | |
TRIS hydrochloride | Sigma | PHG0002-100G | |
Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
384-well Full-Skirted Plate, Standard | Thermo Scientific | AB-1384 | |
Absolute qPCR Seal | Thermo Scientific | AB-1170 | |
EZ DNA Methylation-Lightning kit | Zymo Research | D5030 | 50 rxn |
ZymoTaq DNA Polymerase | Zymo Research | E2001 | 50 rxn |