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Semi-Alto rendimiento para Screening Potencial Sequía-tolerancia en lechuga ( doi: 10.3791/52492 Published: April 17, 2015

Protocol

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1. La plantación

  1. Rellene charolas (128 células; 28 x 54 cm con células 3 cm cuadrados y 5 cm de profundidad) con mezcla de tierra del enchufe. Para ayudar en el llenado uniforme de células comprimir suelo en cada bandeja utilizando una charola vacía.
  2. Semillas de lechuga Planta de ¼ de pulgada de profundidad 2-3 semillas por celda. Planta de todas las líneas experimentales en bandejas replicados para proporcionar tanto una sequía estresado y bandejas de control para el proceso de sequía.
  3. Coloque charolas en una bandeja de base y sin agujeros.
  4. Bandejas de agua y cubierta con bandeja invertida o cúpula de plástico. La germinación ocurre normalmente en 48 a 72 h. Después de la germinación retire la tapa y mover las bandejas en invernadero.
    NOTA: Este protocolo también se podría realizar en cámaras de crecimiento.

2. Crecimiento y Cuidado de las plantas

  1. Bandejas de agua según sea necesario 1-4 semanas después de la germinación, normalmente esto es 2-3 veces a la semana, llenando la bandeja inferior y permitiendo que el suelo se sature (~ 1 h) los rayos de sentarse durante largos periodoss en el agua, ya que esto puede influir negativamente en la salud de la planta y desarrollo de las raíces y pueden afectar a la pantalla de la sequía.
  2. Fertilizar bandejas una vez por semana con una soluble 20-20-20 fertilizante comercial mezclado en una proporción de 1,5 cucharadita / gal.
  3. Bandejas delgadas a una planta por celulares 1-2 semanas después de la germinación.

3. Inicio del Estrés por Sequía

  1. Cuando las plantas de cuatro semanas de edad bandejas separadas en 2 grupos. Asunto un grupo a un grave estrés hídrico. Utilice las otras bandejas como controles bien regados. Regar el grupo de control como en el paso 2.1 durante todo el experimento. En la iniciación del estrés por sequía suspend fertilizar todas las bandejas para el resto del experimento.
  2. El período de sequía experimental se produce más de una semana. En el día inicial de la prueba de estrés por sequía (Día 0) llenar todas las bandejas inferiores con agua y deje que el suelo en las charolas para convertirse totalmente saturado y escurrir el agua de las bandejas. Saturar el suelo inmediatamente antes de la iniciación de la tél período de estrés le ayudará a minimizar cualquier variación en la humedad del suelo entre las células individuales en las charolas.

4. Realización de la pantalla El estrés básico Sequía con parámetros que deben medirse

NOTA: Los siguientes pasos describen cómo recolectar las tres mediciones fisiológicas que se registrarán en el transcurso de la pantalla de la sequía y el Cuadro 1 se presenta un calendario de las medidas tomadas en cada día del período de prueba sequía estrés.

  1. Mida la Hoja contenido relativo de agua (CRA) en los días 0, 2, 4 del juicio.
    1. Clip una planta de lechuga de la bandeja y retire 2 hojas.
    2. Perforar 3 discos de cada hoja utilizando un perforador de corcho # 9 (~ 1.6 cm de diámetro). Combine golpes de hojas como una muestra.
    3. Pesar los discos de hojas, este es el valor de peso fresco (FW) utilizado para el cálculo RWC, a continuación, colocar los discos en una placa de petri.
    4. Agregar suficiente agua destilada a la placa para todosujo de todos los discos de hoja floten. Esto es para hidratar por completo los discos de hojas para recoger los pesos turgentes para el análisis RWC. Permita que los discos de hoja flotar durante 24 horas a temperatura ambiente.
    5. Retire los discos de hoja ahora completamente hidratadas de las placas y secar suavemente el exterior de los discos de hojas con toallas de papel antes de pesar los discos. Anote estos pesos como peso turgente (TW) para el cálculo de la RWC.
    6. Discos Coloque la hoja en un laboratorio de papel limpie o disco de papel de filtro en una placa de Petri abierta y seca en estufa a 55 ° C durante 24 horas.
      NOTA: El papel evita que los discos de hoja se adhiera a la placa de Petri durante el secado.
    7. Pesar discos de hojas secas y grabar pesos secos (DW) para el cálculo de la RWC.
    8. Calcula la RWC con la fórmula de Weatherley como se describe por Smart y Bingham 11,12.
      RWC = (FW-DW / TW-DW) * 100
      FW = peso fresco, TW = peso turgente, DW = peso seco
    9. Repita el paso 4.1 para cada germoplasma y tratamiento en el ensayo.
  2. Registre la planta se marchitan principio una vez al día en el día 1 del ensayo de estrés por sequía y termina cuando el 100% de las plantas se marchitó, normalmente el día 4 o 5.
  3. Fase de recuperación y diferencial de crecimiento
    1. El día 6, la conclusión del período de sequía, el estrés y las plantas estresadas entran en la fase de recuperación del juicio. Llenar las bandejas inferiores con agua y permitir que las bandejas de afectados por la sequía en remojo durante 24 horas antes de reanudar el programa de riego estándar, paso 2.1, como las bandejas de control.
    2. Permitir que todas las plantas se recuperen durante 10 días.
    3. A los 10 días después de la sequía de estrés cosechar la totalidad encima de la parte de tierra de cada planta, y registrar el peso fresco.

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Representative Results

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Al realizar una gran pantalla con el fin de segregar una población por el rasgo deseado experimental, en el caso de este protocolo de respuesta a la sequía estrés, los datos generados serán correspondientemente variar desde muy subrayan susceptibles a probable tolerantes a la sequía y todos los puntos intermedios. Figura 1 contiene gráficos que representan el tipo de resultados que se pueden esperar de este protocolo. Cultivares representativos de tres tipos de lechuga diferentes (Romaine (CoS), arrepolladas, y butterhead) están incluidos en los datos mostrados. Si bien los datos que representan sólo tres tipos de lechuga se muestran aquí este protocolo fue desarrollado durante la proyección de miles de lechuga y espinaca germoplasma en la mayoría de los tipos. Además de los tres tipos de lechuga se mencionó anteriormente este protocolo se utilizó con éxito para detectar la hoja roja y verde y tallo tipo lechuga junto con germoplasma de las especies de Lactuca serriola estrechamente relacionadas, así como la no relacionada leafy espinacas vegetal verde. Los autores utilizaron datos generados usando este protocolo para reducir una colección lechuga de más de 4.000 a un grupo de candidatos de 200 variedades de lechuga para ensayos de campo.

Figura 1
Figura 1. Resultados representante Los datos mostrados son representativos de las tres mediciones fisiológicas incluidos en este protocolo para tres tipos de lechuga romana, incluyendo (cos, ROM), crisphead (CRSP), y mantecosa (BUT). (A) El porcentaje de plantas que se marchita en cada día del período de sequía de estrés de la prueba, a partir del día 1, se registra hasta que todas las plantas alcanzan el 100% se marchitó. (B) Hoja contenido relativo de agua se mide en los días 0, 2 y 4. -D : la sequía de estrés, -C:. de control (C) Peso de las plantas después de período de sequía, el estrés y la recuperación de 10 días muestran diferencial de crecimiento debido a lasequía estrés. Las barras de error representan la desviación estándar. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. bandejas representativos y ejemplos de plantar diagramas (A y B) bandejas Ejemplo muestran la respuesta a la sequía de estrés en el día 3 de un ensayo utilizando este protocolo, en comparación con las bandejas de control. (C y D) Estos diagramas bandeja representan las charolas de 128 empleados que muestran dos métodos de siembra utilizados en este protocolo. Los bordes exteriores de las bandejas (gris celdas sombreadas) se deben plantar, pero no se utilizan para las muestras experimentales, debido a la propensión de las células de borde para secar más rápidamente que las células interiores.

Día 0 1 2 3 4 5 6
RWC-FW X X X
Wilt X X X X (X) (X)
Retener el agua X
Reanudar riego X

Tabla 1. Calendario de período de sequía de estrés. El agua se retiene de lo experimentalbandejas que comienzan el día 0 del ensayo y de riego se reanuda el día 6. Las muestras frescas para las mediciones de contenido relativo de agua de la hoja se toman en los días 0, 2, 4, y el porcentaje de plantas marchitas se registran diariamente comenzando el día 1 y continuando hasta 100 % de las plantas se marchitó, normalmente día 4, pero puede extenderse a los días 5 o incluso 6.

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Discussion

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Consideraciones de número de la muestra para la pantalla.

El número de muestras necesarias debe basarse en el uso deseado de los datos desde esta pantalla. Si se desean resultados de calidad publicación se recomienda para cosechar 3 plantas individuales (3 réplicas biológicas) de cada línea y realizar un mínimo de 2 réplicas experimentales para dar puntos adecuados para el análisis estadístico de la calidad. Si el resultado deseado es simplemente para reducir rápidamente una gran reserva de germoplasma candidato con el fin de realizar más rigurosas o complejos experimentos de escasez de agua, menos muestras y réplicas o pueden ser necesarios. El número de muestras requeridas debe decidirse en el momento de la siembra.

Diseño de plantación y las consideraciones de secado del suelo en las bandejas.

Una consideración muy importante es que el suelo en las células en el borde de la bandeja de enchufe se secará más rápidamente que las células y los cuidados interioresse deben tomar para evitar el sesgo en los resultados de la cosecha de plantas sólo desde el interior de la bandeja (Figura 2). Sólo la cosecha de plantas de las células interiores probablemente influir en el diseño de plantación de la bandeja. Durante la pantalla en la que se desarrolló este protocolo entre el 3 y el 6 de germoplasma único fue plantado por charola junto con un cultivar lechuga control. Uno de los retos de la detección de la tolerancia a la sequía en un cultivo de especialidad es a menudo no existe el estrés know germoplasma tolerante o susceptibles de utilizar como controles positivos o negativos. Cuando no hay control positivo o negativo está disponible como en el desarrollo de este protocolo el uso de un germoplasma estándar a través de todos los ensayos permite un nivel básico de control interno para la variabilidad de las condiciones a lo largo de cada pantalla. El número de diferentes germoplasma que se pueden plantar contribuirá directamente a la velocidad a la que una colección de germoplasma puede apantallar, pero está limitado por el número de plantas necesario para eacmedición h tomada durante el curso del juicio. Al limitar el número de germoplasma único en cada bandeja a entre 3 y 6 todos lechuga se pueden plantar en dos lugares dentro de cada bandeja de asegurar que no lechuga se planta en sólo las células exteriores. Otra consideración es que la variabilidad en la tasa de crecimiento y el tamaño de la planta entre germoplasma puede conducir a un tipo reducido del secado del suelo en las células que contienen pequeñas variedades. Esto podría sesgar los resultados en la dirección de pequeñas variedades son más representado entre el potencial de germoplasma tolerante a la sequía sacado de esta pantalla, pero esto no parece ser el caso con base en los resultados observados. Además, el uso de metodologías secundarias rigurosas para estudiar el germoplasma candidato de este protocolo debe confirmar o refutar estos resultados.

La importancia de la coherencia en la observación de la marchitez.

El seguimiento de las plantas para la marchitez se debe realizar en el mismotiempo diario para evitar pequeñas fluctuaciones en la aparición del estrés de la planta, observó como la marchitez, probablemente causado por las fluctuaciones de temperatura y humedad presentes en un invernadero, así como la regulación circadiana de los estomas. También, asegúrese de ser coherente cuando se calificaron como plantas marchitas o no. El establecimiento de un conjunto de directrices en la marchitez de puntuación es especialmente importante si varias personas se presentará la pantalla para asegurar resultados consistentes. El umbral utilizado para este protocolo es todas las hojas de la planta deben estar marchitas para anotar la planta como se marchita.

Selección de los parámetros a medir.

Los parámetros medidos en este protocolo se eligieron en función de su utilidad en la identificación de la escasez de agua, junto con la capacidad de adaptación de las medidas a un sistema semi-alto rendimiento que utiliza mano de obra mínima disponible. Muchas otras medidas pueden ser muy útiles en la identificación de la sequía de estrés (por ejemplo., La actividad fotosintética, Crecimiento de la raíz, la conductancia estomática ...), y en base a la naturaleza de la pantalla que se va a realizar (es decir, el número de germoplasma utilizado, el número de repeticiones, la tasa de rendimiento deseada ...) otros parámetros pueden ser fácilmente incorporadas en esta pantalla.

Los comentarios sobre el uso de los resultados del protocolo.

Las colecciones del USDA contiene más de 4.000 germoplasma lechuga individuo que es un número que hace pruebas de campo que incorporan todo el germoplasma poco práctico. Este protocolo fue desarrollado con el propósito único de permitir que un número muy reducido de investigadores (1-2 personas) para detectar las colecciones del USDA para potencial tolerancia a la sequía. Mediante el uso de estos métodos de la colección USDA se redujo a 200 variedades que se utilizaron a continuación en ensayos de campo que pueden replicar más estrechamente las condiciones de sequía de estrés. Este protocolo también se utiliza para reducir una población de más de 400 germoplasma espinacas a 40 para su uso en campo trials. Este protocolo por sí sola no debe considerarse suficiente para identificar con un alto grado de certeza de que el germoplasma contiene duradera tolerancia a la sequía en virtud de las condiciones del campo de escasez de agua, sino que simplemente puede servir como una herramienta para cribar rápidamente para el potencial de tolerancia al estrés en condiciones de déficit de agua en un pantalla rápida y eficiente la utilización de un gran número de germoplasma.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
plug tray 128 T.O. Plastics
Hummert International
11-8595-1 Any brand plug tray will work, but use the same style of trays for all trials.
lower tray (Display tray) T.O. Plastics
Hummert International
11-3305-1
plug/planting mix (Sunshine Mix #5) Sunshine
Hummert International
10-0467-1 A different mix may need to be substituted if adapting this protocol to a different crop.  Sunshine mix #4 was used in spinach trials.
fertilizer (20-20-20) Jack's: Professional water-soluble fertilizer
Hummert International
07-5915-1 Any fertilizer can be used, adjust type as needed for adapting this protocol to specific crop needs.

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References

  1. Dijk, A. I. J. M., et al. The Millennium Drought in southeast Australia (2001–2009): Natural and human causes and implications for water resources, ecosystems, economy, and society. Water Resour. Res. 49, (2013).
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Semi-Alto rendimiento para Screening Potencial Sequía-tolerancia en lechuga (<em&gt; Lactuca sativa</em&gt;) colecciones de germoplasma
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Knepper, C., Mou, B. Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce (Lactuca sativa) Germplasm Collections. J. Vis. Exp. (98), e52492, doi:10.3791/52492 (2015).More

Knepper, C., Mou, B. Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce (Lactuca sativa) Germplasm Collections. J. Vis. Exp. (98), e52492, doi:10.3791/52492 (2015).

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